John Libbey Eurotext

Innovations & Thérapeutiques en Oncologie

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Utilisation de lymphocytes T génétiquement modifiés avec un récepteur antigénique chimérique (CAR) pour la thérapie cellulaire des cancers Volume 3, numéro 3-4, Mai-Août 2017

Illustrations

  • Figure 1
  • Figure 2
  • Figure 3
  • Figure 4

Tableaux

La greffe de lymphocytes T (LT) est déjà utilisée depuis de nombreuses années en association avec la greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Il s’agit plus précisément de l’injection des lymphocytes du donneur de moelle osseuse (DLI). Dans ce contexte, l’injection de LT alloréactifs est associée à un effet antileucémique [1]. De même, l’immunothérapie adoptive antivirale utilisant le transfert de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques d’antigènes viraux est une stratégie thérapeutique ancienne qui permet la guérison des cancers viro-induits associés aux traitements immunosuppresseurs précédant une greffe de CSH allogénique. L’équipe de Rooney a été la première à développer cette approche où les LT spécifiques de l’Epstein-Barr virus (EBV) sont isolés à partir du sang périphérique d’un donneur, amplifiés in vitro, puis administrés au receveur de CSH pour prévenir ou guérir un syndrome lymphoprolifératif B induit par l’EBV [2]. Le principe de la thérapie cellulaire adoptive consiste à utiliser des stratégies d’ingénierie cellulaire et génique permettant le transfert de LT à un patient pour obtenir un effet thérapeutique en l’absence de réactions allogéniques toxiques (réaction du greffon contre l’hôte, GVH) observées jusqu’alors dans les allogreffes de cellules hématopoïétiques.

Développés en cancérologie depuis le début des années 1980 sur la base des travaux de Rosenberg menés sur le mélanome, les essais cliniques de transfert de LT infiltrant la tumeur (TIL) sont les premiers essais de thérapie cellulaire antitumorale à avoir donné des résultats spectaculaires. Dans ces études, les LT sont isolés à partir des fragments de la tumeur du patient issus d’une chirurgie ou biopsie, puis amplifiés en grande quantité ex vivo en présence de facteurs de croissance comme l’interleukine-2 (IL-2). Les lymphocytes sont ensuite réinjectés au patient, en combinaison avec des injections de fortes doses d’IL-2, destinées à favoriser la survie et la multiplication des TIL in vivo. La même équipe a mis en évidence que les TIL administrés étaient capables de rejoindre les sites tumoraux et de persister plusieurs mois dans le sang périphérique [3].

Le groupe de Rosenberg a ainsi observé que 34 % des patients atteints de mélanome métastatique et traités par TIL associé à l’IL-2 présentaient une réponse clinique partielle ou complète, alors que seuls 17 % des patients recevant de l’IL-2 répondaient au traitement [4]. Malgré des effets secondaires notables, de nombreux essais cliniques ont montré l’importance de réaliser un conditionnement lymphodéplétant (habituellement la combinaison cyclophosphamide avec ou sans fludarabine) préalablement à la procédure de thérapie cellulaire, afin de promouvoir l’expansion et la survie des LT transférés au patient. L’introduction d’un conditionnement lymphodéplétant et de l’irradiation corporelle totale avant l’injection de TIL a permis d’augmenter le taux de réponse et d’observer des rémissions durables chez les patients [5]. Toutefois, la toxicité du conditionnement limite le nombre de patients pouvant bénéficier de ce traitement.

L’utilisation des TIL est limitée par la disponibilité du matériel chirurgical ainsi que par la présence de LT spécifiques au sein de la tumeur préalablement à la biopsie. Pour étendre le bénéfice du transfert cellulaire adoptif à d’autres types de cancers, des approches permettant de modifier génétiquement les LT du sang périphérique ont été développées afin de reprogrammer la spécificité antigénique des LT. Deux approches ont été élaborées pour doter les cellules du sang périphérique d’une spécificité antitumorale : les récepteurs de lymphocytes T transgéniques (TCR Tg) et les récepteurs antigéniques chimériques (CAR).

