Structures de la glycoprotéine des rhabdovirus

ARTICLE

Auteur(s) : Aurélie Albertini, Stéphane Roche, Jean Lepault, Stéphane Bressanelli, Yves Gaudin

UMR CNRS 2472, UMR Inra 1157, Laboratoire de virologie moléculaire et structurale, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette

Introduction

Les données expérimentales disponibles à ce jour indiquent que la façon dont se déforment les membranes et les structures intermédiaires que forment les lipides au cours du processus de fusion sont très semblables pour tous les virus pour lesquels le processus a été caractérisé et cela quelle que soit la structure de leur glycoprotéine fusogène (figure 1) [3-5]. Ainsi, il a été proposé que le premier intermédiaire lipidique formé, baptisé « stalk » (qu’on pourrait traduire par « pédoncule » ou… « trognon »), établit une connexion locale entre les feuillets externes des deux membranes en train de fusionner. L’expansion radiale de ce stalk permet la formation d’un diaphragme d’hémifusion (c’est-à-dire d’une bicouche lipidique locale, constituée des deux feuillets internes des membranes initiales). Selon les systèmes expérimentaux, l’hémi-fusion peut être restreinte ou non selon que la diffusion des lipides des monocouches externes est limitée ou non. À l’heure actuelle, on pense que la restriction de la diffusion des lipides est due à la formation d’un anneau de glycoprotéines autour du diaphragme d’hémi-fusion. L’étape suivante du processus de fusion est la formation d’un pore dans ce diaphragme [6]. Le pore initial est de petite taille (quelques nanomètres de diamètre) et peut parfois se refermer [7]. C’est son élargissement qui va conduire à la fusion complète.

La glycoprotéine G des rhabdovirus

Les rhabdovirus sont des virus enveloppés possédant une forme typique en obus plus ou mois allongée. Ils appartiennent à l’ordre des Mononegavirales. Leur génome est donc constitué d’une unique molécule d’ARN simple brin de polarité négative. Il est recouvert d’un manchon de protéines N avec lequel, en association avec l’ARN polymérase L et la phosphoprotéine P, il forme la nucléocapside. Celle-ci constitue l’unité de transcription/réplication active du virus dans le cytoplasme. Au sein du virion, elle est maintenue sous une forme condensée de structure hélicoïdale par la protéine de matrice M et est entourée d’une membrane constituée de lipides d’origine cellulaire contenant la glycoprotéine virale G.

G constitue les spicules visibles à la surface du virus en microscopie électronique après coloration négative. La glycoprotéine mature, après clivage de son peptide signal aminoterminal, possède environ 500 acides aminés (495 pour la souche Indiana du VSV, 505 pour le virus de la rage). La plus grande partie de sa masse se trouve dans son ectodomaine. Comme celui-ci est la seule partie extérieure du virion, il est la cible des anticorps neutralisants [8-14].

G joue un rôle critique dans l’entrée du virus. Elle va tout d’abord reconnaître un récepteur à la surface de la cellule hôte. La nature de ce récepteur est inconnue pour VSV et reste un sujet de débat pour le virus de la rage [15, 16]. Pour ce dernier, de nombreuses molécules telles que des gangliosides [17], des phospholipides [18], le récepteur nicotinique de l’acétylcholine [19], la molécule d’adhésion neuronale NCAM [20] ou le récepteur du NGF de basse affinité (p75) [21] pourraient permettre l’entrée du virus.

Après liaison à son récepteur, le virus entre dans la cellule par la voie endocytique. Cette étape est suivie par la fusion de la membrane virale avec la membrane de l’endosome. La fusion est catalysée par la glycoprotéine G et déclenchée par l’acidification de la vésicule d’endocytose. Les propriétés de fusion de nombreux rhabdovirus ont été étudiées. La dépendance en pH est très semblable d’un virus à un autre et la fusion est optimale autour de pH 6 [22-24]. La pré-incubation du virus à bas pH en absence de membrane cible conduit à l’inhibition complète de la fusion virale. De façon remarquable, cette inhibition est réversible et une nouvelle incubation du virus à un pH supérieur à 7 lui permet de retrouver son activité de fusion [25]. Cette propriété est la différence principale entre les propriétés de fusion des rhabdovirus et celles des autres virus fusionnant à bas pH pour qui l’inhibition de l’activité de fusion en milieu acide est irréversible [26].

