ARTICLE
Auteur(s) :, H-W
Ackermann
Département de biologie médicale, Faculté de médecine,
Université Laval, Québec, Qc, Canada G1K 7P4
En 2001, j’avais publié dans Virologie un article intitulé Le matin
des bactériophages [1], prédisant que les phages étaient appelés à
un brillant avenir en recherche. Qu’en est-il maintenant ?
Quelles sont les tendances de la recherche phagique ? Chez les
phages, il y a actuellement quatre grands sujets de
recherche : l’environnement (écologie et pollution), le rôle
des phages dans la pathogénicité des bactéries, la recherche
fondamentale et la recherche appliquée, comprenant notamment le
rôle des phages dans l’industrie alimentaire et la phagothérapie.
Ces sujets se chevauchent plus ou moins. La fréquence des
publications sur ces sujets, selon 367 articles rapportés en 2003-4
dans la revue Current Contents, est détaillée dans le tableau 1.
Environnement
Écologie
( Tableau 1 )On s’aperçoit que les
bactériophages constituent la forme de vie la plus nombreuse de
cette planète. Avec plus de 5 000 phages étudiés au microscope
électronique [1], ce qui en fait le plus grand groupe de virus
connus, les phages s’avèrent maintenant être dix fois plus nombreux
que les bactéries dans les océans. Le nombre total de phages
caudés, sans parler des autres types, a été estimé à
1030[2].
De nombreuses recherches portent sur la présence et la fréquence
des phages dans les milieux naturels, en particulier la mer, les
lacs alpins et de l’Antarctique, les lagons hypersalins et les
glaces du Grand Nord canadien. Ces recherches sont facilitées par
la technique de l’épifluorescence, apparue en 1995. Elles montrent
que les cyanophages et les phages de Vibrio prédominent dans la mer
et y constituent une population immense. Malheureusement,
l’épifluorescence est une technique peu conclusive. Elle montre
bien que les eaux de mer et les eaux douces sont riches en virus,
mais elle n’indique pas s’il s’agit de bactériophages, de virus
d’algues ou d’autres matériels fluorescents. La technique dite
« métagénomique », qui utilise des sondes moléculaires
faites de fragments génomiques amplifiés, indique que de nombreux
virus des mers contiennent tel ou tel gène, mais ne permet pas de
les identifier. Les recherches portent aussi sur les environnements
extrêmes comme les sources chaudes volcaniques, habitées par des
archébactéries hyperthermophiles. Ces recherches ont été richement
récompensées par la découverte de trois familles virales nouvelles.
Mentionnons des virus ressemblant à des paramyxovirus mais dotés
d’une nucléocapside hélicoïdale à ADN bicaténaire (Globuloviridae)
et des virus capables de produire deux queues après leur libération
de la cellule-hôte (Bicaudaviridae) [5]. Cependant, les recherches
écologiques sont souvent handicapées par la très mauvaise qualité
des microphotographies qui les accompagnent. En effet, il est
parfois difficile de dire de quels bactériophages (ou autres virus)
il s’agit. De telles illustrations sont en effet inutilisables. En
étant méchant, je dirais qu’elles constituent une injure à la
virologie.
Tableau 1 Principales directions de la recherche
phagique de juin 2003 à juin 2004
|
Sujet
|
Articles
|
|
Environnement
|
Écologie
|
14
|
|
Pollution
|
8
|
|
Pathogénie bactérienne
|
|
22
|
|
Recherche fondamentale
|
Phages connus
|
96
|
|
Séquençage
|
22
|
|
Recherche appliquée
|
Étalement (phage display)
|
30
|
|
Industrie alimentaire
|
24
|
|
Phagothérapie
|
12
|
Pollution
Depuis longtemps, on veut utiliser les coliphages à ARN, les
coliphages somatiques et les phages de Bacteroides comme
indicateurs de pollution fécale (humaine ou animale) et de virus
entériques. Les phages étant faciles à détecter, on y voit des
avantages multiples. On continue donc à étudier la fréquence et la
persistence de ces phages dans l’environnement, mais ces recherches
ne sont pas concluantes. En effet, la résistance des phages à
l’inactivation diffère souvent de celle des autres indicateurs de
pollution ou des virus entériques.