Structure des CAR et des TCR transgéniques

Les LT représentent les acteurs majeurs de l’immunité antitumorale [6]. Ils reconnaissent, via le récepteur des lymphocytes T (TCR), des peptides dérivés d’antigènes de tumeur présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Les TCR ont une structure de type immunoglobuline et sont composés d’une chaîne α et d’une chaîne β comportant chacune un domaine constant et un domaine variable (figure 1). Les chaînes α et β du TCR s’associent à un complexe protéique composé des chaînes CD3 γ, δ, ε et ζ pour transduire le signal d’activation à l’intérieur de la cellule lors de la reconnaissance d’un peptide antigénique.

Parmi les LT conventionnels, on distingue les LT CD8 qui possèdent des propriétés cytotoxiques directes et les LT CD4 (ou T helper) qui orientent les réponses immunitaires. Les LT CD8 reconnaissent directement les cellules tumorales via des peptides présentés par le CMH de classe I (CMH-I) qui est exprimé par toutes les cellules nucléées de l’organisme. Les LT CD4 reconnaissent indirectement les cellules tumorales via des peptides présentés par le CMH de classe II (CMH-II), exprimé uniquement par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) comme les cellules dendritiques, ou dont l’expression est induite dans certaines cellules épithéliales exposées aux interférons. Ces peptides restreints au CMH-II proviennent de l’apprêtement par les CPA de protéines captées dans l’environnement tumoral. Le degré d’affinité des interactions entre le TCR et le complexe CMH-peptide va conditionner l’intensité du signal reçu par le LT après une stimulation antigénique.

TCR transgéniques

La première étape de la thérapie génique à base de TCR Tg consiste à isoler un clone de LT de forte affinité pour une cible antigénique. Celui-ci peut être isolé à partir des LT provenant de patients en rémission [7], de souris humanisées immunisées avec des antigènes tumoraux humains [8, 9] ou par la technique de phage display[10]. Les chaînes α et β du TCR du clone de LT sont isolées et clonées dans un vecteur d’expression génique (Y-rétrovirus ou lentivirus). Le vecteur peut alors être introduit dans les lymphocytes d’un patient ou d’un donneur sain pour leur conférer une spécificité antigénique antitumorale. Le transfert de gène ex vivo requiert une étape de stimulation de la croissance des LT, et les cellules activées sont ensuite transduites et amplifiées en culture jusqu’à un nombre de cellules suffisant pour une application clinique (figure 2). Contrairement aux anticorps, l’affinité des TCR générés naturellement pour leur cible antigénique est faible (tableau 1). Des stratégies ont été développées pour améliorer l’affinité du TCR, l’expression à la surface cellulaire et la prévention des mésappariements des chaînes α et β du TCR Tg avec les chaînes du TCR endogène entraînant un risque potentiel de réactions d’auto-immunité. La substitution d’un seul ou de deux acides aminés dans la région variable des chaînes α ou β a permis d’augmenter la réactivité des LT [11-13].

L’équipe de Rosenberg est pionnière dans les essais de transfert adoptif de LT modifiés génétiquement avec un TCR Tg. Cette approche a prouvé son efficacité dans des essais cliniques ciblant notamment les antigènes MART-1 et NY-ESO-1 [14, 15]. La stratégie basée sur le TCR Tg présente l’avantage de pouvoir cibler des antigènes de tumeurs localisés au niveau membranaire, mais aussi intracellulaire. De plus, les antigènes intracellulaires peuvent être des facteurs impliqués de manière dominante dans l’oncogenèse (par ex., la télomérase) évitant ainsi l’émergence de variants cellulaires n’exprimant plus l’antigène cible [16, 17]. Le principal inconvénient est la restriction à un phénotype HLA donné dans lequel le peptide antigénique est présenté. Son utilisation est donc limitée aux antigènes tumoraux protéiques et aux patients qui expriment les molécules du CMH reconnues par le TCR Tg (tableau 1). Les CAR qui ne sont pas soumis à ces contraintes représentent une alternative au TCR Tg.

Récepteurs antigéniques chimériques

Les CAR sont constitués des parties variables d’un anticorps liées ensemble par une séquence de liaison (linker), pour former la région variable à chaîne simple (scFv), associées aux domaines de transduction du signal du TCR (figure 1). Afin d’optimiser leur fonctionnalité, la structure des CAR a évolué durant ces dix dernières années, donnant lieu à trois générations de CAR (figure 3).