Il a été montré que G existait sous au moins trois états [22, 27], pouvant être distingués par leurs caractéristiques biochimiques et biophysiques, qui sont : l’état natif ou pré-fusion majoritaire à la surface du virus au-dessus de pH 7 et impliqué dans la reconnaissance du récepteur ; l’état activé, plus hydrophobe, qui interagit avec la membrane cible au début du processus de fusion [28] ; et, finalement, l’état post-fusion qui a une réactivité distincte des deux précédents vis-à-vis des anticorps monoclonaux [25]. Il existe un équilibre dépendant du pH entre ces différents états de G [29]. Il est déplacé vers la forme post-fusion à bas pH. L’existence de cet équilibre, qui explique la réversibilité de l’inactivation des propriétés de fusion, indique que la conformation native n’est pas métastable. En fait, la réversibilité du changement de conformation induisant la fusion est essentielle : elle permet à la glycoprotéine nouvellement synthétisée d’être transportée à travers les compartiments acides de l’appareil de Golgi et de retrouver sa conformation native à la surface des particules virales [30].

Protéines de fusion de classe I et de classe II

Les protéines de fusion de la classe I ont une structure quaternaire trimérique. Chaque sous-unité (ou protomère) constitutive est le résultat du clivage protéolytique d’une protéine précurseur en deux polypeptides. Le fragment carboxyterminal constitue la sous-unité portant l’activité de fusion. À son extrémité aminoterminale (ou près de cette extrémité), se trouve le peptide de fusion hydrophobe qui est enfoui dans une interface entre deux sous-unités lorsque la protéine est dans sa conformation pré-fusion. Dans la conformation post-fusion, ce fragment carboxyterminal présente une structure trimérique caractéristique formée au centre d’un faisceau de trois hélices torsadées (coiled-coil), à l’extrémité aminoterminale duquel sont placés les trois peptides de fusion qui sont alors exposés à la surface de la protéine. Dans les sillons de ce faisceau, viennent se loger de façon antiparallèle les trois segments carboxyterminaux de l’ectodomaine (directement connectés aux segments transmembranaires de la protéine). Dans sa conformation post-fusion, la protéine a donc ses peptides de fusion et ses domaines transmembranaires situés à la même extrémité d’une structure allongée constituée de trois protomères adoptant chacun une conformation en épingle à cheveu (figure 2A).

Les protéines de classe II contiennent les glycoprotéines E et E1 des flavivirus [39, 40] et des alphavirus [41] respectivement. Elles présentent une architecture complètement distincte de celle des glycoprotéines de classe I. Leur peptide de fusion est interne, placé dans une boucle située entre deux brins β. Elles sont synthétisées à partir d’une grande polyprotéine dont elles dérivent par clivage puis se replient sous forme d’un complexe impliquant une seconde glycoprotéine virale (issue de la même polyprotéine) qui joue le rôle de protéine chaperon [42]. C’est le clivage de cette protéine chaperon qui active la protéine de fusion lui permettant par la suite de catalyser la fusion dans l’environnement acide de l’endosome.

Dans leur conformation native (figure 3A), ces protéines forment des homodimères (dans le cas des flavivirus) ou des hétérodimères (dans le cas des alphavirus) qui sont allongés à plat à la surface virale où ils forment un réseau possédant la symétrie icosaédrique [41, 43]. Dans cette conformation, la boucle de fusion est enfouie à l’interface du dimère. Après exposition à bas pH, les dimères se dissocient puis les protomères se réassocient pour former une structure trimérique [44, 45]. Les boucles de fusion et les domaines transmembranaires sont alors situés à la même extrémité d’une molécule allongée qui est maintenant perpendiculaire à la membrane (figure 3B).

