ARTICLE
Les virus herpès simplex (HSV) sont
des agents infectieux très fréquemment rencontrés
chez l'homme. Ils sont responsables d'infections ayant des expressions
cliniques variables, allant de la forme totalement asymptomatique à
l'infection généralisée multiviscérale du
nouveau-né, en passant par la méningo-encéphalite
de l'adulte jeune [1]. Dans ces atteintes graves, un diagnostic virologique
rapide s'impose pour confirmer l'étiologie herpétique et
instaurer un traitement antiviral adapté.
La primo-infection herpétique banale
se présente comme une éruption vésiculeuse du revêtement
cutanéo-muqueux, sous la forme d'une gingivo-stomatite pour le
HSV de type 1 ou d'une éruption génitale douloureuse d'allure
vésiculeuse ou érosive pour le HSV de type 2. La primo-infection
est suivie d'une persistance des HSV dans les ganglions sensitifs pouvant
être suivie de réactivation, les virus étant alors
éliminés dans la salive (HSV1) ou dans les sécrétions
génitales (HSV2). Comme les primo-infections, les récurrences
peuvent être asymptomatiques. Leur diagnostic est important, car
elles sont à l'origine de la transmission sexuelle des HSV2 et
HSV1 ainsi que de l'herpès néonatal.
Chez le sujet immunodéprimé,
les formes cliniques de l'infection herpétique sont souvent graves,
avec parfois des récurrences multiples et sévères
évoluant sous forme chronique. Ces patients reçoivent fréquemment
un traitement prophylactique au long cours et quasi systématiquement
un traitement curatif lors des manifestations cliniques de réactivation.
La gravité potentielle des infections herpétiques,
la difficulté du diagnostic dans les formes asymptomatiques ou
atypiques et la nécessité d'un traitement rapide des formes
graves font que le diagnostic de l'infection herpétique doit
être réalisé avec des techniques sensibles, fiables
et rapides. Différents outils diagnostiques sont à la
disposition des biologistes et des cliniciens. Nous nous proposons de
revoir ces différents outils et de définir leurs indications
préférentielles.
Mise en évidence
des virus herpès simplex (tableau
1)
Prélèvement et
mode de transport
La qualité du prélèvement conditionne
la sensibilité et la fiabilité des résultats. Dans
le cas d'une éruption vésiculeuse typique, le liquide
vésiculaire et les cellules du plancher des vésicules
les plus fraîches doivent être prélevées à
l'aide d'un écouvillon par rotation ferme, sans faire saigner.
Dans le cas d'infections asymptomatiques orales ou génitales,
il faut écouvillonner largement la surface de la muqueuse et
recueillir les sécrétions. Les HSV étant fragiles,
l'écouvillon doit être placé ou déchargé
dans un milieu de transport contenant des protéines et des antibiotiques
pour réaliser une culture sur lignée cellulaire. Le milieu
Eagle Minimum Essential Medium (MEM) additionné de sérum
de veau fœtal (1 %), de tampon Hepes (1 %) et d'antibiotiques convient,
de même que des milieux commercialisés comme le milieu
de transport Multi-Microbe Media (M4) permettant aussi la survie des
Chlamydia et Mycoplasma [2]. De meilleurs résultats
sont obtenus lorsque le délai du transport est court, entre 2
et 4 heures, et lorsque la température est comprise entre + 4
°C et + 8 °C. Le milieu de transport pour les techniques immuno-enzymatiques
est différent selon les trousses et les modalités d'utilisation
doivent être exactement suivies. Il est aussi possible de décharger
directement l'écouvillon sur une lame pour réaliser un
frottis, mais ce n'est pas recommandé car cela réduit
les techniques d'examen direct à l'immunofluorescence seulement.
Le liquide céphalorachidien (LCR), prélevé dans
les formes neuroméningées, est recueilli dans un tube
sec pour les recherches directes, mais il requiert pour la culture un
milieu de transport riche en protéines car les HSV sont rapidement
inactivés dans le LCR.
Visualisation des particules
virales
La microscopie électronique est une technique
rapide (environ 15 minutes), mais peu utilisée car lourde, coûteuse
et finalement peu sensible. Elle ne permet pas l'identification du virus.
Elle pourrait être pratiquée par les laboratoires qui peuvent
disposer à tout moment d'un microscope fonctionnel et d'un microscopiste
électronicien disponible, ce qui est une éventualité
fort rare !
