Les récepteurs pour les facteurs de la famille du VEGF

ARTICLE

La vasculogenèse est la naissance de vaisseaux sanguins qui fait suite à la différenciation et à la prolifération des précurseurs des cellules endothéliales (angioblastes). L'angiogenèse se définit par le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau vasculaire préexistant.

Ces 2 événements, qui comprennent de nombreuses étapes critiques, sont impliqués dans des processus physiologiques tels que l'embryogenèse, la cicatrisation, la formation du corpus luteum ou lors de pathologies tumorales et inflammatoires. Un grand nombre de facteurs solubles incluant des cytokines (IL-8, TNFa), des peptides (angiogénine) et des facteurs de croissance (au sens générique actuel, non limité à la prolifération) agissent sur les cellules endothéliales [1]. Plusieurs de ces facteurs sont des ligands pour des récepteurs présents à la surface des cellules et dotés d'une activité tyrosine kinase (RTK). Ils sont principalement représentés par les PDGF, FGF et VEGF et par l'angiopoïétine [2, 3]. Au contraire des FGF et des PDGF, facteurs de croissance pléiotropiques impliqués dans un grand nombre d'effets biologiques, les VEGF agissent presque exclusivement sur les cellules endothéliales et participent d'une façon majeure à l'angiogenèse et à la vasculogenèse. Ces 10 dernières années, de nombreuses expériences ont montré le rôle crucial des VEGF et de leurs récepteurs (VEGFR) durant le développement et divers processus physiologiques et pathologiques.

Les facteurs de croissance endothéliaux de la famille du VEGF

À l'origine décrit comme un facteur soluble favorisant la perméabilité vasculaire, le VEGF ­ ou plutôt VEGFa, puisqu'il est le membre fondateur de la famille (quelquefois également appelé VPF pour vascular permeability factor ou encore vasculotropine) ­ est le principal facteur de croissance endothélial [4-6]. C'est une glycoprotéine de 20 kDa, exerçant son action sous forme dimérique grâce à un pont disulfure reliant 2 molécules. Elle a 18 % d'identité avec le PDGFa, notamment au niveau de résidus cystéine nécessaires au repliement correct de la protéine et à sa liaison aux récepteurs. Le gène du VEGFa humain, localisé sur le chromosome 6 [7], se compose de 8 exons codant pour 4 isoformes de 121, 165, 189 et 206 acides aminés obtenues par épissage alternatif [6]. Les 2 isoformes les plus courtes sont sécrétées dans le compartiment extracellulaire, tandis que les 2 autres restent associées à la membrane cellulaire à travers une région carboxy-terminale riche en arginine/lysine (figure 1). Comme beaucoup d'autres facteurs de croissance, le VEGFa a une tendance à s'associer avec les protéoglycanes de la matrice extracellulaire. La perte d'un seul allèle du VEGFa altère l'angiogenèse et la formation d'îlots sanguins, et est létale chez l'embryon de souris au jour 11. Le développement vasculaire est donc dépendant du niveau d'expression du VEGFa [8, 9].

Deux nouveaux VEGF, le VEGFb et le VEGFc, ont été caractérisés récemment [10-13]. Ces ligands ont environ 35 % d'identité en acides aminés avec le VEGFa, et sont localisés chez l'homme dans les régions chromosomiques 11q13 et 4q34, respectivement [13]. En plus de la similarité de structure globale avec les autres VEGF, le VEGFc possède une région carboxy-terminale riche en cystéine dont la signification est inconnue. Le PlGF (placenta growth factor) est un quatrième ligand pour les VEGFR [14, 15]. Le gène du PlGF humain est localisé sur le chromosome 14 [7], et code pour des glycoprotéines de 131 (PlGF-1) et 152 (PlGF-2) acides aminés. Elles partagent 53 % d'identité avec le VEGFa. Seul le PlGF-2 est capable de se lier à l'héparine. À côté des homodimères du VEGFa et du PlGF, des hétérodimères VEGFa/PlGF fonctionnels ont été mis en évidence dans des surnageants de culture cellulaire et dans le sérum. Un potentiel cinquième membre de la famille, FIGF (FOS-induced growth factor) a été caractérisé récemment [16] mais n'est peut-être que l'équivalent murin du VEGFc décrit chez l'homme [10, 11].