Phages et pathogénie bactérienne
Les travaux actuels découlent de connaissances déjà
anciennes : le pouvoir pathogène de certaines bactéries vient
de la présence, dans le génome bactérien, de prophages latents qui
encodent des toxines. Ainsi, on savait que les toxines botuliniques
C et D, la toxine diphtérique et l’entérotoxine staphylococcique
étaient toutes dues à des bactériophages latents. Ces phages
convertissent des bactéries apathogènes en toxinogènes. Les
recherches actuelles ont grandement approfondi le sujet par le
séquençage de génomes bactériens, de phages isolés et de prophages
intégrés. Elles montrent que les prophages forment des « îlots
de pathogénicité » à l’intérieur du génome bactérien [4]. Il
s’agit presque toujours de génomes de phages caudés, donc contenant
de l’ADN bicaténaire facilement intégrable. La plupart des travaux
actuels portent sur les phages de Vibrio cholerae et des
Escherichia coli du sérotype O157:H7 porteuses de la toxine Shiga,
mais on note également des travaux sur les phages de Bordetella,
Pasteurella multocida, de staphylocoques et de streptocoques. Dans
le cas du vibrion cholérique, on s’est aperçu que la production de
toxine dépend de phages filamenteux. Ces phages ont un ADN viral
monocaténaire qui est, et c’est là une découverte assez
sensationnelle, intégré dans sa forme de réplication comme ADN
bicaténaire.
Recherche fondamentale
Phages déjà connus
Un nombre surprenant de publications porte sur des phages
universellement connus. Pour l’année 2003-4, on relève près de 100
articles de ce genre, presque tous très spécialisés. Le phage λ
vient en tête avec pas moins que 34 articles, suivi du T4 (14), de
Mu (11) et du φ29 (8). D’autres célèbres modèles expérimentaux
suivent loin derrrière, ainsi les phages N4, P1, P2, P4, P22, T1,
T5, T7 (17 articles en tout). Les phages à ARN, ceux du type φX174
et les phages filamenteux totalisent 11 articles. Cet engouement
pour les phages λ et T4 paraît étrange puisque chacun d’eux avait
déjà fait l’objet de deux livres. Il ne l’est pas vraiment, parce
que les recherches sur λ portent sur des sujets très actuels comme
l’évolution des phages, les mécanismes détaillés de régulation et
de lysogénisation et la nature des protéines codées par λ,
dépassant de loin l’étude du phage λ proprement dit. Par ailleurs,
même si le génome du T4 a été complètement séquencé, on n’a
identifié que la moitié des 300 gènes de ce phage. Ajoutons que des
techniques de pointe de cryomicroscopie électronique et de
cristallographie ont permis d’élucider le mécanisme d’injection
d’ADN des phages T4 et φ29.
Séquençage et évolution
On a fait durant les trois dernières années des progrès
substantiels dans le séquençage des génomes phagiques. Jusqu’à
récemment, les travaux de séquençage portaient surtout sur les
« petits phages » à ADN ou ARN monocaténaires, tandis que
les progrès étaient très lents chez les « grands » phages
caudés. Grâce aux techniques de séquençage rapide, on connaît
maintenant les génomes de plus de 150 phages caudés. La plupart
appartiennent aux entérobactéries et aux bactéries lactiques.
Beaucoup d’entre eux sont apparentés au phage λ. Il se dégage de
ces travaux l’impression suivante :
- 1. Il existe un vaste groupe de phages
« lambdoïdes », du même type morphologique que λ, ayant
des génomes du même ordre de grandeur et des gènes en ordre
similaire (ce qui facilite grandement leur identification).
- 2. Tous les génomes des phages caudés sont des mosaïques
de gènes.
- 3. Des éléments de ces mosaïques se rencontrent chez les
bactéries et les eucaryotes.
- 4. Les phages procèdent facilement à des échanges de
gènes entre eux et avec des bactéries.
- 5. Ces échanges sont le moteur d’une évolution
horizontale et ne respectent pas toujours les différences
morphologiques entre phages ; cela a pour conséquence que l’on
trouve, par exemple, des gènes du λ (un siphovirus) chez le
myovirus P2 et le podovirus P22.
- 6. Les protéines des phages lambdoïdes montrent des
degrés de similitude qui sont les témoins d’une évolution verticale
par mutation.
- 7. La variété biochimique des protéines capsidiques
semble être infinie.
- 8. À côté des lambdoïdes, il y a un vaste groupe
hétérogène de phages qui semblent constituer plusieurs lignages
évolutifs distincts, par exemple les phages T4 et φ29.