  • Dans les CAR de 1re génération, le domaine de signalisation intracellulaire était constitué de la chaîne ζ du complexe CD3 qui conférait aux LT des capacités de sécrétion cytokinique et de lyse des cellules cibles dans des modèles murins [18]. Cependant, les réponses thérapeutiques n’étaient observées qu’après une administration locale [19] et, en l’absence de molécules de costimulation, les LT étaient souvent rendus anergiques [20]. Chez l’homme, les premiers essais cliniques de CAR de 1re génération n’ont pas révélé de réelle efficacité antitumorale et persistaient peu de temps in vivo (tableau 2). Afin d’augmenter la persistance des cellules CAR-T in vivo, il est possible de modifier génétiquement les LT mémoires spécifiques de virus latents comme le cytomégalovirus (CMV) ou l’EBV qui sont stimulés continuellement via leur TCR endogène [21]. Le premier succès thérapeutique d’un CAR de 1re génération a été décrit dans le neuroblastome où des enfants ont été traités avec des LT anti-EBV modifiés avec un CAR de 1re génération ciblant le disialoganglioside GD2 [22].
  • Dans les CAR de 2e génération, l’ajout d’une molécule de costimulation dans le domaine intracellulaire a permis d’augmenter significativement l’efficacité antitumorale des LT dans des modèles de xénogreffes chez la souris [23]. Les molécules de costimulation incluent CD28 et des membres de la famille du récepteur du TNF, CD27, 4-1BB (CD137) ou OX40 (CD134) qui sont à l’origine d’une augmentation des capacités cytotoxiques et de persistance des LT in vivo [24, 25].
  • Les CAR de 3e génération comprennent deux domaines de costimulation combinés à la chaîne CD3 ζ dans la partie intracellulaire. Alors que les modèles précliniques ont montré une amélioration de l’activité antitumorale [26], les données cliniques sont encore limitées [27].
  • Récemment décrits, les LT redirigés avec un CAR de 4e génération contiennent une cassette d’expression génique induite par le CAR (TRUCK). Les TRUCK sont capables de sécréter des cytokines, telle l’IL-12, ou d’autres protéines suite à la reconnaissance d’un antigène par le CAR, et de moduler le micro-environnement tumoral [28].

Bien que la reconnaissance par les CAR soit limitée aux antigènes de surface, ils présentent de nombreux avantages comparés au TCR Tg. Contrairement au TCR Tg, la reconnaissance par les CAR ne nécessite pas d’apprêtement de l’antigène ni d’expression des molécules du CMH par les cellules cibles. Les CAR peuvent donc être utilisés chez les patients quel que soit leur typage HLA et ils peuvent cibler des cellules tumorales qui présentent des anomalies des voies de présentation de l’antigène. Une autre caractéristique des CAR est leur capacité à reconnaître non seulement des antigènes protéiques mais également des antigènes glucidiques et glycolipidiques, élargissant la gamme de cibles potentielles (tableau 1).

Essais cliniques de CAR

Production de grade clinique

La production des LT génétiquement modifiés se déroule en plusieurs étapes (figure 2). Les cellules sont prélevées chez le patient pour l’approche autologue ou chez un donneur sain pour l’approche allogénique. Ces cellules sont mises en culture au laboratoire et activées par des cocktails de cytokines pour induire leur expansion et favoriser les modifications génétiques. Comme pour la greffe de CSH, ces approches nécessitent une compatibilité HLA minimum et sont souvent réalisées en autologue, ce qui limite le développement de cette thérapeutique. Une autre stratégie permettant de faciliter l’accès de ce type de traitement au plus grand nombre serait de produire des banques de cellules génétiquement modifiées à partir de cellules non alloréactives comme des LT dont les TCR endogènes ont été inactivés par thérapie génique [29].

Cancers hématologiques

Alors que les premiers essais cliniques évaluaient l’efficacité des CAR de 1re génération dans les cancers solides (tableau 3), les premiers succès thérapeutiques sont apparus au cours d’essais cliniques dans les cancers hématologiques (tableau 2).