Structure des récepteurs aux VEGF

Les récepteurs aux VEGF appartiennent à la grande famille des RTK. Ces protéines intégrales possèdent une région extracellulaire capable de lier les ligands, un domaine transmembranaire et une région cytoplasmique portant l'activité tyrosine kinase. Dans le cas des VEGFR, le domaine kinase est interrompu par une courte séquence spécifique à chaque récepteur (figure 2). La liaison d'un ligand provoque la dimérisation du récepteur, déclenche l'activité catalytique, ce qui conduit à la phosphorylation des résidus tyrosine présents sur le récepteur lui-même et sur ses substrats cytoplasmiques. Des interactions complexes ont lieu après cet événement enzymatique, essentiellement régulé par des phosphorylations/déphosphorylations de protéines cytoplasmiques et des récepteurs. L'intégrité du domaine kinase conditionne les effets biologiques des RTK, de telle sorte qu'un récepteur altéré dans son activité kinase ne peut plus transmettre un signal normal et efficace.

La famille des VEGFR comprend 3 membres : FLT1, FLK1/KDR et FLT4 [2, 4, 6, 17-20]. Leur désignation respective, VEGFR1, VEGFR2 et VEGFR3, est en passe d'être adoptée définitivement. Ils se conforment à la structure générale des RTK. La région extracellulaire dans cette famille est composée de 7 domaines de type immunoglobuline. FLT1, FLK1/KDR et FLT4 ont seulement 30 % d'identité en acides aminés dans leur région extracellulaire, mais sont similaires à 80 % dans leur domaine tyrosine kinase. Les 3 gènes correspondants sont localisés sur 3 chromosomes différents, à proximité des gènes des récepteurs aux PDGF et des RTK hématopoïétiques (FLT3, KIT et FMS) [21-25]. FLK1/KDR est situé avec le PDGFRA et KIT sur le chromosome 4 chez l'homme et le chromosome 5 chez la souris. FLT1 est voisin de FLT3 dans la région 13q12 chez l'homme. Le gène FLT4 humain est localisé dans une région un peu plus télomérique que celle du tandem PDGFRB/FMS, sur le bras long du chromosome 5.

Étant donné les efforts consacrés au niveau mondial à cloner des gènes codant pour des tyrosine kinases et l'existence de très grand nombre d'ADNc séquencés au hasard (expressed sequence tags), l'existence d'un quatrième VEGFR est improbable.

Interaction entre les VEGFR et leurs ligands

Les spécificités d'interaction entre les VEGF et leurs récepteurs ressemblent en complexité à celles trouvées dans les familles des FGF et des PDGF (figure 3) [4, 26-29]. Les récepteurs FLT1 et FLK1/KDR sont des récepteurs de haute affinité pour le VEGFa (Kd 1-20 et 75-770 pM, respectivement). Parmi les 4 isoformes du VEGFa, le VEGF 165 a la plus grande affinité de liaison aux VEGFR. Le PlGF lie FLT1 (Kd 200 pM) apparemment sur le même site que le VEGFa, mais n'a pas d'affinité pour FLK1/KDR ou FLT4. Le VEGFc interagit avec FLT4 et, à un moindre degré, avec FLK1/KDR [10, 11]. À ce jour, le VEGFb est un ligand orphelin. De même, il est encore trop tôt pour connaître les propriétés du FIGF. Le VEGFa semble aussi interagir avec une protéine non encore identifiée, présente en surface des cellules et qui peut constituer un VEGFR de basse affinité.

Le second domaine de type immunoglobuline de FLT1 et FLK1/KDR est presque exclusivement responsable de la spécificité d'interaction avec le VEGFa. Toutefois, celle-ci nécessite les domaines adjacents pour être fonctionnelle. La transposition de ce domaine sur le récepteur FLT4 confère à ce dernier la capacité de lier le VEGFa [30]. Récemment, la spécificité du VEGFa a été étudiée par une analyse de mutagenèse. Celle-ci montre qu'une portion d'acides aminés chargés positivement dans le facteur de croissance est cruciale pour la liaison à FLT1, tandis que l'interaction avec FLK1 implique une région chargée négativement [31]. Même si le système VEGF/VEGFR partage de nombreuses similitudes avec le système PDGF/PDGFR, une hétérodimérisation entre FLT1 et FLK1 n'a pas encore été décrite dans les cellules endothéliales.

Les isoformes des VEGFR

L'organisation des RTK est compliquée par l'existence de multiples isoformes de certains membres, faisant suite à un épissage alternatif des gènes (figure 4). Ce processus peut affecter à la fois les régions extra- et intracellulaires des récepteurs et conduire à la synthèse d'isoformes dépourvues de certaines portions, comme cela a été décrit par exemple pour les récepteurs des FGF et certains récepteurs hématopoïétiques. Dans le cas des VEGFR, FLT1 peut être produit sous forme d'un récepteur soluble sans ses régions transmembranaires et cytoplasmiques mais en conservant sa capacité à lier le VEGFa [32, 33]. Les récepteurs humains FLT1 et FLT4 sont retrouvés sous 2 isoformes qui diffèrent dans leur queue cytoplasmique par la présence ou l'absence de 65 acides aminés [34-36]. Les isoformes peuvent réguler l'activité du récepteur en séquestrant le ligand dans le cas d'un récepteur soluble, ou en variant les sites de fixation pour des substrats cellulaires dans le cas d'isoformes cytoplasmiques. Ainsi, une protéine soluble FLT1 peut efficacement supprimer la mitogenèse dépendante du VEGF dans des cellules endothéliales [32]. Les isoformes représentent ainsi un système par lequel un organisme peut moduler l'étendue des interactions d'un récepteur donné et, de là, ses activités biologiques.

Expression endothéliale des VEGFR

Les gènes FLT1, FLK1/KDR et FLT4 sont exprimés de façon prédominante dans les cellules du compartiment endothélial et leurs progéniteurs. Cette expression restreinte s'accorde avec l'activité spécifique des promoteurs des gènes des VEGFR [37]. Chez l'homme, les 3 gènes sont exprimés dans les tissus embryonnaires et leurs produits ont des distributions spatiales distinctes. Par exemple, FLT1 et FLK1/KDR mais pas FLT4 sont retrouvés dans l'endocarde [35, 38]. Plus tard, FLT4 est plus particulièrement exprimé dans l'endothélium lymphatique [39]. Cela est corroboré par le spectre d'expression de son ligand [40]. Les gènes des VEGFR s'expriment dans les cellules endothéliales dès les stades initiaux de leur développement. Flt1 est exprimé à partir de E7.5 dans tout le compartiment endothélial de l'embryon. Son expression persiste à l'état adulte. Flk1 est exprimé de façon précoce, dans le sac vitellin et le mésoderme embryonnaire dès E7, puis dans le système vasculaire [41-43]. L'expression précoce de FLK1/KDR amène à penser qu'il puisse constituer un marqueur de surface cellulaire des angioblastes, les précurseurs des cellules endothéliales, et, de façon plus éloignée, un marqueur des hémangioblastes, les précurseurs putatifs des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Cette hypothèse est renforcée par le phénotype des souris Flk1^­/­ qui se caractérise par de profonds défauts dans la vasculogenèse et la formation des îlots sanguins [44]. Au contraire, le phénotype Flt1^­/­, également létal pour les embryons, affecte seulement la vasculogenèse [45].

Bien que l'inactivation génique du VEGFa montre des défauts comparables, il y a un retard dans la létalité par rapport à celle entraînée par l'inactivation des VEGFR, suggérant un possible sauvetage par d'autres ligands [8, 9]. À côté de leur expression endothéliale, les VEGFR ont aussi une certaine expression sur différentes cellules hématopoïétiques.

Fonctions cellulaires des VEGFR

Bien que VEGFR1/FLT1 et VEGFR2/FLK1/KDR partagent le même ligand, ils induisent des réponses cellulaires différentes. Les activités mitogéniques et chimiotactiques de FLK1/KDR dans les cellules endothéliales ne sont pas retrouvées pour FLT1. VEGFR3/FLT4 est doté d'une activité mitogénique et chimiotactique quand il est exprimé dans les cellules endothéliales ou fibroblastiques. Les fonctions spécifiques de FLT1 et FLK1 ne sont pas clairement définies au niveau cellulaire mais le phénotype sévère des souris Flt1^­/­ et Flk1^­/­ suggère un rôle central de ces RTK dans les étapes précoces de formation des vaisseaux sanguins et le développement. Les résultats de l'inactivation génique de Flt1 et Flk1 montrent également le manque de redondance fonctionnelle parmi les récepteurs des VEGF.

La cascade de signalisation des VEGFR commence à être explorée. Jusqu'à présent, les cibles décrites pour les VEGFR sont communes à plusieurs tyrosine kinases, et comprennent les molécules GAP, SRC et PLC gamma 1 [46-50]. FLK1/KDR et FLT4 sont capables d'activer la voie RAS. Dans le cas de FLT4, une telle activité dépend étroitement de la protéine adaptatrice SHC [36]. FLT1 provoque seulement une faible phosphorylation de la protéine SHC [50]. Son interaction avec la PI3 kinase est discutée [46, 49]. Il est probable que les 3 VEGFR interagissent à la fois avec des substrats communs et distincts, et induisent différentes réponses dans les cellules endothéliales.

