Virus et sperme : implications en assistance médicale à la procréation

ARTICLE

De nombreux fluides corporels humains, en particulier le sperme et les sécrétions génitales féminines, peuvent contenir des virus excrétés par l'organisme [1]. Ces virus sont habituellement transmis lors de rapports sexuels non protégés, mais peuvent aussi l'être dans le cadre d'actes médicaux de procréation médicalement assistée (AMP) [2]. Tous les virus transmis par voie sexuelle sont potentiellement concernés mais, actuellement, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH1) et le virus de l'hépatite C (VHC) posent des problèmes particuliers de prise en charge en AMP. Cela est lié au pronostic des infections qu'ils provoquent et à la grande fréquence des sujets infectés par le VHC (prévalence de 1 à 2 %). Les autres virus (VHS, CMV, HHV8, HPV...) ne sont cependant pas à négliger et doivent être pris en compte dans les mesures préventives.

VIH1 et sperme

Depuis le début de la pandémie d'infections à VIH1, il est clairement apparu que le virus pouvait se transmettre par voies sexuelle et sanguine. La transmission homosexuelle fut la première identifiée. La transmission hétérosexuelle s'est ensuite rapidement affirmée pour devenir prépondérante dans de nombreux pays. Le VIH1 a été logiquement retrouvé dans le sperme, les sécrétions vaginales de sujets infectés et de nombreux autres liquides organiques [3]. Il n'y a pas à ce jour de travaux publiés sur l'excrétion séminale du VIH2. Pour des raisons pratiques, la plupart des études se sont essentiellement intéressées au VIH1 présent dans le sperme. En effet, les prélèvements au niveau du tractus génital féminin sont difficiles à standardiser.

Le VIH1 est mis en évidence dans le sperme de plus de 65 % des sujets infectés ne recevant pas de traitement antirétroviral [4, 5]. Il peut être présent sous deux formes (figure 1) : des particules virales libres dans le plasma séminal ou sous forme associée aux cellules, soit par adsorption à la surface, soit par infection de ces dernières. L'ARN génomique présent dans les virions est en général plus fréquemment détecté dans le sperme (63 %) que l'ADN proviral VIH1 associé aux cellules (47 %) [6]. En cas d'infection, une ou plusieurs copies de l'ADN proviral sont intégrées de manière aléatoire dans le génome cellulaire. Ainsi, certaines cellules cibles du VIH sont présentes en quantités variables dans le sperme [7-9]. Ce sont en particulier les lymphocytes, les monocytes, les macrophages et cellules dérivées. Cependant, d'autres cellules du sperme pourraient être le support de l'infection à VIH. Il faut noter qu'après de nombreuses études dont les résultats sont parfois contradictoires, il est actuellement admis que les spermatozoïdes humains matures ne sont pas infectés par le VIH1 [10, 11]. Ces données sont concordantes avec l'absence de contamination décrite lors de l'utilisation en AMP de spermatozoïdes préparés. En revanche, les virions semblent pouvoir s'adsorber sur diverses cellules dont les spermatozoïdes, ce qui expliquerait la détection en microscopie électronique ou par hybridation in situ, dans certains modèles in vitro, de particules virales sur ces derniers [12] ou sur les cellules germinales souches. De plus, l'absence de modification de l'excrétion des virions et des cellules infectées après vasectomie est en faveur d'une production distale dans le tractus génital masculin [13], en particulier au niveau des vésicules séminales et de la prostate.

L'origine du virus présent dans les sécrétions génitales est encore mal connue. Il semble provenir d'au moins deux sources : la diffusion de particules virales et de cellules infectées à partir des compartiments sanguins ou lymphatiques et la production locale dans l'appareil génital par des cellules infectées. Plusieurs études ont décrit, chez certains patients, des populations de VIH sanguines et séminales génétiquement différentes [14, 15]. Cette compartimentation semble liée à une production locale et parfois intense de virus. La présence de leucocytes en grande quantité dans le sperme est associée à une production locale et importante de virions, mais ne suffit probablement pas à expliquer la compartimentation virale. Celle-ci pourrait être due à trois paramètres : le statut immunitaire particulier de l'appareil génital, l'infection d'autres types cellulaires que ceux produisant les virions sanguins ainsi que la diffusion réduite de certains antirétroviraux dans le tractus génital [16-18].