Bien que les protéines de fusion de classe I et II aient des structures très différentes, la façon dont elles changent de conformation présente de nombreuses similarités. Dans un premier temps, les peptides et les boucles de fusion sont exposés et projetées en direction de la membrane cible dans laquelle elles vont aller s’insérer. Dans une deuxième étape, le repliement de la partie carboxyterminale contre le trimère constitué des régions aminoterminales permet la formation de la structure post-fusion, en épingle à cheveu, dans laquelle les peptides de fusion sont entourés des domaines transmembranaires [2].

Pour les protéines de classe II et celles de classe I dont l’activité de fusion s’exprime à bas pH, le clivage activateur (de la protéine de fusion pour la classe I, de la protéine chaperon pour la classe II) a lieu dans le trans-Golgi [46, 47]. Ce clivage tardif, qui se déroule en aval des compartiments acides de l’appareil de Golgi, prévient un changement de conformation prématuré de la protéine de fusion lors de la traversée de ces derniers. On voit bien que pour ces protéines, la réversibilité de la transition structurale n’est donc pas nécessaire.

Les propriétés biochimiques, structurales et fonctionnelles de la glycoprotéine des rhabdovirus permettaient de la distinguer des protéines de classe I et II. Clairement, l’équilibre dépendant du pH entre les différentes conformations de G, l’absence de motifs dans la séquence en acides aminés permettant la formation d’un faisceau d’hélices torsadées caractéristiques des protéines de classe I et l’absence de clivage activateur indiquaient que G pouvait définir une nouvelle catégorie de glycoprotéines de fusion.

Structure atomique de la glycoprotéine G

Quatre domaines de G peuvent être identifiés (figure 4A) : un domaine latéral structuré en feuillets β (domaine I en rouge), un domaine central responsable de la trimérisation de la glycoprotéine (domaine II en bleu), un domaine d’homologie à la pleckstrine (domaine III ou domaine PH en orange ; ce type de domaine est rencontré dans un grand nombre de protéines dont le seul point commun est qu’elles se lient à la membrane cellulaire pour exercer leur fonction ; il est aussi impliqué dans de nombreuses interactions entre protéines) et le domaine de fusion (domaine IV en jaune) inséré dans une boucle du domaine III.

À l’extrémité carboxyterminale du domaine de trimérisation (après le résidu 405), il reste 40 acides aminés dans l’ectodomaine grâce auxquels la chaîne polypeptidique rejoint le domaine transmembranaire. La structure de ce segment n’est pas connue au-delà du résidu 413 pour la conformation pré-fusion et du résidu 410 pour la conformation post-fusion.

Une homologie inattendue

Il est difficile d’envisager que des virus à ADN double brin ou qu’une cellule puissent acquérir un gène à partir d’un virus de l’ordre des Mononegavirales. Cela nécessiterait une étape de transcription inverse suivie d’une étape d’intégration. Le scénario le plus simple à envisager est l’acquisition du gène de G, par un ancêtre des rhabdovirus actuels. Durant la phase de réplication, une polymérase pourrait avoir quitté sa matrice d’ARN antigénomique pour aller copier un ARN messager (d’origine cellulaire ou virale en cas de co-infection). Quoi qu’il en soit, le scénario exact conduisant à la présence de gènes homologues chez les herpèsvirus et les Mononegavirales est loin d’être élucidé. Le sujet est d’autant plus complexe que très récemment, la structure de gp64, une glycoprotéine de fusion du baculovirus, a révélé que cette dernière faisait aussi partie de la même famille [51] (figure 4C).

L’orientation des hélices centrales par rapport à la membrane virale dans le cas des structures de gB et de gp64 qui ont été déterminées indique que ces dernières correspondent à la conformation post-fusion. Néanmoins, comme, dans le cas des herpèsvirus, la machinerie de fusion est beaucoup plus complexe (4 glycoprotéines sont nécessaires pour l’entrée virale) [52], l’étendue du changement de conformation de gB ne peut être déduite de la structure de G.