Cytologie
L'examen cytologique, après coloration ou
cytodiagnostic de Tzanck, permet de visualiser les lésions cellulaires
dues aux HSV qui se traduisent par la présence d'inclusions éosinophiles
nucléaires entourées d'un halo clair avec une margination
de la chromatine au niveau de la membrane nucléaire. Cet examen
de réalisation aisée est informatif mais non définitif,
car il n'est pas spécifique des HSV.
Détection
des antigènes viraux
Depuis l'avènement des anticorps monoclonaux, de
nombreuses méthodes spécifiques, rapides et faciles à
réaliser, ont été développées pour
la détection des antigènes des HSV. La plus ancienne est
l'immunofluorescence (IF) effectuée sur un frottis des
cellules de la base de la vésicule herpétique ou sur le
culot cellulaire obtenu après avoir déchargé l'écouvillon
dans le milieu de transport. Après fixation avec de l'acétone
refroidie, les anticorps monoclonaux, marqués ou non, sont déposés
sur l'étalement et, dans ce dernier cas, un conjugué marqué
permet de révéler la réaction. La lecture microscopique
est facile et le résultat rapide (1 à 2 heures), montrant
une inclusion nucléaire fluorescente au stade précoce
de l'infection (figure 1)
et une fluorescence diffuse dans toute la cellule à un stade
plus tardif. Cette technique n'est interprétable que si le nombre
de cellules prélevées est supérieur à 20
pour l'ensemble du prélèvement. Les anticorps peuvent
être ou non spécifiques de type [3]. La sensibilité
et la spécificité de l'IF comparées à la
culture sont respectivement de 74 à 100 % et de 85 à 96
% selon les auteurs. Si la spécificité de l'IF est toujours
bonne, sa sensibilité est meilleure lorsque les vésicules
prélevées sont jeunes, particulièrement au cours
des infections primaires avec des lésions sans anticorps locaux
[3]. Elle est inadaptée pour le dépistage d'une infection
asymptomatique lorsqu'il n'y a pas de lésion clairement objectivable
qui puisse être prélevée.
Les méthodes immuno-enzymatiques
(Elisa) de détection d'antigène appliquées aux HSV
ont l'avantage d'être automatisables, mais elles ont un prix de
revient plus élevé que l'IF, surtout pour des recherches
ponctuelles. Le principe général est une immunocapture de
l'antigène sur un support et une révélation par un
deuxième anticorps marqué avec une enzyme. Un test de confirmation
permet d'éliminer les résultats faussement positifs. Un
tampon d'extraction est nécessaire pour libérer les antigènes
cellulaires [4]. Cette technique est réalisable sur des liquides
de vésicules (surtout s'il s'agit d'éléments jeunes),
sur des liquides céphalorachidiens [4], mais elle est moins adaptée
au dépistage d'une infection asymptomatique et, dans ce cas, il
est souhaitable de coupler le test Elisa avec les cultures cellulaires
pour augmenter la sensibilité de la détection [5]. Comme
l'IF, elle peut donner de fausses réactions négatives en
présence d'anticorps anti-HSV dans les produits pathologiques [4].
Dans notre laboratoire, la comparaison de l'IF et de l'Elisa (Wellcozyme,
HSV, Murex), effectuée sur 101 prélèvements cutanéo-muqueux,
a montré une bonne concordance pour les prélèvements
positifs (78,2 %) avec une sensibilité supérieure pour le
test Elisa. Nous avons aussi comparé le test Elisa Wellcozyme,
HSV, Murex, par rapport à la culture cellulaire sur 140 prélèvements
effectués à tous les stades de l'infection et montré
une sensibilité de 67,9 % et une spécificité de 87,0
% pour le test immuno-enzymatique, ce qui traduit une meilleure sensibilité
de la culture cellulaire.
Une méthode de recherche d'antigène par
chimioluminescence dans les liquides céphalorachidiens a été
décrite mais, bien qu'elle soit rapide, elle ne paraît
pas être facilement commercialisable [6].
Détection
du génome viral
L'hybridation in situ a d'abord
été proposée et évaluée pour la détection
des HSV sur des biopsies cérébrales, mais cette technique
manque de sensibilité. Des trousses sont toutefois commercialisées
(HSV Bioprobe d'Enzo Biochem et HSV Disk™ de Diagnostic Hybrids).