La charge virale séminale est classiquement associée à une immunodépression sévère, elle-même associée à une virémie élevée et au stade sida de l'infection [19-21]. Les niveaux de charge virale dans le plasma séminal sont globalement inférieurs à ceux rencontrés dans le plasma sanguin. Cependant, dans la plupart des études, la charge virale séminale reste modestement corrélée à la charge virale sanguine [5]. Les traitements antirétroviraux efficaces (ARN < 20 ou < 200 copies/ml de plasma sanguin) réduisent logiquement et de manière importante l'excrétion séminale du VIH [22, 23], mais la décroissance de la charge virale séminale est retardée par rapport à la charge virale plasmatique. Ainsi, il n'y a pas de corrélation individuelle entre l'indétectabilité de l'ARN du VIH1 dans le sang et celle dans le sperme [24]. Environ 30 % des sujets ayant une virémie VIH1 indétectable peuvent excréter du VIH, probablement du fait d'une production locale indépendante [4], cela même sous traitement antirétroviral efficace durable [25]. La détection de cellules infectées est également possible dans les mêmes conditions [26]. Cette excrétion virale peut également être intermittente et, dans certains cas, associée à une infection ou à une inflammation génitale symptomatique ou non [9]. Dans ces cas, la présence de leucocytes dans le sperme est en général rapportée. Ainsi, une trithérapie efficace réduit de manière importante la fréquence de l'excrétion du VIH1 dans le sperme, mais la présence résiduelle du virus ne peut être exclue du fait d'une possible production locale de virions. Ce risque résiduel impose le recours à la procréation médicalement assistée pour tous les hommes infectés dont la partenaire est séronégative.

VHC et sperme

La présence du VHC dans le sperme, contestée pendant de nombreuses années, semble actuellement de plus en plus admise [27]. Plusieurs équipes françaises retrouvent de l'ARN-VHC dans le plasma séminal de patients infectés par le VHC [28, 29] ou co-infectés par le VIH et le VHC [30]. Chez les patients co-infectés par VIH1 et VHC, le niveau de virémie VHC n'est pas corrélé avec l'excrétion dans le sperme [travaux soumis]. Selon les études, 10 à 35 % des patients seraient excréteurs. Les charges virales séminales semblent faibles, ce qui pourrait en partie expliquer le faible taux de transmission sexuelle observée pour le VHC [31]. Il faut cependant noter que la détection d'acide nucléique viral dans un compartiment ne préjuge pas de l'infectiosité de celui-ci [32]. Cette dernière ne peut pas actuellement être évaluée pour le VHC faute de système de culture cellulaire efficace. Le VHC est retrouvé dans le plasma séminal, mais l'infection de cellules séminales n'a jamais été mise en évidence jusqu'à présent (figure 1). Dans de très rares cas, le VHC pourrait être associé aux cellules probablement par adsorption à leur surface [29]. Ces données préliminaires doivent être complétées pour déterminer les facteurs associés à l'excrétion.

Les autres virus [1]

De nombreux virus peuvent être présents dans le sperme [1] et transmis par voie sexuelle ou éventuellement lors d'AMP (tableau 1). Les virus de la famille des herpesviridae sont fréquemment retrouvés. Le cytomégalovirus (CMV) peut, s'il est transmis à une femme, induire une primo-infection avec une infection congénitale sévère de l'enfant. Son excrétion est souvent favorisée par l'infection par le VIH1 [33].