Le changement de conformation de G

En fait, à partir de la structure pré-fusion, on obtient la structure post-fusion en faisant effectuer une rotation d’environ 180° au domaine de fusion et à la partie carboxyterminale de la protéine autour d’un bloc rigide constitué du domaine latéral (DI) de la protéine et de la partie du domaine de trimérisation qui garde sa structure durant le changement de conformation (figure 4A).

Ce changement de conformation est donc très semblable à celui qui a été décrit pour les protéines de classe I comme la glycoprotéine F des paramyxovirus [33, 38] (figure 2C) ou la sous-unité HA2 du virus de la grippe [32] (figure 5B). En particulier, le retournement de la molécule autour du bloc rigide est dû à l’allongement des hélices centrales à leur extrémité aminoterminale, ce qui permet de former le faisceau central du trimère de la structure post-fusion. Comme pour HA2 et F, cela projette le domaine de fusion vers la membrane cible. Les segments carboxyterminaux, quant à eux, adoptent une structure en hélice α et vont se placer dans les sillons du faisceau d’hélice central. Le cœur de la structure post-fusion (figure 5A) a une organisation similaire à celle du motif rencontré chez les protéines de classe I [53] même si dans le cas de G, les hélices centrales ne sont pas torsadées et restent parallèles.

Bien que pour G_th en solution, il semble qu’il soit possible de passer du trimère pré-fusion au trimère post-fusion sans briser la symétrie d’ordre 3, cela semble impossible pour la protéine complète quand elle est ancrée dans la membrane virale. Il semble donc logique de postuler l’existence d’intermédiaires monomériques durant la transition structurale. Cette hypothèse est en accord d’une part avec les grandes variations de l’organisation de l’interface trimérique entre les deux formes et d’autre part avec l’instabilité du trimère pré-fusion en solution et sa tendance à se dissocier en monomères [54, 55].

Sites antigéniques de G

Dans le cas de la glycoprotéine du virus de la rage, l’accessibilité des sites antigéniques dans les deux conformations de G a été étudiée [25, 27, 56]. Si les anticorps spécifiques du site minoritaire a reconnaissent aussi bien les deux formes de la glycoprotéine, il a été montré que les anticorps dirigés contre le site antigénique II ne reconnaissent que la structure pré-fusion de la protéine. Si on utilise la structure de la glycoprotéine G de VSV pour modéliser celle du virus rabique (après avoir aligné leur séquence), on constate que lors de la transition structurale, le site II se déplace depuis le sommet de la molécule vers une position bien moins accessible compte tenu de la densité de glycoprotéine à la surface du virus. À l’inverse, un épitope aminoterminal de la glycoprotéine rabique n’est accessible que dans la conformation post-fusion. Quant à l’anticorps 17 D2 qui ne se lie qu’à la conformation pré-fusion de G [76], on constate que son épitope est situé dans un segment, sans structure secondaire canonique dans la conformation native, qui vient prolonger la grande hélice centrale dans la conformation post-fusion (figure 6).

Interaction entre le domaine de fusion et la membrane

L’alignement des séquences en acides aminés des glycoprotéines des rhabdovirus (figure 7) permet d’identifier les deux boucles de fusion chez chacune d’entre elles. Elles apparaissent assez peu conservées mais contiennent toujours des acides aminés aromatiques. Le rôle essentiel de ces résidus dans le processus de fusion est en accord avec les travaux de mutagenèse dirigée sur la G de VSV [57, 58] et de VHSV [59] mais aussi sur la glycoprotéine gB de divers herpèsvirus [60, 61].

Dans la structure pré-fusion, les boucles ne sont pas enfouies au sein d’une des interfaces de l’oligomère et sont exposées au solvant. En fait, elles sont beaucoup moins hydrophobes que les peptides de fusion aminoterminaux des glycoprotéines de classe I. Bien que les expériences de photomarquage hydrophobe aient démontré la capacité du domaine de fusion de s’insérer dans la membrane cible, la présence d’acides aminés chargés (mais aussi de groupes OH, C=O et NH non impliqués dans des liaisons hydrogènes) au voisinage des boucles exclut toute pénétration profonde dans la bicouche lipidique.