La toxicité importante observée lors des premiers essais cliniques évaluant les CAR (tableau 3) a mis en évidence l’importance de cibler des antigènes dont l’expression est restreinte aux cellules tumorales ou partagée avec des cellules saines non essentielles pour éviter des réactions auto-immunes parfois mortelles [30, 31]. Les molécules CD19 et CD20 exprimées par les lymphocytes B, dont l’absence peut être compensée par l’apport d’immunoglobulines polyvalentes, représentent alors de bonnes cibles thérapeutiques de transfert adoptif de cellules CAR-T. En 2010 et 2011, les premiers succès thérapeutiques du CAR spécifique de CD19 dans le traitement de différentes leucémies ont validé cette stratégie thérapeutique [24, 25]. Maints essais cliniques ont suivi et montré l’efficacité des CAR CD19 dans de nombreuses hémopathies B réfractaires aux autres traitements (comme la leucémie aiguë lymphoïde et le lymphome folliculaire) [32-34].

Le succès considérable des CAR CD19 dans les leucémies lymphoïdes a motivé la recherche de CAR spécifiques d’autres marqueurs hématologiques tels que CD138, CD33 et CD123. Plus d’une centaine d’essais cliniques sont aujourd’hui en cours [35], seuls les essais cliniques publiés sont présentés dans le tableau 2.

Tumeurs solides

L’utilisation de la stratégie des CAR pour traiter des pathologies malignes non hématopoïétiques nécessite de considérer d’autres paramètres incluant : la capacité des LT à accéder aux cellules tumorales (domiciliation), la présence d’un stroma et de cellules immunitaires immunosuppressives (LT régulateurs et cellules myéloïdes suppressives) et l’exposition à des conditions métaboliques défavorables à la survie des LT (hypoxie, déplétion en ATP et inflammation).

Le choix de l’antigène est un paramètre crucial qui dicte à la fois l’efficacité et la sécurité de cette stratégie. La majorité des cibles sont des antigènes surexprimés dans les tumeurs et exprimés à un plus faible niveau par les cellules saines (HER2, CEA, GD2, EGFRvIII, MUC1, PSMA), ce qui entraîne des risques de réactions auto-immunes (tableau 3). Certains ne sont pas directement exprimés par la tumeur mais sont essentiels à la survie et à la croissance tumorale comme le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) [32]. Les seuls antigènes membranaires réellement spécifiques des cellules tumorales sont les antigènes dérivés de mutations (néo-antigènes), ayant subi des modifications post-traductionnelles (telle MUC1), ou des antigènes viraux (E6/E7).

Toxicité

Les stratégies CAR ne sont pas dénuées d’effets secondaires. Ceux-ci surviennent souvent rapidement, approximativement dans les 6 heures après l’injection. L’orage cytokinique et le syndrome d’activation macrophagique sont des effets secondaires sévères et parfois létaux, souvent associés à l’activité antitumorale des CAR et à l’étendue de la masse tumorale. L’utilisation d’anticorps anti-IL-6 (tocilizumab) présente une bonne efficacité pour la prise en charge des réactions aiguës, toutefois l’action des anticorps est uniquement neutralisante et n’inhibe pas durablement la production d’IL-6. Afin de mieux maîtriser la toxicité potentielle de ce type de thérapie, il est possible de limiter la durée d’expression du transgène par les lymphocytes, de choisir une voie d’administration intratumorale, de réduire la dose de cellules injectées ou d’utiliser des systèmes de gènes suicides. Ces derniers permettent d’éliminer spécifiquement les cellules génétiquement modifiées en cas de survenue d’effets secondaires. Le délai d’action est de quelques jours [63] à quelques heures [64].

Optimisation

Choix de la cible antigénique idéal

La cible antigénique idéale pour une stratégie d’immunothérapie doit être surexprimée à la surface des cellules tumorales et non exprimées par les tissus normaux. Or, la majorité des antigènes de tumeurs ciblés ne sont pas spécifiques des cellules tumorales et sont exprimés au moins faiblement par les tissus sains, ce qui entraîne un risque non négligeable de réactions d’auto-immunité. Les risques sont cependant limités pour des cibles antigéniques exprimées à un plus faible niveau sur les cellules saines ou dont l’expression est limitée à des cellules dont l’élimination n’engage pas le pronostic vital comme c’est le cas des CAR ciblant la molécule CD19 [65]. La difficulté réside dans l’absence de modèle préclinique permettant de prévenir entièrement ce risque. Une stratégie de plus en plus utilisée consiste à faire exprimer deux CAR de spécificité différente à la surface des LT, conduisant à une activation synergique lorsque les deux antigènes sont reconnus et augmentant non seulement la spécificité mais aussi l’efficacité thérapeutique. Ce sont des CAR en tandem ou TanCAR [66].

