Place de la détection des papillomavirus humains dans le dépistage et le diagnostic des lésions précancéreuses du col utérin

ARTICLE

Papillomavirus et cancer du col utérin

Le cancer du col utérin correspond à un carcinome épidermoïde (malpighien) dans 90 % des cas et à un adénocarcinome dans 10 % des cas. C'est un cancer d'évolution lente qui est précédé par des lésions intraépithéliales appelées néoplasies intraépithéliales cervicales (cervical intraepithelial neoplasia ou CIN). Ces lésions précancéreuses sont caractérisées histologiquement par une désorganisation de l'architecture de l'épithélium, des atypies nucléaires et des figures de mitoses anormales. Les grades I, II, III ou les termes bas grade et haut grade sont utilisés pour définir la hauteur de l'épithélium malpighien impliquée par ces anomalies (figures 1 et 2). Il n'existe qu'un type de lésion intraépithéliale glandulaire pour l'adénocarcinome appelé adénocarcinome in situ. La lente évolution des lésions intraépithéliales permet de dépister ce cancer avant qu'il ne devienne invasif. Leur traitement entraîne une guérison sans risque de métastases. Le dépistage des lésions précancéreuses se fait par la cytologie qui classe les anomalies selon la terminologie de Bethesda (tableau 1) [1]. Les anomalies cytologiques des cellules malpighiennes (squamous cells) bien définies sont classées soit en lésions malpighiennes intraépithéliales de bas grade (low grade squamous intraepithelial lesion ou LSIL) si elles correspondent uniquement à des koïlocytes (figure 3), soit en lésions malpighiennes intraépithéliales de haut grade (high grade squamous intraepithelial lesion ou HSIL) si ces anomalies affectent des cellules de type basal (figure 4). Les anomalies cytologiques mal définies sont classées en atypies des cellules malpighiennes de signification indéterminée (ASC-US) (figure 5) ou ne permettant pas d'exclure une lésion intraépithéliale de haut grade (ASC-H). Les anomalies des cellules glandulaires sont classées en adénocarcinome in situ ou atypies des cellules glandulaires.

Le cancer du col utérin est fréquent, avec environ 360 000 nouveaux cas diagnostiqués dans le monde en 1990 et 190 000 décès [2]. Il représente la première cause de mortalité par cancer chez la femme dans les pays en voie de développement, où le dépistage n'a pas été mis en place. L'incidence de ce cancer a baissé de manière importante dans les pays où le dépistage par la cytologie existe [3]. Pourtant, même dans ces pays, il reste un problème de santé publique. Dans 60 % des cas, les femmes qui développent ce cancer aux États-Unis n'ont pas eu de dépistage ou l'ont eu de manière trop espacée [4, 5]. Dans 10 % des cas, elles ont eu un frottis mais n'ont pas eu un suivi approprié. Enfin, dans 30 % des cas, elles ont développé un cancer invasif en dépit d'un frottis régulier [4, 5]. En France, environ 3 600 nouveaux cas sont diagnostiqués par an et 1 600 femmes meurent de ce cancer [6]. Les raisons de développer un cancer du col utérin sont les mêmes en France qu'aux États-Unis. Le premier objectif pour diminuer l'incidence de ce cancer est donc d'augmenter la couverture de la population. Le second est certainement d'améliorer l'efficacité de la cytologie chez les femmes ayant un examen cytologique régulier.