Lorsqu’on analyse les séquences d’acides aminés constituant les domaines transmembranaires des protéines, on constate que les tryptophanes et les tyrosines sont souvent rencontrés à l’interface entre les chaînes aliphatiques et les têtes polaires des lipides [62]. Il est donc probable que ces acides aminés, lorsqu’ils sont dans l’une ou l’autre des boucles de fusion de la glycoprotéine des rhabdovirus, se placent aussi à cette interface.

Cette interaction impliquant un petit nombre de résidus ne constitue pas un point d’ancrage solide. Néanmoins, en perturbant le feuillet externe de la membrane cible, elle doit favoriser la formation de déformations qui pourraient être des précurseurs des stalks [63].

Interrupteurs moléculaires sensibles au pH

La transition structurale étant réversible, il existe un second interrupteur permettant le retour à la forme pré-fusion après incubation de la protéine au-delà de pH 7. Dans la forme post-fusion, un grand nombre de résidus acides sont regroupés dans le faisceau d’hélices centrales (figure 8B). Le cas le plus frappant est celui des trois résidus Asp 268, enfouis côte à côte dans un environnement hydrophobe au sein de l’interface trimérique. Ces résidus sont protonés ce qui leur permet de former entre eux des liaisons hydrogènes. La déprotonation de ces résidus à plus haut pH induit des forces répulsives qui déstabilisent l’interface trimérique et déclenchent le changement de conformation permettant de revenir à la structure pré-fusion. Dans la conformation post-fusion, ces résidus ont un pKa particulièrement élevé (probablement supérieur à 9 dans le cas d’Asp 268 enfoui dans un environnement hydrophobe). En revanche, dans la conformation pré-fusion, ils sont exposés au solvant et retrouvent un pKa voisin de 4. Cela se traduit par une forme post-fusion de plus forte affinité pour les protons que la forme pré-fusion et explique la coopérativité de la transition structurale de G en fonction du pH [29].

Le complexe de fusion des rhabdovirus est constitué d’un grand nombre de protéines

Pour les protéines de classe I et II, la transition structurale étant irréversible, l’énergie libérée lors du changement de conformation d’un seul trimère pourrait être suffisante pour permettre la fusion [67]. Néanmoins, chez les familles virales concernées, de nombreux résultats suggèrent que le complexe de fusion est constitué de plusieurs glycoprotéines [45, 68-70].

Dans le cas des rhabdovirus, l’existence d’un équilibre dépendant du pH entre les différentes formes de la glycoprotéine indique que l’énergie qui est libérée durant la transition structurale d’un trimère unique ne peut pas être suffisante pour mener à bien la réaction de fusion. En fait, le nombre minimal de spicules impliqués dans la formation du complexe de fusion chez le virus de la rage a été estimé autour de 15 [29]. De façon remarquable, le réseau cristallin de type p6 rencontré dans le cristal de la forme pré-fusion (figure 9) est semblable au réseau hexagonal local détecté à la surface de mutants du virus rabique affectés dans la cinétique de la transition structurale, après une brève incubation dans des conditions suboptimales pour la fusion (à 4 °C et à un pH un peu trop élevé) [71]. Il est tentant de penser que ce réseau permet un changement de conformation concerté des glycoprotéines virales.

Conclusions et perspectives

Comme pour toutes les machineries de fusion virale, de nombreuses questions restent sans réponse. Tout d’abord, on ne connaît pas l’organisation du domaine transmembranaire de G. Cependant, on sait que ce domaine joue un rôle important à des stages tardifs de la fusion car la mutation d’une des glycines transmembranaires bloque le processus au stade de l’hémi-fusion [72]. Ensuite, la structure des conformations intermédiaires de G et la façon dont elles coopèrent entre elles pour déformer la membrane sont encore des questions ouvertes [75]. La détermination de la structure des complexes de fusion (constitués des protéines complètes avec leur domaine transmembranaire en association avec les membranes) est désormais un des défis majeurs du domaine.

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