Rôle des VEGF/VEGFR dans des processus pathologiques

Quand il est sécrété par les tissus adjacents aux vaisseaux sanguins, le VEGFa est un facteur mitogénique et chimiotactique pour les cellules endothéliales et il favorise l'angiogenèse in vivo. Il provoque également la libération de facteurs protéolytiques qui facilitent l'infiltration des tissus par de nouveaux vaisseaux sanguins. Durant des événements pathologiques, le VEGFa est produit par les cellules tumorales et agit de manière paracrine sur l'endothélium vasculaire [5]. L'hypoxie, une caractéristique fréquente de l'environnement tumoral, est un stimulus majeur qui augmente l'expression de VEGFa [51, 52]. Il a aussi été suggéré que le facteur de croissance dérivé de la tumeur agit sur les cellules dendritiques circulantes et compromet l'établissement d'une immunité antitumorale en affectant leur présentation antigénique potentielle. Chez les adultes, les transcrits des VEGFR sont trouvés à un faible niveau dans l'endothélium mais deviennent abondants dans les vaisseaux en croissance du tissu tumoral néovascularisé [53]. Cela est dû à des cytokines, des facteurs de croissance et des seconds messagers inflammatoires présents au voisinage des tumeurs. La stimulation des VEGFR endothéliaux déclenche alors la néovascularisation tumorale, laquelle améliore le transport de nutriments et d'oxygène vers les cellules cancéreuses. De plus, le réseau de vaisseaux sanguins nouvellement formé permet la dissémination d'embols métastatiques à partir de la tumeur et aggrave le pronostic vital. Les VEGF/VEGFR sont aussi impliqués dans des maladies inflammatoires qui ont un phénotype angiogénique, telles que le psoriasis et l'arthrite rhumatoïde [54]. Dans de tels cas, le chimiotactisme des monocytes favorisé par FLT1 peut participer à l'inflammation. De la même manière, durant la cicatrisation, les VEGF/VEGFR, après une « mise en service » par un réseau de stimuli et de facteurs, participent à la néoangiogenèse.

Le rôle central des VEGF et de leurs récepteurs dans la tumorigenèse a été montré par plusieurs approches (figure 5) [55, 56]. Par exemple, l'injection d'un anticorps monoclonal anti-VEGF est capable de réduire la croissance de tumeurs greffées à la souris nude, et les cellules souches embryonnaires VEGFa^­/­ ont une capacité réduite à former des tumeurs. L'inhibition de la croissance de glioblastomes chez des animaux est obtenue en faisant exprimer de façon ectopique un récepteur FLK1/KDR privé de sa portion tyrosine kinase et capable d'hétérodimériser avec le récepteur endogène entier ; une réduction de croissance, de vascularisation et d'œdème est observée dans ces tumeurs. En dépit du manque d'indices concernant l'implication de FLT4 et de son ligand dans des situations pathologiques, leur expression au niveau de l'endothélium lymphatique permet de spéculer sur un potentiel rôle dans la perméabilité lymphatique.

Ces effets des VEGFR sont dus à des modifications de leur régulation. Bien qu'ils possèdent une activité transformante potentielle, des altérations structurales activatrices des VEGFR n'ont pas été trouvées dans les cancers.

VEGFR comme cibles de thérapie

En plus de la classique chimiothérapie anticancéreuse, une thérapie anti-angiogénique apparaît maintenant comme un adjuvant intéressant pour diminuer la dissémination et la croissance des tumeurs. Les VEGF et les VEGFR sont des cibles idéales pour de telles thérapies anti-tumeurs. Une meilleure connaissance de la transduction du signal des VEGFR permettra le développement d'inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant spécifiquement leur activité enzymatique ou les facteurs cytoplasmiques de leur cascade de transduction [57]. Une appréciation des spécificités ligand-récepteur entre les VEGFR et leurs ligands donne la possibilité d'inhiber sélectivement les récepteurs [31]. Par exemple, une protéine de fusion VEGFa/toxine peut spécifiquement tuer les cellules exprimant FLK1/KDR et supprimer l'angiogenèse in vivo [58] (figure 5). Ces considérations valent aussi pour les ligands (angiopoïétine) et récepteurs de la famille TIE (TIE1, TIE2/TEK) dont les rôles complémentaires des VEGF/VEGFR sont rapidement élucidés [3, 59-61].

En pathologie, l'angiogenèse ne doit pas toujours être considérée comme un événement néfaste en toutes circonstances. Par exemple, la revascularisation des membres améliore considérablement le pronostic et le rétablissement des patients atteints d'ischémie. Les maladies des artères périphériques représentent aussi une bonne indication pour une angiogenèse thérapeutique. Dans de tels cas, des implants de VEGF aideraient considérablement la réendothélisation des tissus nécrotiques.

Remerciements

Nous remercions C. Mawas et O. Rosnet pour leurs commentaires, et l'INSERM, la Ligue nationale française contre le cancer (LNFCC) et les Comités des Bouches-du-Rhône et du Var de la LNFCC pour leur soutien.

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