Une question d'actualité est la place que pourrait prendre la détection des papillomavirus humains (PVH) potentiellement oncogènes dans le dépistage et le diagnostic des précurseurs intraépithéliaux du cancer du col utérin. Les PVH sont des virus à ADN à double brin d'environ 7 900 paires de bases. Ils infectent le revêtement épithélial de la peau et de certaines muqueuses. Ce tropisme tissulaire se traduit par des interactions spécifiques entre le virus et sa cellule hôte, le kératinocyte. In vivo, la réplication du génome viral et la formation de virions sont étroitement liées au déroulement complet du programme de différenciation des kératinocytes. Cela explique pourquoi la réplication de particules virales in vitro n'a pas encore été obtenue dans les conditions de routine. En l'absence d'un tel système, le clonage moléculaire des génomes viraux à partir de l'ADN extrait de biopsies ou de prélèvements de cellules est une étape nécessaire à la caractérisation de ces virus et à la définition de leur pouvoir pathogène et de leur potentiel oncogène. L'organisation génétique des PVH est caractérisée par l'existence d'un seul brin codant sur lequel ont été identifiés 8 gènes ou exons dont les produits sont mis en jeu dans la réplication du génome viral (E1 et E2), dans la régulation de la transcription du génome viral (E2), dans l'immortalisation et la transformation cellulaire (E6 et E7) et dans la synthèse des protéines de capside des virions (L1 et L2) [7-9].

Plusieurs arguments plaident en faveur du rôle causal des PVH dans l'étiologie et la progression des lésions précancéreuses et des cancers invasifs. Plus de 40 génotypes sont susceptibles d'infecter la muqueuse génitale [10, 11]. Seule une quinzaine d'entre eux (les PVH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) sont mis en évidence dans les CIN de haut grade [10-15] et sont considérés comme potentiellement oncogènes. Le PVH16 est mis en évidence dans 20 % des lésions de bas grade et dans 50 à 60 % des lésions de haut grade. Une patiente infectée par un PVH16 ou 18 a un risque relatif de développer un CIN de 30 à 50 fois plus important qu'une femme qui ne présente pas d'évidence d'infection par un PVH [16, 17]. Le risque de progression d'une lésion de bas grade vers une lésion de haut grade est associé à la persistance d'une infection par un PVH potentiellement oncogène [18, 19].

Il existe également de nombreux arguments expérimentaux qui montrent que les PVH associés aux néoplasies cervicales interviennent dans toutes les étapes de la carcinogenèse et que les oncogènes E6 et E7 ont un rôle central dans ce processus. L'expression des gènes E6 et E7 augmente au cours de la progression tumorale et les transcrits de ces gènes sont détectés dans les cancers invasifs [8, 9]. L'intégration du génome viral au génome cellulaire est observée dans la majorité des carcinomes invasifs. Cette intégration contribue à la dérégulation de la transcription des oncogènes viraux. Les protéines E6 et E7 des PVH oncogènes interagissent l'une avec la protéine p53 et l'autre avec la protéine pRB, qui jouent un rôle central dans la régulation du cycle cellulaire. La dégradation de la protéine p53 qui résulte de son interaction avec la protéine E6 entraîne une instabilité génomique. De plus, il existe des variants du PVH16 qui sont associés avec un risque plus élevé de persistance ou de progression [20].

Les PVH sont largement répandus dans la population normale et on estime qu'au minimum 10 à 20 % des femmes sont infectées de manière latente. Si on les recherche de manière cumulative par PCR, on peut même les détecter chez 50 % des femmes, en particulier pendant la grossesse [21]. Seulement une très petite proportion des femmes infectées par ces virus développe un CIN de haut grade. On connaît mal les mécanismes qui contrôlent les étapes clés de l'expression du potentiel oncogène des PVH que représentent le passage d'une infection latente vers une néoplasie intraépithéliale et la régression ou la progression des CIN de bas grade. Ces mécanismes s'exercent probablement à deux niveaux : la régulation intracellulaire de l'expression du génome viral par des protéines cellulaires et la réaction immunitaire dirigée contre les protéines virales [8, 9]. Des cofacteurs interviennent aussi pour favoriser le développement d'une lésion après une infection par un PVH oncogène, comme l'immunosuppression iatrogène ou acquise (VIH), une co-infection par le virus de l'herpès simplex, l'usage du tabac, la contraception hormonale [22]. Une minorité de CIN et de cancers invasifs ne contiennent pas de séquences d'ADN viral [14, 15]. On ne sait pas si cette non-détection est liée à des tumeurs d'étiologie différente avec un mauvais pronostic, comme certains l'ont suggéré [14].