Ces études de séquençage ont donc grandement affiné nos idées
sur l’évolution des phages. On a voulu en déduire une
classification par « modules », soit des groupes de gènes
ou gènes individuels [3]. Cette classification est problématique
car elle laisse de côté des phages comme T4 et φ29, la complexité
des phages (330 gènes chez certains phages de Pseudomonas) et la
tendance des gènes à migrer à travers le monde vivant ; ainsi,
les humains partagent six gènes avec le T4. Elle rappelle une
tentative, avancée en 1983, de classer les virus à ARN
monocaténaire à polarité positive selon leurs gènes codant pour les
protéines de capside, protéase et ARN polymérase, tentative qui fut
abandonnée parce qu’elle aboutissait à une classification de
protéines et non de virus.
Recherches appliquées
Les applications des phages illustrent avant tout combien est mince
la ligne qui sépare recherche fondamentale et appliquée. Cette
distinction semble exister surtout dans l’esprit d’instances
gouvernementales qui, comme au Canada et par le biais de coupures
de subventions, voulaient obliger les chercheurs à faire de la
recherche appliquée. En fait, la recherche fondamentale fournit la
base de toute application et la recherche appliquée pose des
questions fondamentales. On ne peut vraiment pas les séparer.
Étalage (display) de peptides et protéines
Ici, les phages ne sont que des outils qui présentent à leur
surface des peptides ou protéines en vue de leur sélection, le but
ultime étant de fabriquer, par exemple, des réactifs immunologiques
pour le diagnostic clinique. Les phages les plus utilisés sont les
phages filamenteux de la famille Inoviridae, mais on utilise aussi
les phages λ et P1. Leurs utilisateurs sont essentiellement des
immunologistes ou des biochimistes sans lien avec la recherche
phagique proprement dite.
Les phages dans l’industrie alimentaire
Les phages des bactéries lactiques (lactocoques, lactobacilles,
Streptocccus thermophilus) peuvent jouer un rôle néfaste dans
l’industrie laitière, détruisant les semences, interrompant les
fermentations et causant ainsi de grands dommages dans la
fabrication des fromages. Cela a fait l’objet de nombreuses
recherches qui se poursuivent à échelle mondiale. Depuis peu, on
étudie aussi le rôle de phages dans des fermentations autres que
laitières (la choucroute par exemple). Les recherches portent sur
la morphologie, le génome et le mode de vie des phages impliqués,
leur écologie et leur résistance à des agents antiphagiques.
Parallèlement, on essaie de créer des bactéries résistantes aux
phages et on étudie des mécanismes d’avortement de l’infection
phagique. De nombreux génomes de phages et prophages ont été
séquencés et on a obtenu ainsi de précieuses indications sur
l’évolution des phages. On sait maintenant quels types de phages de
lactocoques se rencontrent dans les fermentations, ce qui permettra
d’aboutir à des contre-mesures. Le lien entre recherche
fondamentale et recherche appliquée est particulièrement évident
ici.
Phagothérapie
Ce sujet ancien, qui remonte à Félix d’Hérelle lui-même, est revenu
à la mode. La raison en est la fréquence grandissante des bactéries
résistantes aux antibiotiques. On pratique la phagothérapie des
infections humaines en Géorgie et Pologne ; en outre, on voit
dans la littérature un nombre grandissant d’articles sur la
phagothérapie de maladies bactériennes. Il faut bien dire
qu’environ la moitié de ces articles ne font que vanter la
phagothérapie sans apporter des faits nouveaux. Sur le plan
fondamental, on étudie l’effet des phages sur les cytokines (TNFα,
IL6) et la production d’interféron. Une approche intéressante, qui
évite l’administration de phages complets porteurs de gènes
indésirables, est l’administration d’enzymes lytiques phagiques.
Des articles sur des sujets connexes portent sur la
phagothérapie chez des poissons d’élevage, la biodésinfection
(entre autres d’objets souillés par B. anthracis) par des phages ou
leurs lysines, la « vaccination » par des phages
encapsidant le gène HBs du virus de l’hépatite B et l’utilisation
d’intégrases phagiques pour la thérapie génique. Les phages ont
bien d’autres applications : lysotypie, identification de
bactéries par des phages portant des gènes de luciférase
(diagnostic de la tuberculose ou de mycobactéries résistantes à la
rifampicine, détection de salmonelles ou de Listeria),
identification bactérienne par des sondes d’origine phagique
(lactobacilles), contrôle de filtres, traçage de courants d’eau.