L'amplification génique,
et particulièrement la polymerase chain reaction (PCR) est
très utile, voire actuellement indispensable, pour le diagnostic
des infections à HSV. De nombreuses régions cibles peuvent
être amplifiées telles que les gènes codant pour l'ADN
polymérase, la thymidine kinase, la glycoprotéine B, la
glyco-
protéine D et la glycoprotéine G [1].
La détection des HSV par PCR peut
être réalisée selon différentes stratégies
: mise en évidence d'un Herpesviridæ par amplification
d'une zone commune suivie d'une identification de HSV, du virus d'Epstein-Barr
(EBV) et du cytomégalovirus (CMV) sur produit de PCR [7], détection
du génome de HSV suivie de la différenciation du type [8],
détection spécifique du génome de HSV1 ou HSV2 [9].
Enfin, il est possible d'utiliser une PCR
simple ou une PCR nichée (nested PCR). Cette dernière,
plus coûteuse et plus longue, offre une meilleure sensibilité
pour la détection des HSV1 et 2 [10], mais présente plus
de risques de contamination. Une PCR multiplex a aussi été
développée pour les prélèvements génitaux,
permettant de détecter simultanément HSV1 et 2, Hæmophilus
ducreyi et Treponema pallidum [11]. Il existe des trousses
commercialisées de PCR pour les herpèsvirus, dont Hybridowell
HSV1/HSV2, et herpès consensus HSV1, HSV2, EBV, CMV, virus varicelle-zona
et herpès virus humain type 6 (Argène Biosoft).
Quelle que soit la technique utilisée,
le produit de PCR est généralement visualisé en gel
d'agarose par coloration au bromure d'éthidium, puis identifié
par hybridation moléculaire pour confirmer la spécificité
de l'amplification et améliorer la sensibilité du test.
Cette étape importante a été standardisée
par la commercialisation de trousses d'hybridation génériques
(Genetik DEIA, Sorin ; PCR Elisa DIG Detection, Boehringer).
Une amplification génique in
situ a été décrite, permettant la détection
du génome directement dans les tissus [12]. Cette technique délicate
est encore peu utilisée.
La grande sensibilité de la PCR
nécessite l'emploi de procédures rigoureuses comportant
des précautions drastiques pour éviter les contaminations
responsables de faux positifs. Inversement, des résultats faussement
négatifs liés à la présence d'inhibiteurs
de la Taq polymérase dans les LCR, notamment hémorragiques,
ont été décrits [8, 10]. Ces inhibiteurs doivent
être détectés par l'utilisation de contrôles
internes. Ces derniers sont, soit des gènes humains, soit des amplicons
mutés qui sont amplifiés en même temps que la séquence
virale recherchée [13].
La PCR présente un intérêt
incontestable et démontré pour le diagnostic des lésions
cutanéo-muqueuses atypiques [14] et pour le diagnostic de l'encéphalite
herpétique [15]. Ce dernier repose sur l'examen clinique, complété
par l'imagerie, l'électroencéphalogramme et les résultats
virologiques. La détection d'antigènes dans le LCR a une
sensibilité variable de 29 à 67 % selon Guffond et al.
[15], et de 47 % selon notre étude personnelle. Quant à
la sérologie intrathécale, si elle permet de faire un diagnostic
de certitude d'encéphalite herpétique, elle donne cependant
des résultats trop tardifs. Ainsi, dès 1990, la PCR décrite
pour la mise en évidence des HSV dans le LCR a démontré
sa sensibilité (toujours supérieure à 95 %), sa spécificité
et sa rapidité d'exécution dans le diagnostic des encéphalites
herpétiques [8]. Cette PCR est positive dès le début
des signes cliniques et elle permet donc la mise en route rapide d'un
traitement spécifique. Elle est aussi très utile pour déterminer
l'efficacité du traitement antiviral. La conférence de consensus
européenne qui, en 1996, a défini le rôle du laboratoire
dans le diagnostic de l'encéphalite herpétique, recommande
de poursuivre l'aciclovir jusqu'à la négativation de la
PCR-HSV dans le LCR [16]. La persistance d'une PCR positive est un signe
d'évolution défavorable de l'encéphalite herpétique
[17].
Du fait de son excellente sensibilité,
la PCR a permis de démontrer que, outre les méningo-encéphalites
graves, les HSV sont responsables de méningites d'évolution
simple chez l'adulte. Ces méningites sont dues à HSV2 le
plus souvent, mais aussi à HSV1 [18].