Les méthodes de détection des PVH

Des méthodes de détection et d'identification se sont développées dans un but épidémiologique, diagnostique ou pronostique. La détection et l'identification des PVH dans les biopsies ou dans les prélèvements de cellules reposent sur la détection de l'ADN viral dans l'ADN extrait du prélèvement par hybridation moléculaire ou par PCR. Les différentes méthodes ont une sensibilité et une spécificité variables et sont complémentaires les unes par rapport aux autres [23].

La détection de l'ADN viral sans amplification

* La technique de southern-blot

La méthode de référence a été pendant longtemps la technique de transfert-hybridation (southern blot hybridization). L'ADN extrait du prélèvement est coupé par une endonucléase de restriction de référence (Pst1). Après électrophorèse, transfert sur une membrane et hybridation avec une sonde nucléique, le plus souvent radioactive, spécifique d'un PVH ou de plusieurs PVH (mélanges de sondes), l'identification du type de PVH est déduite de l'analyse du nombre et de la taille des fragments générés par cet enzyme. Cette technique peut être utilisée dans des conditions variables d'hybridation. Dans des conditions moins strictes d'hybridation, des ADN viraux n'ayant que des homologies partielles avec les sondes utilisées peuvent être mis en évidence, ce qui permet d'identifier un large spectre de génotypes connus ou des PVH non encore caractérisés. Elle permet aussi de mettre en évidence des infections par des types multiples de PVH et d'étudier l'état physique des séquences virales détectées, libres ou intégrées dans l'ADN cellulaire. Cette méthode permet de détecter de 0,2 à 1 copie d'ADN viral par cellule. Ce seuil de détection est compatible avec un rôle dans le mécanisme de la carcinogenèse.

* La capture d'hybride

La technique d'hybridation moléculaire non radioactive appelée Hybrid Capture Assay, commercialisée par Digene Diagnostics, a été agréée comme méthode de détection des PVH par la Food and Drug Administration et commercialisée aux États-Unis et dans la plupart des pays européens [24]. Cette méthode détecte l'ADN viral à l'aide de sondes ARN. La capture des hybrides est réalisée avec un anticorps spécifique des hybrides ADN/ARN ; les hybrides sont ensuite révélés par une approche immunoenzymatique utilisant un substrat qui permet une amplification du signal par un mécanisme de chimioluminescence. La méthode utilise deux mélanges de sondes, contenant l'une que des ARN spécifiques des PVH génitaux non oncogènes (types 6, 11, 42, 43 et 44) et l'autre des ARN spécifiques des PVH génitaux potentiellement oncogènes (types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 et 68). La méthode permet une analyse semi-quantitative de la charge virale. Elle est plus sensible que la technique de southern-blot et détecte environ 5 000 molécules d'ADN viral [24].

* L'hybridation in situ

Cette méthode permet de préserver la morphologie du prélèvement et de localiser l'ADN viral ou ses transcripts au niveau du tissu et de la cellule infectée. Sa sensibilité est de 20 à 50 copies d'ADN viral par cellule [23]. Elle est intéressante pour comprendre la pathogénie du cancer du col, mais n'est pas utilisée pour son dépistage ou son diagnostic.