Problèmes techniques liés à la recherche de virus dans le sperme

La mise en évidence des virus dans le sperme ou ses fractions fait appel principalement à la biologie moléculaire, en particulier à la PCR [45]. Cette technique d'amplification a l'avantage d'être sensible et spécifique, à condition d'éviter toute contamination et d'éliminer l'influence d'inhibiteurs. En effet, le plasma séminal est un milieu particulièrement riche en inhibiteurs. Les échantillons de plasma séminaux peuvent être dilués, puis les particules virales concentrées par centrifugation à haute vitesse (20 000 g) avant une extraction classique de l'acide nucléique viral. D'autres méthodes, comme la méthode de Boom sur silice, permettent d'obtenir des acides nucléiques de grande pureté. Des contrôles d'extraction et d'amplification internes ou à défaut externes sont nécessaires pour valider ces étapes et éliminer la possibilité d'une inhibition. Les tests utilisés sont pour la plupart adaptés de ceux commercialisés pour le plasma sanguin ou les leucocytes [45]. Ceux pour la mesure de la charge virale plasmatique sanguine (VIH1 Monitor™) permettent ainsi de quantifier les ARN-VIH1 extraits à partir du plasma séminal. Pour les tests qualitatifs, des techniques moins automatisées d'amplification par PCR peuvent également être utilisées. L'ensemble de ces tests permet d'amplifier des portions de génomes viraux à partir d'ARN (VIH1, VHC), d'ADN (VIH1) et parfois des deux types d'acides nucléiques. Les séquences virales amplifiées sont ensuite le plus souvent détectées par hybridation moléculaire avec une révélation enzymatique donnant une coloration en cas de détection positive. L'ensemble de ces techniques renseigne uniquement sur la présence de génomes viraux, mais pas sur l'infectiosité de ceux-ci (virus défectifs, volume de l'inoculum...). Le volume de plasma séminal et le nombre de cellules testées doivent être suffisants pour assurer une bonne sensibilité, cela malgré la nécessité de préserver du matériel pour une éventuelle AMP ultérieure. De plus, les délais actuels pour obtenir un résultat de qualité nécessitent la congélation des spermatozoïdes avant usage. Dans un avenir proche, les techniques de quantification en temps réel et un personnel adapté devraient permettre de réaliser les tests sur des spermatozoïdes frais.

Les autres techniques comme la culture virale (virus cultivable uniquement) et la microscopie électronique peuvent être également utilisées [46]. Elles sont actuellement abandonnées pour les recherches de VIH1 dans ce cadre du fait de leur lourdeur [47] et de leur faible sensibilité.

Réduction du risque viral par la préparation des spermatozoïdes

L'élimination du plasma séminal contenant les particules virales (VIH, VHC...) et des cellules séminales (autres que les spermatozoïdes) potentiellement infectées (VIH, CMV...) permet une réduction importante de la charge infectieuse, rendant indétectable dans la plupart des études le matériel génomique viral dans la fraction finale de spermatozoïdes ainsi obtenue. Les spermatozoïdes isolés, lavés et contrôlés sur le plan virologique qui sont utilisés en AMP présentent alors un risque infectieux très fortement réduit, considéré comme négligeable, donc acceptable.

Les techniques de préparation des spermatozoïdes comprennent plusieurs étapes décrites dans la figure 2. Elles correspondent au « lavage de sperme ».

- Une première étape de préparation des spermatozoïdes : la séparation des cellules sur un gradient de densité (2 ou 3 couches de densité croissante de Percoll ou de Puresperm™). Le sperme ou la fraction cellulaire lavée sont déposés sur le gradient avant centrifugation. Les cellules les plus denses, en très grande majorité les spermatozoïdes normaux et matures, se retrouvent dans la fraction la plus dense. Les autres cellules et les spermatozoïdes anormaux restent dans les fractions supérieures.

- Une deuxième étape : la migration ascendante. La fraction la plus dense contenant les spermatozoïdes est lavée, centrifugée et couverte de milieu de culture. Le tube est placé à 37 °C et incliné pour permettre aux spermatozoïdes mobiles de diffuser activement dans le milieu. Une fraction superficielle de ce dernier est alors prélevée pour recueillir les spermatozoïdes mobiles utilisables après un dernier lavage pour l'AMP. Cette dernière étape n'est pas réalisée par tous les laboratoires.