Enfin, le diagnostic virologique par PCR
joue un rôle très important dans la prévention de
l'herpès néonatal. La prévalence de l'herpès
néonatal est estimée à 1 cas pour 5 000 naissances
aux États-Unis [1], 1,4 cas pour 100 000 naissances dans les îles
britanniques [19] et 1 à 5 cas pour 10 000 naissances en France
[20]. La prévention de l'herpès néonatal est difficile
chez les nouveau-nés de mères sans antécédent
connu d'herpès génital qui risquent d'excréter du
virus. En effet, la présence d'HSV a été retrouvée
par culture, en l'absence de signes cliniques, chez environ 4 % des femmes
enceintes, et ce taux passe à 9 % lorsque la détection se
fait par PCR [1]. Chez les mères ayant un antécédent
d'infection herpétique, la prévention de l'herpès
néonatal devrait être réalisée par culture
des sécrétions génitales au moment de l'accouchement
[19]. Chez les nouveau-nés infectés, le diagnostic est difficile
car le délai d'apparition des signes cliniques peut dépasser
15 jours et les lésions ne sont apparentes que dans environ un
cas sur deux [19]. La recherche d'HSV chez le nouveau-né (par culture
des prélèvements oculaires et pharyngés) doit donc
être impérativement mise en œuvre dès qu'il y
a une suspicion d'HSV chez la mère ou dans son entourage et devant
tout syndrome infectieux non expliqué de l'enfant (fièvre
isolée, atteinte respiratoire, etc.). Il est actuellement indispensable
d'associer à la culture une détection du virus par PCR.
Si les prélèvements périphériques sont positifs,
même si l'atteinte neurologique n'est pas confirmée cliniquement,
la recherche d'HSV dans le LCR est alors vivement conseillée [17].
La comparaison de la PCR avec la culture a montré
que la PCR est aussi spécifique et souvent plus sensible que
la culture. Sa sensibilité a été évaluée
à 10 1 pfu/ml sur des préparations virales
de titre connu. Sur 246 prélèvements génitaux,
Safrin et al. [14] ont montré une meilleure sensibilité
de la PCR (59,7 % positifs par PCR contre 47,1 % par culture), expliquant
les discordances par le délai d'acheminement et la perte de l'infectiosité
des HSV dans certains prélèvements (croûtes, ulcérations).
De nombreux auteurs ont confirmé les excellentes sensibilité
et spécificité de la PCR par rapport à la culture.
La quantification du génome de HSV, décrite par Hobson
et al. en 1997 [21], a permis la mesure de l'excrétion
virale au cours des infections génitales. Cette quantification,
appliquée aux encéphalites herpétiques, pourrait
permettre d'objectiver la diminution du nombre de copies virales au
cours du traitement.
Isolement des HSV
De nombreuses cellules sont sensibles aux
HSV (Vero, HEp2, MRC5), mais les plus couramment utilisées sont
les cellules diploïdes humaines MRC5. La culture des HSV est très
simple à réaliser et l'isolement sur cellules reste la technique
de référence. Les HSV se multiplient rapidement et ils sont
aisément détectés par l'apparition d'un effet cytopathique
(ECP) en foyers de cellules ballonnisées qui apparaît rapidement,
habituellement après 1 à 4 jours d'incubation à 36
°C, et très facilement reconnaissable (figure
2). La technique d'inoculation par centrifugation des prélèvements
a considérablement augmenté la sensibilité de la
culture, donnant des résultats plus rapides, en moins de 24 heures,
si l'on détecte les HSV avec des anticorps monoclonaux [22]. Dans
notre laboratoire, nous utilisons en routine pour l'isolement des HSV
sur MRC5 la technique de centrifugation des prélèvements
à 400 g, pendant 30 minutes et à la température de
35 °C. Une autre méthode de culture rapide, avec des résultats
équivalents à ceux de la centrifugation, consiste à
infecter des cellules en suspension dans des tubes et à révéler
l'HSV secondairement après 16 à 24 heures d'incubation [23].
Outre la visualisation de l'ECP, la détection des HSV dans les
cellules peut être réalisée par IF ou par immunoperoxydase
à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques ou par hybridation
moléculaire. La détection des HSV par agglutination de particules
de latex sensibilisées sur des cultures cellulaires infectées
a aussi été proposée. Cette technique n'est pas sensible
et ne se positive que lorsque l'ECP atteint au moins 10 % de la nappe
cellulaire [24].