Aucune de ces applications n’est vraiment nouvelle, mais ces
recherches sont d’actualité.
Deux problèmes de taille
Le premier est l’absence ou la qualité de plus en plus mauvaise des
examens au microscope électronique. Cela affecte particulièrement
la recherche environnementale, mais se fait sentir aussi dans la
description de phages nouveaux et dans l’industrie laitière. Par
exemple, les travaux sur les coliphages associés à la toxine Shiga
comprennent peu ou pas de microscopie électronique et on est bien
en peine de deviner de quels phages il s’agit. Même si les phages
sont illustrés par des microphotographies, celles-ci sont souvent
sans dimensions ou franchement redoutables. Le problème vient
essentiellement de la raréfaction des microscopes électroniques (et
des microscopistes), l’acceptation, par les revues, d’illustrations
de mauvaise qualité et la fascination actuelle pour les techniques
de biologie moléculaire, notamment le séquençage d’ADN et de
protéines. On oublie souvent que la microscopie électronique a un
monopole pour la découverte d’éléments structuraux nouveaux. On
note aussi que certaines propriétés de phages, pourtant bien utiles
en taxonomie virale, ont perdu la faveur populaire et ne sont plus
guère déterminées chez les phages. Il s’agit notamment du poids et
de la vitesse de sédimentation du virion, de son pourcentage en ADN
et du degré d’homologie d’ADN entiers.
L’autre problème est celui des restrictions gouvernementales
imposées aux échanges de bactéries. Les phages ont besoin de
bactéries pour se multiplier : plus de bactéries, plus de
phages. Les bactéries ont été classées en groupes de risque selon
leur pouvoir pathogène réel ou imaginaire. Or, les bactéries-hôtes
de très nombreux phages sont des agents pathogènes du groupe 2 ou
pathogènes mineurs qui ne posent pas de problème pour la santé
publique. Ce sont des bactéries ubiquitaires, voire des éléments de
la flore bactérienne humaine, isolées tous les jours dans le monde
entier : des Pseudomonas aeruginosa, des staphylocoques, des
streptocoques et bien d’autres. Même Mycobacterium smegmatis est
considéré comme dangereux. Les restrictions sont à échelle
mondiale : variables, amorphes, gênantes, pernicieuses.
Autrefois, les échanges de bactéries peu pathogènes (et de leurs
phages) ne posaient pas de problème. Ces échanges étaient et sont
vitaux pour la recherche. Aujourd’hui, pour se procurer les mêmes
bactéries, le chercheur doit obtenir des permis d’importation et de
transport et trouver une compagnie aérienne qui veuille bien les
accepter. Ces règlements freinent efficacement l’échange de
bactéries et de phages. Ils ont l’effet pervers de bloquer la
recherche sur les mêmes maladies que l’on veut étudier. Il est
temps de les réviser et d’en exempter les micro-organismes qui
n’entraînent pas de risques pour la santé publique.
Un développement heureux
Le nouveau millénaire est aussi caractérisé par le retour de
l’Europe de l’Est. En effet, on voit un nombre croissant d’articles
venant de pays de l’ancien bloc soviétique : Russie, Hongrie,
Pologne, Lituanie, Slovaquie, Slovénie... Current Contents en
énumère 36 pour l’année 2003-4. Ce sont souvent des articles de
haut niveau, publiés dans les revues de haut calibre. On peut donc
dire que les chercheurs de l’Europe de l’Est sont en train de
rejoindre les chercheurs occidentaux. Le Net et la transmission
électronique de la documentation scientifique y sont certainement
pour quelque chose.
Références
1 Ackermann H-W. Le matin des bactériophages. Virologie
2001 ; 5 : 35-43.
2 Brüssow H, Hendrix RW. Phage genomics : small
is beautiful. Cell 2002 ; 108 : 13-6.
3 Lawrence JG, Hatfull GF, Hendrix RW. Imbroglios
of viral taxonomy : genetic exchange and failings of phenetic
approaches. J Bacteriol 2002 ; 184 : 4891-905.
4 Krylov VN. The role of horizontal gene transfer by
bacteriophages in the origin of pathogenic bacteria. Russ J Genet
2003 ; 39 : 483-504.
5 Rachel R, Bettstetter M, Hedlund BP,
et al. Remarkable diversity of viruses and virus-like
particles in hot terrestrial environments. Arch Virol 2002 ;
147 : 2419-29.
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