Plus la purification est importante, plus la perte en spermatozoïdes est bien sûr conséquente et peut conduire à multiplier les prélèvements pour compenser ces pertes. Des génomes du VIH1 peuvent être détectés dans certains cas lorsque seule l'étape de centrifugation sur gradient est réalisée [10]. Ces méthodes sont actuellement uniquement validées sur le plan expérimental pour le VIH [48] et partiellement pour le VHC [30].

Réduction du risque par le choix de la technique d'AMP

La technique d'AMP en elle-même peut encore réduire le risque théorique de transmission. Un éjaculat moyen contient 400 millions de spermatozoïdes, du plasma séminal et d'autres cellules. La réduction du risque est liée à la quantité de spermatozoïdes utilisée par chacune des techniques envisageables et à l'optimisation des chances de grossesse permettant de réduire le nombre de tentatives.

En insémination intra-utérine (IA), environ 2 millions de spermatozoïdes sont utilisés. Une stimulation ovarienne est en principe utilisée pour augmenter les chances de grossesse et ainsi réduire le nombre d'inséminations. Les taux de grossesse sont d'environ 20 % par cycle d'insémination, taux supérieurs à ce qui est observé pour les couples hypofertiles. L'IA est la moins coûteuse des trois techniques d'AMP disponibles. Elle a été utilisée avec succès pour les couples sérodifférents pour le VIH par une équipe milanaise [49], trois équipes barcelonaises [50], une équipe londonienne et une équipe toulousaine dans le cadre du protocole ANRS 096 [30].

Les deux autres techniques sont plus lourdes et réservées, en dehors du contexte de risque d'infection à VIH, à des indications particulières.

En fécondation in vitro, quelques centaines de milliers de spermatozoïdes sont mis en présence d'ovocytes. Les embryons obtenus sont ensuite transférés ou congelés.

En cas d'injection intra-ovocytaire de spermatozoïdes (ICSI), un seul spermatozoïde est injecté dans un ovocyte. Cependant, doivent être pris en considération la lourdeur, le coût de la technique et les éventuels effets secondaires. La faisabilité de cette approche a été évaluée dans le cadre du protocole ANRS NECO (Necker-Cochin) et par d'autres équipes [51, 52]. Elle est actuellement réservée aux cas pour lesquels il est impossible d'utiliser les deux autres méthodes, par exemple, lorsqu'un nombre très réduit de spermatozoïdes est obtenu après le processus de préparation.

L'ensemble des équipes totalisent plus de 3 000 actes d'assistance médicale à la procréation (inséminations, fécondation in vitro et ICSI) sans contamination par le VIH rapportée et avec des taux de grossesses élevés proches de 15 à 20 % par cycle [53].

Prise en charge pratique du risque viral en AMP

Ce risque est bien réel, même si un faible nombre de cas de transmission de virus ont été signalés : VHS, VIH [54], VHB.

En plus de la sérologie syphilitique, un panel de sérologies virales est systématiquement réalisé chez les donneurs de sperme (VIH1, VIH2, CMV, HTLV1 et 2, VHC, VHB) [55]. Les donneurs sont également contrôlés 6 mois après le don (en France la loi impose au moins 6 mois de mise en quarantaine) afin de détecter une éventuelle séroconversion.

Pour les AMP intraconjugales, le contrôle des sérologies VIH1, VIH2, VHC, VHB et syphilis est obligatoire, ces sérologies devant dater de moins d'un an au moment de la réalisation de l'AMP [55]. La prise en charge des couples sérodifférents devait être réglementairement réalisée dans le cadre de protocoles cliniques. Les conditions pratiques de prise en charge de ces couples sérodifférents pour le VIH, le VHC ou le VHB, et plus généralement pour les sujets à risque viral, ont été précisées en mai 2001 [56]. Désormais, l'arrêté ministériel du 10 mai 2001 permet la prise en charge hors protocoles de ces couples par un nombre limité d'équipes spécialisées. Il précise les procédures biologiques (organisation, matériels...) et les conditions spécifiques de sélection et de prise en charge des couples (nécessité d'une équipe pluridisciplinaire, critères cliniques et biologiques de sélection, choix des techniques d'AMP...), cela dans les cas de couples sérodifférents pour le VIH, le VHC ou le VHB. Ainsi, les hommes infectés par le VIH ne doivent pas être porteurs de pathologies évolutives, avoir un taux de lymphocytes CD4 supérieur à 200/mm³ et une charge virale VIH1 stable depuis plus de 4 mois. Ces éléments sont nécessaires pour s'assurer du pronostic vital de l'infection du futur père.

En pratique, les couples consultent en AMP pour deux motifs très différents : le couple fertile demande une AMP pour réduire le risque de transmission virale au partenaire et donc à l'enfant ; c'est en particulier le cas des couples dont l'homme est infecté par le VIH ; le couple, du fait de troubles de la fertilité, consulte pour une AMP et un des partenaires est porteur d'une infection virale ; c'est en particulier le cas des sujets infectés par le VHC mais aussi par d'autres virus. En dehors de ces deux cas précis, le risque viral persiste et ne doit pas être négligé. Il existe pour les donneurs de gamètes (dont les prélèvements sont soumis à quarantaine dans l'attente du contrôle virologique à 6 mois) et au sein de couples hypofertiles où tout prélèvement doit être considéré à risque (selon les précautions universelles de sécurité).

Au niveau du laboratoire, la sécurité virale doit également être assurée pour les autres échantillons traités et les patients non infectés. Pour cela, le respect strict des précautions universelles doit être observé. Dans certains cas, des postes de travail et des cuves d'azote liquide dédiées sont utilisés pour la préparation et la conservation des échantillons.

Le risque nosocomial ne concerne bien sûr pas uniquement les gamètes qui peuvent être vecteurs, mais également l'ensemble des actes médicaux invasifs (ponctions d'ovocytes, prélèvements sanguins...) associés à la pratique de l'AMP. Deux cas de contamination de femmes incluses dans des processus de fécondation in vitro ont récemment été décrits pour le VHC. Il importe de souligner que ces infections n'étaient pas dues à la pratique du laboratoire, mais aux gestes médicaux associés [57].

CONCLUSION

Dans un contexte où le risque infectieux est de plus en plus considéré comme inacceptable et où les mesures sécuritaires en matière de produits biologiques sont de plus en plus strictes, le risque viral en AMP doit être pris en compte. Les gamètes font l'objet de préparations et doivent répondre à des critères stricts de qualité. En cas de « défectuosité », la responsabilité des personnels de santé les préparant et les utilisant peut être engagée. Une utilisation plus large et systématique de l'ensemble des moyens de réduction du risque viral doit être mise en place. Tout prélèvement devant être considéré à risque, une observance des règles universelles d'hygiène et de sécurité est obligatoire. Des moyens sont nécessaires pour que toutes les structures impliquées soient correctement équipées. Au-delà des moyens, cela impose des échanges importants entre les virologistes, les infectiologues et les spécialistes de l'AMP.

Lorsque l'objectif est de limiter les risques de contamination dans les couples sérodifférents pour le VIH désirant un enfant, l'AMP apporte une réponse avec une efficacité certaine, tant en termes de sécurité virale qu'en termes de grossesses et de naissances. On pourrait dans ce cas parler d'une obligation de moyens afin d'aider les couples demandeurs d'une réduction du risque de contamination de la partenaire et de l'enfant. L'aide apportée à ces couples est liée aussi bien à l'évolution du pronostic de l'infection à VIH qu'à celle des mentalités et permet de lutter contre la discrimination dont ils font l'objet.

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