ARTICLE
Les endothélines représentent une famille
de peptides de 21 acides aminés comprenant au moins trois isoformes
: l'endothéline 1 (ET1), l'endothéline 2 (ET2) et l'endothéline
3 (ET3). Initialement décrites pour leurs propriétés
vasoactives, on leur attribue aujourd'hui des fonctions variées
dans de nombreux organes dont l'utérus. Chez les mammifères,
les réponses biologiques induites par les endothélines sont
relayées par deux types de récepteurs à sept domaines
transmembranaires : le récepteur ETA qui lie préférentiellement
ET1 et ET2 et le récepteur ETB qui présente une
affinité équivalente pour les trois peptides [cf. pour revue
: 1]. Ces deux types de récepteurs (ETA et ETB)
coexistent dans le myomètre humain, tunique musculaire lisse de
l'utérus, mais seuls les récepteurs ETA, majoritairement
représentés, sont fonctionnels en termes de contractilité
utérine [2-4]. À ce rôle important d'agent utérotonique,
s'ajoute un effet à long terme de ET1 sur la prolifération
des cellules myométriales humaines en culture [5]. Ce pouvoir mitogène
de ET1 nous a conduits à rechercher la présence de récepteurs
des endothélines dans une pathologie tumorale bénigne de
l'utérus, le léiomyome [6].
Ces tumeurs d'origine mésenchymateuse sont très répandues
puisqu'elles concernent une femme sur trois en période d'activité
génitale. Les connaissances concernant l'étiologie, le potentiel
évolutif et le risque de récidive des léiomyomes
sont quasi inexistantes. L'origine monoclonale des léiomyomes utérins
a pu être démontrée dans un grand nombre de cas. On
sait aussi que toute une série de mutations somatiques sont impliquées.
Elles contribuent non seulement à l'initiation de la tumeur mais
aussi à son développement ultérieur. Cela n'exclut
pas que la croissance tumorale dépende également de l'action
de facteurs de croissance et des hormones stéroïdes [cf. pour
revue : 7]. L'implication des œstrogènes dans la croissance
des léiomyomes est connue depuis longtemps. Il semblerait que l'effet
mitotique des œstrogènes soit relayé par la production
locale de facteurs de croissance tel EGF (epidermal growth factor)
dont on sait qu'ils sont surexprimés dans les léiomyomes.
Plus récemment, la progestérone a été proposée
comme pouvant jouer un rôle non négligeable dans la croissance
des léiomyomes. Actuellement, la méconnaissance de leurs
mécanismes physiopathologiques fait que les thérapeutiques
appliquées ne sont pas toujours satisfaisantes et sont controversées.
De plus, si ces tumeurs demeurent essentiellement bénignes, l'évaluation
du potentiel évolutif d'une tumeur musculaire lisse est difficile
à apprécier sur les critères morphologiques habituels.
Leur transformation en léiomyosarcomes utérins n'est pas
à sous-estimer [8]. La symptomatologie est similaire, que la tumeur
soit bénigne ou maligne, ce qui rend le diagnostic différentiel
délicat.
Parmi les facteurs de croissance impliqués dans le développement
tumoral et métastasique s'inscrivent maintenant les endothélines.
Des études récentes ont montré que ET1 peut être
synthétisée et sécrétée dans une grande
variété de tumeurs cancéreuses et que les taux plasmatiques
de ET1 et de son précurseur sont significativement plus élevés
chez des patients atteints de cancer primitif d'origine hépatique,
colorectale ou de cancer de la prostate que chez des sujets sains [9].
L'objectif de notre recherche est de préciser si les récepteurs
impliqués dans l'effet prolifératif de ET1 dans les cellules
myométriales humaines en culture sont du même type que ceux
exprimés dans le myomètre dans des conditions tumorales.
L'expression des récepteurs des endothélines dans les léiomyomes
a été étudiée à la fois par amplification
élective in vitro après transcription inverse (RT-PCR)
et par analyse pharmacologique, en termes de liaison au radioligand [125I]ET1.
Résultats
Action de ET1 sur la prolifération des cellules
myométriales
Les cellules myométriales humaines quiescentes
sont incubées en présence de concentrations croissantes
de ET1 (0,1-1 000 nM). On constate sur la figure
1 que ET1 augmente de manière dose-dépendante l'incorporation
de [3H]thymidine (EC50 = 0,45 ± 0,05
nM) (A) ainsi que le nombre de cellules (EC50 = 98,0 ±
7,2 nM) (B). L'effet maximal est observé pour une concentration
de 100 nM. Tandis qu'un antagoniste des récepteurs ETA,
le FR139317, inhibe la synthèse d'ADN induite par ET1 (100 nM),
un antagoniste des récepteurs ETB, l'IRL1038, n'exerce
aucun effet significatif sur l'effet prolifératif induit par ET1
(figure 2). Aucun des
antagonistes testés en l'absence de ET1 ne modifie la croissance
basale des cellules myométriales.
Étude comparative
de l'expression des récepteurs des endothélines dans le
léiomyome et le tissu myométrial sain correspondant
L'étude des transcrits des récepteurs des
endothélines a été réalisée sur un
groupe composé de trois patientes. Après extraction des
ARN totaux, tous les échantillons de léiomyomes et de tissus
myométriaux sains correspondants sont traités au cours de
la même réaction de transcription inverse afin d'obtenir
les six lots d'ADNc dans les mêmes conditions expérimentales.
Les produits de l'amplification élective réalisée
à l'aide de couples d'amorces spécifiques des séquences
des récepteurs ETA et ETB et de la ß2-microglobuline
sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium après
migration électrophorétique. La figure
3 illustre les résultats obtenus avec les échantillons
de léiomyomes provenant des trois patientes étudiées
(lignes 1, 2, 3) et des échantillons de myomètres sains
correspondants (lignes 1', 2', 3'). Après amplification élective
des transcrits des récepteurs ETA, plusieurs fragments
(498, 427 et 299 pb) dont un de la taille attendue (626 pb) sont présents
dans tous les tissus analysés. L'identité de l'ensemble
des fragments amplifiés est vérifiée par hybridation
avec une sonde oligonucléotidique interne spécifique. Pour
le gène des récepteurs ETB, un produit unique
de taille attendue (564 pb) est observé sur le gel d'agarose. On
remarque cependant, par une analyse densitométrique, que le niveau
d'expression des récepteurs ETB est plus faible dans
les trois léiomyomes étudiés en regard des trois
myomètres sains correspondants. Nous avons vérifié
que chaque bande est reconnue par une sonde oligonucléotidique
interne spécifique et qu'aucun signal n'est détecté
en l'absence de transcriptase inverse (résultats non représentés).
L'expression du gène codant pour la ß2-microglobuline ne
varie pas entre le léiomyome et le myomètre sain et l'intensité
du signal est comparable dans tous les échantillons étudiés.
Les préparations membranaires de léiomyomes et de tissu
myométrial sain ont été incubées 1 heure en
présence de concentrations croissantes de [125I]ET1
(3 à 400 pM). Dans ces deux cas, l'expression des résultats
selon la représentation de Scatchard se traduit par l'obtention
d'une droite, caractéristique de la présence d'une seule
classe de sites saturables, pour chacun des échantillons étudiés
(figure 4). L'analyse
de cette représentation indique que le nombre total de sites de
liaison (Bmax) est significativement plus faible dans les léiomyomes
(218 ± 8 fmol/mg protéines) que dans les myomètres
sains appariés (422 ± 49 fmol/mg protéines) (p <
0,05). En revanche, les valeurs des constantes de dissociation à
l'équilibre (Kd) sont comparables dans les léiomyomes (85,5
± 8,4 pM) et dans le tissu myométrial sain (89,0 ± 6,8
pM).
La figure 5 illustre le
déplacement de la liaison de [125I]ET1 par ET1, la sarafotoxine
6c (S6c, agoniste des récepteurs ETB) et le FR139317
(antagoniste des récepteurs ETA). Dans les léiomyomes,
ET1 est aussi efficace (Ki = 1,37 ± 0,09 nM) que le FR139317 (Ki
= 1,42 ± 0,44 nM) pour déplacer la liaison du radioligand
alors que la S6c se révèle totalement inefficace. Dans le
myomètre sain, les valeurs des Ki déterminent l'ordre d'affinité
suivant : ET1 (Ki = 0,21 ± 0,44 nM) = FR139317 (Ki = 0,96 ±
0,33 nM) >>> S6c (Ki = 43,7 ± 13,5 nM). Il faut noter que
75 % des sites liant [125I]ET1 ont une forte affinité
pour l'antagoniste des récepteurs ETA.