La détection de l'ADN viral après amplification par PCR

La technique d'amplification en chaîne de séquences d'ADN par la polymérase (polymerase chain reaction ou PCR) est largement utilisée dans la détection et l'identification des infections à PVH [23, 25-28] et permet de mettre en évidence de 10 à 100 copies d'ADN viral. C'est la méthode la plus sensible. La PCR peut se faire en utilisant des amorces dégénérées ou consensus localisées dans une région conservée du gène L1, telles que les amorces MY11/MYO9 [29] ou GP5⁺/GP6⁺ [30] permettant de détecter un large spectre de génotypes. La PCR peut aussi utiliser des amorces spécifiques de type (PVH 6, 11, 16, 18, 31, 33...) [31]. La mise en évidence des produits d'amplification peut ensuite se faire de différentes manières : 1) en hybridant les produits d'amplification avec des sondes oligonucléotidiques consensus ou des sondes spécifiques de type ; 2) en utilisant la technique du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP) basée sur l'identification des ADN viraux en fonction du nombre et de la taille des fragments obtenus après traitement des produits d'amplification par des enzymes de restriction et électrophorèse sur gel d'agarose [32] ; 3) en effectuant le séquençage des produits d'amplification et en comparant la séquence obtenue avec une banque de données qui permet d'identifier les types de PVH et leurs variants [32].

Des approches pour quantifier l'ADN viral sont en cours d'évaluation : les amorces nucléotidiques peuvent être marquées à la biotine et les produits d'amplification sont alors révélés par le complexe streptavidine-biotine et la peroxydase par une méthode semi-quantitative [33]. Une méthode de PCR en temps réel [34] permet également une quantification de l'ADN viral dans les prélèvements [35, 36].

Indications cliniques de la détection de l'ADN d'un PVH

Prise en charge d'un frottis anormal

Le meilleur moyen de prendre en charge les femmes dont le frottis comporte des atypies des cellules malpighiennes mal définies (ASC-US) reste un sujet de controverses [37-39]. Certains cliniciens proposent de suivre ces femmes en répétant un frottis six mois plus tard en se basant sur les arguments suivants. Les anomalies détectées peuvent ne correspondre qu'à des atypies de réparation dans un contexte inflammatoire ou à une métaplasie immature qui sont surévaluées en cytologie. D'autre part, si ces anomalies correspondent à une véritable lésion intraépithéliale de bas grade, beaucoup d'entre elles régressent spontanément sans traitement ou ne progressent que lentement vers une lésion de haut grade. Cette lente évolution permet de suivre ces lésions par la cytologie sans faire prendre de risque à la patiente et permet de traiter seulement les anomalies qui persistent plus de 2 ans. Cependant, 5 % de ces anomalies correspondent à des lésions de haut grade et même parfois des cancers invasifs et certains cliniciens préfèrent d'emblée pratiquer une colposcopie.

La détection de l'ADN d'un PVH a été proposée comme une alternative pour trier, parmi les patientes avec un diagnostic cytologique d'ASC-US, celles qui nécessitent un examen colposcopique [40-44]. L'objectif de ce typage est de détecter dans ce groupe de femmes celles qui ont une infection par un PVH potentiellement oncogène et qui sont à risque d'avoir ou de développer une lésion de haut grade. Des études ont comparé la sensibilité et la spécificité du suivi cytologique et de la virologie par rapport à la biopsie sous colposcopie systématique [40-44]. La sensibilité correspond à la probabilité qu'une patiente qui a une néoplasie intraépithéliale ait un test positif. La spécificité est la probabilité qu'une femme qui n'a pas de néoplasie intraépithéliale ait un test virologique négatif. La virologie a une meilleure sensibilité que le suivi cytologique pour détecter la présence d'un CIN de haut grade (tableau 2). La recherche d'un PVH oncogène pourrait être effectuée parallèlement à la cytologie de contrôle faite par la méthode conventionnelle ou se faire sur le matériel résiduel de la cytologie quand le prélèvement est effectué en milieu liquide [45]. Ce mode de prélèvement permet de faire un étalement des cellules en couche mince ou monocouche par un processus de centrifugation ou de sédimentation. Il permet de faire le test virologique sur une partie du matériel prélevé pour la cytologie et évite une deuxième visite pour la patiente. Les patientes ayant un test virologique positif auraient une colposcopie. Une virologie négative conduirait à un suivi cytologique (tableau 3). En revanche, la spécificité de la virologie est inférieure à celle de la cytologie. Si l'on admet que la prévalence d'un CIN de haut grade est de l'ordre de 5 % chez les patientes ayant un ASC-US, il faut comparer le bénéfice de détecter plus tôt un petit nombre de lésions précancéreuses avec le coût additionnel suscité par des colposcopies chez de nombreuses femmes qui n'ont pas de lésion de haut grade [46]. Des études coût/efficacité doivent être faites dans chaque pays en tenant compte du prix de la colposcopie, de la facilité d'accès à cet examen, du prix de la cytologie en milieu liquide et de celui de la virologie. Elles permettront de choisir entre la recherche d'un PVH, le suivi cytologique ou la colposcopie d'emblée pour une patiente qui a un diagnostic cytologique d'ASC-US (tableau 3). Les défenseurs du test virologique viennent plutôt des États-Unis où le contexte économique est très différent de celui de la France et où la colposcopie et la biopsie ont un coût beaucoup plus élevé.