Une détection simultanée
de 2 ou 3 virus dans une même culture par des anticorps marqués
avec différents fluorochromes a été décrite,
donnant des résultats comparables aux cultures séparées,
mais à un coût réduit [25].
Récemment, des lignées cellulaires
BHK et MRC5 ont été génétiquement modifiées
pour la détection enzymatique de leur infection par les HSV (système
ElvisTM, BioWhittaker).
Un transgène, constitué du gène lacZ placé
sous le contrôle d'un promoteur inductible par les protéines
virales, a été introduit dans la lignée cellulaire.
Lors de l'infection par HSV1 ou 2, le promoteur du transgène est
activé, entraînant la production de b-galactosidase qui,
en présence de X-gal, colore en bleu la cellule infectée,
cette coloration étant détectable en microscopie optique
avant l'apparition de l'ECP [26].
Même si les techniques de détection rapide
sont aussi performantes que la culture sur cellules, l'isolement des
souches virales est indispensable pour pouvoir déterminer leur
profil de sensibilité aux antiviraux.
Sérodiagnostic
Dans de nombreux cas, le diagnostic sérologique
d'une infection herpétique n'a pas une grande valeur, les anticorps
anti-HSV étant inexistants au moment des signes cliniques lors
de la primo-infection. Dès lors, la décision thérapeutique
dans un contexte d'urgence ne peut attendre les résultats de la
sérologie. Le dosage des anticorps permet toutefois de déterminer
la prévalence des infections dans la population générale,
sous-estimée du fait des infections asymptomatiques [1]. Il permet
aussi d'évaluer le statut immunitaire vis-à-vis des sérotypes
HSV1 et HSV2 de populations ciblées, comme par exemple les jeunes
femmes en âge de procréer. Il est aussi intéressant
pour assurer le suivi des femmes au cours de la grossesse et dépister
une éventuelle primo-infection ou une récurrence à
HSV1 ou HSV2. Les méthodes les plus utilisées pour la mesure
des anticorps anti-HSV sont l'IF, l'Elisa, la neutralisation et l'hémagglutination
passive [1]. L'IF et l'Elisa permettent la détection des IgM, témoins
d'une infection active. La tendance actuelle est la mise au point de tests
capables de différencier les anticorps anti-HSV1 et 2, en utilisant
comme antigènes des glycoprotéines purifiées spécifiques
de type [27]. D'autres méthodes ont été proposées
comme le western-blot avec mesure quantitative des anticorps par densitométrie
[28], ou un immunodot enzyme assay (IEA) utilisant des glycoprotéines
purifiées fixées sur des disques de nitrocellulose [29].
Le dépistage est réalisable par un test Elisa utilisant
des antigènes bruts suivi d'un immunoblot avec des glycoprotéines
purifiées [30]. Le western-blot détecte des IgM anti-gpG2
présentes lors des primo-infections et absentes au cours des récurrences
[31]. Comparée à la microneutralisation, cette technique
est plus sensible et spécifique de type, mais elle est relativement
lourde et difficilement applicable en routine. Il serait souhaitable de
disposer de trousses permettant, par une technique automatisable, de différencier
les anticorps anti-HSV1 et 2 et de faire la preuve d'une primo-infection.
Des trousses sont en cours d'évaluation [32] ; cependant, aucun
test permettant le titrage des anticorps
spécifiques des HSV1 et HSV2 n'est actuellement commercialisé
en France.
L'intérêt potentiel de la
sérologie herpétique est de diagnostiquer les infections
asymptomatiques à HSV et d'en déterminer le sérotype.
Cette sérologie permet aussi de réaliser une surveillance
épidémiologique par l'évaluation de la prévalence
des infections à HSV, reflet indirect du risque d'autres maladies
sexuellement transmissibles [1].
CONCLUSION Les
méthodes virologiques actuelles permettent de réaliser facilement
et rapidement le diagnostic des infections herpétiques. Ce diagnostic
est d'autant plus important qu'il entraîne une sanction thérapeutique
qui a changé le pronostic des infections neuroméningées
et/ou néonatales. La PCR et les techniques directes comme l'Elisa
ou l'IF ont considérablement augmenté la rapidité ainsi
que la sensibilité de la détection des HSV dans tout type
de prélèvement. Actuellement l'isolement des HSV, qui est
la technique de référence, reste indispensable pour l'évaluation
de la sensibilité des souches aux antiviraux chez les patients immunodéprimés.
Les indications respectives des techniques citées sont résumées
dans le tableau 2.REFERENCES
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