Discussion
Notre étude démontre que ET1 exerce une
action proliférative sur les cellules myométriales humaines
en culture. Comparée à l'action mitogène d'autres
facteurs de croissance, son action est plus faible, quoique comparable
à celle décrite pour ET1, dans les cellules musculaires
lisses vasculaires [10]. Le fait que le FR139317, antagoniste sélectif
des récepteurs ETA, inhibe totalement l'incorporation
de [3H] thymidine dans les cellules myométriales indique
que seuls des récepteurs ETA sont impliqués dans
ce processus [5]. L'absence d'effet d'un antagoniste des récepteurs
ETB (IRL1038) permet de confirmer que ces récepteurs
ne participent pas à l'action mitogène de ET1. L'hypothèse
d'une implication de ET1 et de ses récepteurs dans le développement
tumoral et métastatique est maintenant avancée [9]. Pour
cela, nous avons recherché si les récepteurs des endothélines
étaient exprimés dans les léiomyomes utérins.
Notre étude a permis de mettre en évidence par RT-PCR la
présence simultanée des transcrits des gènes des
récepteurs ETA et ETB dans les léiomyomes
ainsi que dans les tissus myométriaux sains correspondants. Toutefois,
plusieurs transcrits des récepteurs ETA sont générés
par épissage alternatif du transcrit primaire dans tous les échantillons
étudiés. En plus du produit correspondant au transcrit du
récepteur ETA complet (626 pb), nous avons observé
trois fragments plus courts de 498 pb, 427 pb et 299 pb correspondant
aux transcrits des récepteurs ETA qui résultent
de l'épissage alternatif de l'exon 3, de l'exon 4 et des exons
3 et 4. Ces transcrits ont été précédemment
décrits dans le poumon [11] et le placenta humain [12]. Les récepteurs
tronqués étant dépourvus de fonctionnalité
en termes de liaison à des ligands, la question concernant une
éventuelle fonction dans les tissus myométriaux reste posée.
En revanche, nous constatons comme Pekonen et al. [13] que les
transcrits des récepteurs ETB sont peu exprimés
dans les léiomyomes en regard des myomètres sains correspondants.
Dans ces tumeurs bénignes, le nombre total de sites de liaison
spécifiques de [125I]ET1 est environ deux fois moindre
que dans le tissu myométrial sain. À l'aide d'agonistes
et d'antagonistes sélectifs des sous-classes de récepteurs,
nous avons montré que les récepteurs ETA prédominent
dans le myomètre sain (75 % de sites totaux). Ces récepteurs
ETA sont fonctionnels en termes de couplage à des événements
post-récepteurs (phospholipase C/Ca2+, protéine
kinase C) [14-16] et en termes de contractilité utérine
[2-4]. Malgré la présence des transcrits des deux types
de récepteurs ETA et ETB dans les léiomyomes,
seuls des récepteurs ETA, fonctionnels en termes de
liaison, sont retrouvés [6]. Cela pourrait suggérer que
l'ARNm codant pour le récepteur ETB n'est pas traduit
en une protéine fonctionnelle dans le léiomyome. Cette absence
de corrélation entre l'expression des transcrits et la présence
de protéines réceptrices fonctionnelles pourrait s'expliquer
par des mécanismes de régulation post-transcriptionnelle.
Il serait intéressant de rechercher si la disparition des sites
de liaison ETB est caractéristique d'un tissu tumoral.
Une étude comparative, incluant des léiomyosarcomes utérins
ainsi qu'une lignée cellulaire de léiomyosarcomes utérins
humains (SK-UT-1B), devrait nous permettre de valider ou d'invalider cette
hypothèse. Peu d'informations sont disponibles concernant l'évolution
et/ou l'involution des léiomyomes. Toutefois, on sait que les hormones
stéroïdes, en particulier les œstrogènes, jouent
un rôle important dans le contrôle du développement
de ces tumeurs. Ces données s'appuient sur la régression
des léiomyomes observée chez des femmes ménopausées
et sur des études décrivant les modifications importantes
des taux d'hormones stéroïdes et de leurs récepteurs
dans les léiomyomes en regard du tissu myométrial sain adjacent
[17]. Une modulation des récepteurs des endothélines par
les hormones stéroïdes a été décrite
dans le myomètre de lapine [18]. En conséquence, on peut
se demander si l'environnement stéroïdien est à l'origine
des modifications d'expression des récepteurs ETB dans
ces tissus cibles stéroïdo-dépendants.
En conclusion, les propriétés « facteur de croissance
» de ET1 nous amènent à envisager pour ce peptide un
rôle important dans le développement tumoral du muscle utérin.
La connaissance précise des mécanismes contrôlant
la prolifération cellulaire est l'étape incontournable pour
proposer de nouvelles cibles pharmacologiques antitumorales.
Matériel et méthodes
Les léiomyomes intramuraux (2 cm de diamètre)
et les échantillons de myomètre sain prélevés
à distance des léiomyomes sont obtenus à la suite
d'hystérectomies pratiquées chez des femmes cyclées
(39-51 ans) en dehors de tout traitement hormonal. Les utérus présentant
une adénomyose sont écartés de cette étude.
La culture cellulaire est réalisée à partir d'explants
myométriaux [19]. À confluence, les cellules myométriales
en culture forment une structure de type hills and valleys et expriment
l'actine alpha musculaire lisse, les chaînes lourdes de la myosine
et la desmine, confirmant ainsi le phénotype musculaire lisse des
cellules en culture. La mise en évidence d'un effet prolifératif
de ET1 (Néosystème, Strasbourg, France) est effectuée
par l'incorporation de [3H] thymidine et par le comptage simultané
des cellules [5]. Afin d'observer une réponse optimale en termes
de multiplication cellulaire, les cellules sont utilisées en phase
proliférative. Elles sont repiquées dans des plaques de
24 puits à la densité de 50 000 cellules/puits et sont maintenues
dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) en présence
de sérum de veau fœtal (SVF) à 10 % pendant 24 heures.
Les cellules en phase exponentielle de croissance sont alors transférées
dans du milieu DMEM sans SVF pendant 72 heures pour atteindre la quiescence.
Les agents à tester sont alors ajoutés pendant 72 heures
dans le cas d'un comptage de cellules ou pendant 48 heures dans le cas
d'une mesure de synthèse d'ADN, la [3H] thymidine étant
ajoutée durant les dernières 24 heures d'incubation.
Les ARN totaux des tissus myométriaux sont isolés à
l'aide d'un kit d'extraction (Trizol, Life Technologies, Inc.) suivant
la méthode de Chomczynski et Sacchi [20]. La présence des
transcrits des gènes des récepteurs ETA et ETB
a été recherchée par amplification élective
in vitro après transcription inverse (RT-PCR) à l'aide
d'amorces spécifiques comme précédemment décrit
[12]. Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse
sur gel d'agarose après coloration au bromure d'éthidium.
Dans le cas du récepteur ETA, les amorces oligonucléotidiques
s'hybrident en position 149-166 sens (5' CCACTCATCAACCCACTA 3') et 757-774
anti-sens
(5' GATGTAAAGGACTGGTGG 3') pour donner un fragment amplifié de
626 paires de bases. Dans le cas du récepteur ETB, les
amorces oligonucléotidiques s'hybrident en position 207-226 sens
(5' GGAGGTGCCTAAAGGAGACA 3') et 751-770 anti-sens (5' TATCTGCGAATCTGCTTGCT
3') pour donner un fragment amplifié de 564 paires de bases. La
validation des produits d'amplification est effectuée par coupure
enzymatique grâce à une endonucléase spécifique
et par hybridation avec une sonde oligonucléotidique interne spécifique
dont la séquence est
5' CCACAGCAGACTAAAAATTAC 3' (récepteur ETA) et 5' GGGAGACCTGCTGCACATCGT
3' (récepteur ETB). Afin de contrôler l'intégrité
des ARN totaux extraits et l'efficacité de la réaction de
transcription inverse, les mêmes lots d'ADNc ont été
utilisés pour rechercher l'expression des transcrits de la protéine
ubiquitaire, la ß2-microglobuline. Les récepteurs des endothélines
ont été caractérisés pharmacologiquement par
des études de liaison avec [125I]ET1 (Amersham International,
Chalfont, Buckinghamshire, UK) décrites précédemment
[14]. Les expériences sont réalisées en incubant
les fractions membranaires myométriales (6 µg de protéines)
à 30 °C pendant 60 min en présence de [125I]ET1
à des concentrations de 3 à 400 pM (conditions de saturation)
ou 30 pM (analyse de compétition). La liaison spécifique
est définie comme étant la différence entre la liaison
totale et la liaison non spécifique déterminée en
présence de 1 µM d'ET1. Les paramètres de liaison sont
analysés par les programmes informatiques Inplot (Graph Pad, Software,
San Diego, CA) et Ligand. Les résultats sont exprimés sous
forme de moyennes ± SE. Les données ont été
testées par analyse de la variance (Anova). La signification est
établie pour p < 0,05.
REFERENCES
1. Rubanyi GM, Polakoff A. Endothelins : molecular biology, biochemistry,
pharmacology, physiology and pathophysiology. Pharmacol Rev 1994
; 46 : 325-415.
2. Bacon CR, Morrison JJ, O'Reilly GO, Cameron IT, Davenport
AP. ETA and ETB endothelin receptors in human myometrium
characterized by the subtype selective ligands BQ123, BQ3020, FR139317
and PD151242. J Endocrinol 1995 ; 144 : 127-34.
3. Héluy V, Germain G, Fournier T, Ferré F, Breuiller-Fouché
M. Endothelin ETA receptors mediate human uterine smooth muscle
contraction. Eur J Pharmacol 1995 ; 285 : 89-94.
4. Osada K, Tsunoda H, Miyauchi T, Sugishita Y, Kubo T, Goto
K. Pregnancy increases ET1-induced contraction and changes receptor subtypes
in uterine smooth muscle in humans. Am J Physiol 1997 ; 272 (Regulatory
Integrative Comp Physiol 41) : R541-8.
5. Breuiller-Fouché M, Héluy V, Fournier T, Dallot
E, Vacher-Lavenu MC, Ferré F. Role of endothelin-1 in regulating
proliferation of cultured human uterine smooth muscle cells. Mol Hum
Reprod 1998 ; 4 : 33-9.
6. Breuiller-Fouché M, Vacher-Lavenu MC, Fournier T, Morice
P, Dubuisson JB, Ferré F. Endothelin A receptors in human uterine
leiomyomas. Obstet Gynecol 1997 ; 90 : 727-30.
7. Andersen J. Factors in fibroid growth. Baillière's
Clin Obstet Gynaecol 1998 ; 12 : 225-43.
8. Schwartz LB, Diamond MP, Schwartz PE. Leiomyosarcomas : clinical
presentation. Am J Obstet Gynecol 1993 ; 168 : 180-3.
9. Asham EH, Loizidou M, Taylor I. Endothelin-1 and tumour development.
Eur J Surg Oncol 1998 ; 24 : 57-9.
10. Battistini B, Chailler R, D'Orléans-Juste P, Brière
N, Sirois P. Growth regulatory properties of endothelins. Peptides
1993 ; 14 : 385-9.
11. Miyamoto Y, Yoshimasa T, Arai H, Takayan K, Ogawa Y, Itoh
H, et al. Alternative RNA splicing of the human endothelin-A receptor
generates multiple transcripts. Biochem J 1996 ; 31 : 795-801.
12. Bourgeois C, Robert B, Rebourcet R, Mondon F, Mignot TM,
Duc-Goiran P, et al. Endothelin-1 and ETA receptor expression
in vascular smooth muscle cells from human placenta : a new ETA
receptor messenger ribonucleic acid is generated by alternative splicing
of exon 3. J Clin Endocrinol Metab 1997 ; 82 : 3116-23.
13. Pekonen F, Nyman T, Rutanen EM. Differential expression of
mRNAs for endothelin-related proteins in human endometrium, myometrium
and leiomyoma. Mol Cell Endocrinol 1994 ; 103 : 165-70.
14. Breuiller-Fouché M, Héluy V, Fournier T, Ferré
F. Endothelin receptors : binding and phosphoinositide breakdown in human
myometrium. J Pharmacol Exp Ther 1994 ; 270 : 973-8.
15. Maggi M, Vannelli GB, Fantoni G, Baldi E, Magini A, Peri
A, et al. Endothelin in the human uterus during pregnancy. J
Endocrinol 1994 ; 142 : 385-96.
16. Breuiller-Fouché M, Tertrin-Clary C, Héluy
V, Fournier T, Ferré F. Role of protein kinase C in endothelin-1-induced
contraction of human myometrium. Biol Reprod 1998 ; 59 : 153-9.
17. Brandon DD, Erickson TE, Keenan EJ, Strawn EY, Novy MJ, Burry
KA, et al. Estrogen receptor gene expression in human uterine leiomyomata.
J Clin Endocrinol Metab 1995 ; 80 : 1876-81.
18. Maggi M, Vannelli GB, Peri A, Brandi ML, Fantoni G, Giannini
S, et al. Immunolocalization, binding, and biological activity
of endothelin in rabbit uterus : effect of ovarian steroids. Am J Physiol
1991 ; 260 (Endocrinol Metab 23) : E292-305.
19. Cavaillé F, Fournier T, Dallot E, Delhemme C, Ferré
F. Myosin heavy chain isoform expression in human myometrium : presence
of an embryonic nonmuscle isoform in leiomyomas and in cultured cells.
Cell Motil Cytoskeleton 1995 ; 30 : 183-93.
20. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation
by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal
Biochem 1987 ; 162 : 156-9.
|
Version imprimable