La détection d'un PVH n'est pas utile pour les patientes qui ont un diagnostic cytologique de lésion intraépithéliale de bas grade ou de haut grade [42, 47], mais pourrait l'être dans certains cas particuliers, comme celui d'une patiente qui a une lésion persistante en cytologie et des biopsies négatives [48]. Peu de données sont à ce jour disponibles pour établir l'intérêt d'un test virologique pour une patiente qui a un diagnostic cytologique d'atypie glandulaire [49]. Enfin, la détection d'un PVH dans le suivi des patientes traitées par conisation pour détecter la persistance ou la récidive d'une lésion est également une indication en cours d'évaluation [50, 51].

Dépistage primaire

Dans le cadre du dépistage systématique des précurseurs du cancer du col utérin, la détection de l'ADN d'un PVH a été proposée, seule ou associée au frottis. La sensibilité de la virologie est le plus souvent supérieure à celle de la cytologie pour dépister les CIN de haut grade (tableau 4) [52-55]. L'absence de détection d'un PVH est associée à un faible risque d'avoir ou de développer une lésion précancéreuse du col et correspond à une valeur prédictive négative élevée. Associée à une cytologie négative, elle permettrait d'espacer l'intervalle de dépistage, améliorant le rapport coût/efficacité du dépistage du col. Plusieurs études sont en cours en Europe et aux États-Unis pour évaluer cet aspect. La valeur prédictive négative de la virologie n'étant pas de 100 % (tableau 4), cela signifie aussi qu'il existe une faible proportion de lésions précancéreuses et de cancers invasifs du col non détectés par la virologie [15]. On ne sait pas si de telles lésions témoignent d'une voie de carcinogenèse non associée aux PVH ou de l'inadéquation des méthodes actuellement utilisées pour détecter l'infection par certains PVH.

La spécificité de la virologie est moins bonne que celle de la cytologie. La détection d'un PVH ne signifie pas la présence d'une lésion clinique, et d'autres examens seraient nécessaires pour différencier les infections latentes des infections associées à une lésion. La fréquence des infections latentes ou transitoires est importante chez les femmes avant 35 ans [15, 56-58]. Dans le contexte d'un dépistage, une approche virologique chez des femmes jeunes conduirait à examiner un nombre important de femmes sans lésion décelable par la cytologie ou la colposcopie. Chez les femmes plus âgées, la persistance d'une infection par un PVH oncogène est un facteur de risque significatif d'avoir ou de développer une lésion [15, 58, 59]. Mais il n'existe pas de consensus sur la prise en charge la plus adéquate pour le clinicien en cas de test virologique positif et de cytologie négative : faire des frottis annuels, répéter le test de détection d'un PVH pour évaluer la persistance de l'infection ou faire d'emblée une colposcopie ?

Certains proposent également le dépistage virologique primaire dans les pays en voie de développement quand il n'existe pas de dépistage cytologique [54]. Là aussi des études de coût/efficacité sont nécessaires pour choisir la mise en place d'un dépistage virologique ou cytologique et mettre en place le suivi et le traitement des lésions associées.

CONCLUSION

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