À noter

En théorie, les néo-antigènes représentent une cible antigénique intéressante de par leur expression exclusive par les cellules tumorales et leur immunogénicité. Néanmoins, ces mutations sont souvent spécifiques de la tumeur d’un seul patient et leur ciblage thérapeutique nécessiterait une thérapie personnalisée difficilement applicable en pratique clinique. Les recherches portent aujourd’hui sur l’identification de néo-épitopes partagés telle la mutation G12D de KRAS dans le traitement du cancer colorectal [17].

Modification du micro-environnement tumoral

De nombreuses stratégies visant à moduler le micro-environnement tumoral immunosuppresseur sont en cours d’évaluation (figure 4). Les LT redirigés avec un CAR peuvent encore être optimisés par l’ajout de ligands de costimulation (4-1BBL ou CD40L), l’induction de la production in situ de cytokines stimulant les LT antitumoraux telle l’IL-12 [67] ou, à l’inverse, l’inhibition de cytokines immunosuppressives comme le TGF-β [68].

L’équipe de Rosenberg a testé un vecteur induisant la production d’IL-12 par les lymphocytes lors de l’activation de leur TCR, chez des patients porteurs de mélanome. L’injection de 0,3 à 3.109 lymphocytes a permis l’obtention d’un taux de réponses objectives de 63 %. Néanmoins, l’IL-12 produite génère une toxicité systémique importante incitant à optimiser cette stratégie [69].

Une augmentation de la proportion des cellules CAR-T exprimant les récepteurs inhibiteurs CTLA-4 et PD-1 a été observée après l’injection de ces cellules. Ainsi, l’administration d’un anticorps ciblant les points de contrôle immunologiques pourrait permettre d’augmenter l’efficacité des cellules CAR-T [70]. Il est également possible de cibler le stroma de la tumeur ou l’angiogenèse tumorale [71, 72]. Une étude récente suggère l’intérêt d’intégrer dans la partie intracellulaire du CAR un module sensible à l’hypoxie afin de faciliter l’activation sélective du LT au sein de l’environnement tumoral [73]. Enfin, l’induction de l’expression de récepteurs de chimiokines et de cytokines par les LT génétiquement modifiés favorise leur infiltration dans la tumeur et leur réponse à des cytokines stimulant la prolifération des LT.

Conclusion

Pour que le transfert cellulaire adoptif puisse conduire à des rémissions complètes et durables chez un plus grand nombre de patients, de nombreux obstacles doivent encore être franchis. La stimulation des réponses lymphocytaires antitumorales doit s’accompagner de mesures permettant de lever l’immunosuppression locale du micro-environnement tumoral. Les combinaisons thérapeutiques avec d’autres immunothérapies, notamment avec les anticorps ciblant les récepteurs inhibiteurs, peuvent répondre à ce premier problème. L’isolement des LT présents dans la tumeur et leur amplification in vitro représente un moyen intéressant d’obtenir rapidement un nombre suffisant de cellules effectrices en les extrayant de l’environnement tumoral hostile. Cependant, cette stratégie autologue reste difficile à développer d’un point de vue médico-économique (développement du traitement pour un seul patient). Des recherches sont encore nécessaires afin de trouver la méthode qui pourrait amplifier ex vivo en quantité suffisantela sous-population lymphocytaire T présentant des capacités antitumorales optimales chez tous les patients.

Anticorps bispécifiques

Afin de favoriser l’infiltration et la reconnaissance des cellules tumorales par les LT, une autre stratégie consiste à utiliser des anticorps capables de reconnaître deux cibles antigéniques simultanément. Il existe de nombreux formats d’anticorps bispécifiques. Les BiTE (bi-specific T-cell engager) sont les premiers à avoir été développés [74]. Ce sont des protéines de fusion constituées de deux scFv (domaines variables des chaînes lourde VH et légère VL) issus de deux anticorps reliés par un peptide de liaison : l’un reconnaît le marqueur des LT (CD3) et l’autre un antigène de tumeur. L’objectif est de favoriser le recrutement et l’activation des LT au contact de la tumeur, conduisant ainsi à la lyse des cellules tumorales. Le blinatumomab, qui cible les antigènes CD19 et CD3, a obtenu l’autorisation de mise sur le marché dans le traitement des leucémies aiguës lymphoïdes à précurseurs B en 2015.

Remerciements et autres mentions

Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêt.