La cristallographie et l’étude du poliovirus

Les premières structures à haute résolution de virus pathogènes pour l'homme ont été décrites pour deux picornavirus, le rhinovirus (RV) et le poliovirus (PV), en 1985 [1, 2]. Pourtant les premières études cristallographiques portant sur l'organisation des virus datent des années 1950. Peu après avoir décrit la structure de l'ADN, Crick et Watson ont déduit, par analyse des données accessibles à l'époque, certaines propriétés fondamentales des virus. Tout d'abord, partant de l'observation que la capacité codante des génomes viraux était limitée, ils ont suggéré que la capside soit constituée par la répétition d'une unité protéique de base [3]. Ensuite, utilisant des techniques de modélisation, ils ont établi une description préliminaire de l'assemblage de ces sous-unités répétées en coque virale [4]. Ce modèle a été rapidement affiné grâce aux résultats obtenus par diffraction des rayons X sur de petits virus de plantes [5, 6]. Ces études, rapidement suivies par d'autres sur le PV [7], ont montré que tous ces virus possédaient une symétrie icosaédrique. Dans une publication devenue classique, Caspar et Klug [8] ont donné les fondements théoriques selon lesquels seulement deux arrangements géométriques, tubes hélicoïdaux et coques icosaédriques, ont les propriétés nécessaires à la formation d'une couche fermée, composée d'un grand nombre de sous-unités identiques. La cristallographie apportait ainsi, avant même qu'il soit possible de déterminer la structure à haute résolution, des contributions importantes à la compréhension de l'organisation des virus.

Le fait de savoir que les virus sphériques non enveloppés sont formés d'une unité répétitive à symétrie icosaédrique a été essentiel dans la poursuite des études cristallographiques ; cependant il a fallu attendre 20 ans avant d'avoir la description de la première structure à haute résolution d'une particule virale. Les structures de deux virus de plantes, le virus du rabougrissement de la tomate en 1978 [9] et le virus de la mosaïque du haricot en 1980 [10], ont montré qu'un domaine protéique au repliement en tonneau bêta à 8 brins antiparallèles pouvait servir d'unité de construction de la particule icosaédrique. Ces analyses de la structure des virus de plantes ont fourni des informations importantes sur l'organisation générale des virus, comme la manière dont les sous-unités individuelles de capside interagissent pour former la capside virale.

Premières structures

Plusieurs années plus tard, lorsque les structures de deux picornavirus, le PV et le RV, ont été déterminées (figure 1), on a observé avec surprise que la sous-unité de base participant à la construction de l'icosaèdre était un tonneau bêta très similaire à celui trouvé dans le virus des plantes. Il y a néanmoins d'importantes différences entre les virus de plantes et les picornavirus : alors que les virus de plantes sont formés de 180 copies d'une seule protéine de capside, les picornavirus sont, eux, formés de 60 copies de 3 protéines majeures de capside différentes VP1, VP2 et VP3, et d'une protéine mineure, la protéine VP4. Le protomère, cette unité de base de construction des picornavirus, est donc un complexe formé de ces 4 protéines (figure 2). Bien qu'il n'y ait aucune similarité de séquence entre VP1, VP2 et VP3, le repliement de chacune des chaînes est le même. Cet assemblage à partir de 3 protéines différentes offre certains avantages aux virus animaux, telle qu'une surface plus variée, puisque chaque protéine peut muter et évoluer individuellement pour échapper au système immunitaire. En outre, s'il est relativement surprenant de trouver une telle ressemblance entre le repliement des protéines de capside des virus de plantes et les picornavirus, il est tout aussi intéressant de constater l'étroite similitude structurale entre le virus du rhume et celui de la poliomyélite. Cela laisse supposer que le tonneau bêta à 8 brins antiparallèles représente une forme et une taille optimales pour construire un petit virus sphérique.

La question qui se pose alors est : si l'architecture des petits virus icosaédriques est limitée, qu'est-ce qui donne à chaque virus ses caractéristiques uniques ? Il est clair que, si les brins bêta sont contraints à un arrangement défini, les boucles qui connectent les brins ne le sont pas. Les extrémités N- et C-terminales des protéines virales présentent aussi des extensions qui ne font pas partie du tonneau bêta. Ces boucles et ces extensions ont plusieurs rôles. Des études sur le PV ont d'abord permis de localiser les sites antigéniques sur la structure primaire des protéines de capside [11-16], puis de prédire que ces sites étaient accessibles à la surface du virion. Ça n'a donc pas été une surprise de constater que ces sites antigéniques du PV se trouvaient situés dans les zones les plus exposées du virus : les boucles connectant les brins bêta et les extensions C-terminales. Ces boucles et extensions exposées sont, comme décrit ci-dessous, les sites de reconnaissance et de liaison des anticorps et, ne participant pas à l'échafaudage de la structure, elles sont des zones de mutation privilégiées qui permettent au virus d'échapper à la surveillance immunitaire. Les extensions N-terminales jouent en revanche un rôle différent. La plupart du temps, elles se trouvent sous la surface du virus, où elles forment, avec la protéine de capside VP4, un réseau servant à consolider la capside.

La détermination des structures du RV et du PV par cristallographie a permis de mieux cerner les mécanismes qui régissent les interactions entre le virus et son hôte humain. Par exemple, un des aspects majeurs de la virologie des picornavirus, dans les années 1980, était de cartographier la structure antigénique de ces virus et de comprendre comment ils sont capables d'échapper à la neutralisation. Avant la détermination de la structure tridimensionnelle (3D) des particules virales, ce type de travail consistait à déterminer la position des sites antigéniques sur la structure primaire des protéines. Ainsi, on recherchait les substitutions d'acides aminés qui conféraient la résistance des virus mutants à la neutralisation par des anticorps monoclonaux. On pouvait aussi déterminer si les anticorps dirigés contre des peptides synthétiques étaient capables de reconnaître ou de neutraliser le virus. Les études de la structure 3D ont permis de mettre l'accent sur les bases structurales de l'antigénicité [17, 18]. Ainsi, des résidus qui semblaient appartenir à un même site antigénique, tout en se trouvant éloignés sur la séquence primaire, s'avéraient en fait très proches sur la structure 3D. Le fait que des mutations ponctuelles puissent conférer à certains virus la capacité d'échapper aux anticorps a pu être expliqué. Les résidus impliqués se trouvaient en fait soit à la surface du virus, et alors directement exposés aux anticorps, soit à la base d'une boucle. Dans ce cas, ils forçaient celle-ci à adopter une conformation nouvelle.

Retombées

Le fait que les sites antigéniques du virus de la poliomyélite fassent partie des boucles en surface et puissent tolérer des variations de séquence qui permettent d'échapper au système immunitaire a permis d'envisager la construction de virus chimériques. Dans ces chimères, certaines boucles ont été substituées par des séquences provenant de sérotypes différents ou de pathogènes différents [19-27]. On a trouvé que la substitution d'une seule boucle du poliovirus P1/Mahoney par la boucle correspondante poliovirus P2/Lansing 2 donne naissance à un virus capable d'induire une réponse immunitaire pouvant neutraliser les deux souches parentales [21]. En outre, cette substitution de boucles suffit à élargir la spécificité d'espèce du premier virus pour y inclure la souris. La structure de cette chimère a montré que des différences de séquence et donc de conformation dans la boucle substituée pouvaient se propager à d'autres boucles sur la surface du virus [28]. Ces études innovantes ont ainsi ouvert la voie à la construction d'autres virus chimériques, qui pourrait être une alternative à l'obtention de nouveaux vaccins [19].

Stabilité de la capside

Au fil des années, les études structurales sur les picornavirus se sont surtout concentrées sur les parties de la capside qui contrôlent sa stabilité. La capside virale doit remplir deux rôles opposés lors du cycle viral. D'une part, la protection du génome viral lors du séjour extracellulaire, qui, dans le cas du PV, comprend un passage à pH très acide dans l'estomac, doit être assurée par une capside à structure très stable et résistante. D'autre part, après internalisation du virus dans la cellule hôte, la capside doit être capable de se décomposer pour permettre la transcription du génome. Même si la cristallographie nous donne seulement une image statique de la molécule, la corrélation entre ce type d'études et les données biologiques est un outil très puissant pour l'analyse des transitions structurales.

En 1989, la détermination de la structure 3D poliovirus P3/Sabin [29] a permis de donner une explication structurale à l'atténuation du virus. On savait que deux mutations (sur un total de dix) étaient d'importance majeure pour l'atténuation de la souche vaccinale Sabin par rapport à son parent sauvage neurovirulent P3/Leon, l'une de ces deux mutations étant située à l'extrémité 5' non-codante du génome, l'autre sur la protéine VP3. Cette dernière mutation, la substitution d'une sérine par une phénylalanine pour l'acide aminé 91, est aussi responsable du phénotype de sensibilité à la température (ts) du poliovirus P3/Sabin [30, 31]. L'analyse de la structure a montré que, contrairement à la sérine qui est enfouie dans le virus sauvage, la phénylalanine 91 est entièrement exposée à la surface du virus. Étant donné l'effet énergiquement défavorable de solvatation d'une surface hydrophobe comme celle de la phénylalanine, cette substitution réduit vraisemblablement la stabilité thermique de la capside. En diminuant la stabilité de la capside, ce type de mutation pourrait être le facteur principal de l'atténuation du virus et du phénotype ts. Cette hypothèse est renforcée par le fait que des mutations secondaires qui suppriment l'effet ts semblent compenser [31] cette instabilité en créant d'autres interactions favorables. Bien entendu, cette analyse structurelle ne tient pas compte du rôle possible de la seconde mutation dans la région non codante 5'. Curieusement, ces mutations suppressives sont situées majoritairement à distance du résidu phénylalanine 91, à l'interface entre les protomères viraux, qui sont des régions importantes pour la modulation de la stabilité de la capside. Ces observations montrent clairement que la stabilité de la capside résulte de la présence d'interactions antagonistes et qu'une interaction défavorable peut être compensée par une interaction favorable à un autre site, même éloigné.

Assemblage du virus

La connaissance de la structure de capsides vides du PV [32] a apporté une meilleure compréhension du processus d'assemblage viral. Comme le génome viral ne contient qu'un seul cadre de lecture, toutes les protéines du virus, structurales et non structurales, sont générées par maturation d'une seule polyprotéine précurseur. La plupart des protéines individuelles sont fabriquées rapidement par clivage du précurseur par des protéases virales, sauf VP4 et VP2 qui restent initialement associées, formant un autre précurseur appelé VP0. VP0, VP1 et VP3 s'assemblent tout d'abord pour former des protomères qui s'associent ensuite en pentamères (5 copies du protomère). Durant la phase suivante de l'assemblage, il semble que 12 pentamères s'associent pour former la capside virale. Dans le processus normal d'assemblage, VP0 est clivée pendant ou après la formation de la capside [33], par un mécanisme qui nécessite l'incorporation de l'ARN et qui est probablement autocatalytique. Si l'on inhibe la synthèse d'ARN viral, on obtient une accumulation de capsides vides qui contiennent VP0, VP1 et VP3. L'analyse cristallographique de ces dernières a montré qu'en l'absence du clivage de VP0, une grande partie du réseau stabilisateur trouvé à l'intérieur du virus complet est absent [32]. Dans le virus natif, les extrémités C-terminale de VP4 et N-terminale de VP2 se trouvent très proches. Dans les capsides vides obtenues à partir des virions natifs, ces extrémités, même si elles restent connectées, se retrouvent à plus de 20 Å de distance de la position normale. Le clivage de VP0 et l'encapsidation de l'ARN déclenchent donc un réarrangement structural majeur qui bloque la capside dans son état stable. Ce clivage bloque le virus dans son état le plus stable, le préparant ainsi pour l'infection d'une nouvelle cellule ou même d'un nouvel hôte.

La structure des capsides vides a également soulevé de nouvelles questions sur l'incorporation spécifique de l'ARN viral pendant l'assemblage du virion. Bien que certaines analyses de la structure de virus aient mis en évidence des molécules d'ARN relativement structurées, la cartographie expérimentale de la densité électronique du PV et des autres picornavirus n'a jamais décelé plus de quelques nucléotides ordonnés liés à la capside. En fait, cette absence d'ARN structuré n'est pas vraiment une surprise, puisque toute interaction entre la protéine et l'ARN qui soit spécifique à la séquence devrait se produire pour chacun des protomères, donc 60 fois.

Les récepteurs

Les structures de PV et RV déterminées en 1985 ont montré que l'axe de symétrie d'ordre 5 des virus est entouré d'une dépression profonde qui fut appelée canyon. En observant que ce canyon contenait des séquences conservées entre les différents sérotypes de RV, ainsi qu'entre ceux de PV, il semblerait que le site de fixation de ces virus se trouve dans le canyon [2]. De même, il a été suggéré que l'étroitesse du canyon protège le site de fixation en empêchant l'accès aux anticorps et donc la surveillance immunologique autour de cette région [34]. Bien que l'analyse par cryo-microscopie électronique de complexes de RV avec son récepteur ait confirmé que c'est bien dans le canyon viral que le récepteur se fixe [35], une étude récente de RV dans un complexe avec un Fab neutralisant a montré que des anticorps peuvent pénétrer dans le canyon [36]. De même, l'analyse par mutagenèse de PV a indiqué que son récepteur se fixe aussi dans le canyon [37, 38]. Il est vraisemblable que le rôle du canyon est d'augmenter la surface participant aux interactions entre chaque virus et son récepteur.

Les récepteurs pour le RV [39] et pour le PV [40] ont été clonés et identifiés comme étant deux protéines membres de la super-famille des immunoglobulines (Ig). Le récepteur de RV est la molécule intracellulaire d'adhésion 1 (ou ICAM-1). Le récepteur pour le poliovirus, dont le rôle cellulaire n'a pas été déterminé, contient trois domaines extracellulaires, un domaine transmembranaire et un court segment cytoplasmique. Des études par mutagenèse ont permis d'affirmer que les domaines extracellulaires les plus éloignés de la membrane (domaines 1 et 2) contiennent toutes les fonctions spécifiques du récepteur [41-43].

L'assemblage face au désassemblage

La cristallographie nous a donné une image précise des mécanismes par lesquels la capside est stabilisée. En revanche, il a été plus difficile de comprendre comment, à l'intérieur de la cellule, la capside se dissocie pour libérer le génome. Lors de l'interaction avec le récepteur à la surface de la cellule hôte, le PV subit des changements structuraux nécessaires à son infectivité. Il a été proposé que la fixation du récepteur fournit l'énergie nécessaire à la conversion du virus de son état de stockage de l'ARN à son état de décharge de l'ARN [44, 45]. À des températures physiologiques, un produit stable d'interaction entre le PV et son récepteur est la particule de 135S ou « particule A ». Cette dernière particule présente les propriétés d'une structure intermédiaire la rendant apte à l'internalisation cellulaire, même s'il a été montré que sa formation n'était pas absolument nécessaire à une infection virale productive [46]. La particule 135S a perdu la protéine VP4 et expose à la surface l'extrémité N-terminale de la protéine VP1, ce qui augmente son hydrophobicité et diminue sa stabilité. Il a été montré que l'extrémité N-terminale de la protéine VP1, dont les prédictions de structure secondaire indiquent qu'elle formerait une hélice alpha-amphipatique, ainsi que la protéine VP4, connue pour être myristilée [47], sont capables d'interagir avec des membranes synthétiques [48]. En outre, contrairement aux virions natifs, les particules 135S peuvent infecter même des cellules n'exprimant pas le récepteur pour le poliovirus, mais à un rendement plus faible que le virion natif [49]. Ce résultat suggère que cette forme du virus est capable, à elle seule, d'introduire l'ARN dans le cytoplasme.

Il a été montré que plusieurs remplacements mineurs et insertions dans le domaine 1 du récepteur pour le poliovirus affectent la fixation du virus [50]. Des lignées cellulaires établies exprimant ces récepteurs mutants ont été utilisées pour sélectionner des mutants du PV capables de surmonter ce défaut de fixation, et d'infecter ces cellules [38]. Trois mutations dans la capside de ces virus ont été observées : résidus 95 et 160 de VP1 (1095 et 1160), et résidu 142 de VP2 (2142). Ces mutations coïncident avec celles trouvées chez des virus capables d'infecter de façon persistante des cultures de cellules de cerveaux de fœtus humains [51] et des neuroblastomes humains [52], suggérant que ces résidus jouent un rôle important et spécifique lors de l'entrée du virus dans la cellule. La cristallographie a montré que ces mutations provoquaient une série d'effets structuraux, allant du réarrangement d'une boucle (pour 1095) jusqu'à des changements extrêmement subtils (pour 1160 et 2142) [53]. Autrement dit, les mutations 1160 et 2142 ont un très faible effet sur la structure statique du virus. Des tests in vitro ont aussi montré que ces mutants étaient plus disposés à la conversion vers la forme 135S, ce qui suggère qu'une stabilité diminuée de la capside soit le prix à payer par le virus pour s'accommoder aux interactions sous-optimales avec le récepteur. En outre, les résidus impliqués dans ces mutations pourraient jouer des rôles clés dans la structure de l'intermédiaire de désassemblage. Malheureusement, la particule 135S est le seul intermédiaire potentiel à avoir été identifié mais sa forte hydrophobicité a empêché jusque-là toute étude cristallographique, rendant très difficile la détermination des résidus jouant un rôle clé dans sa structure. En fait, le virus transite certainement par quelques autres phases structurales lors de la pénétration cellulaire et du désassemblage, mais ces intermédiaires structuraux sont très instables et de durée de vie très courte, ce qui ne permet pas leur isolement et leur analyse.

Perspectives

Récemment, la structure d'un complexe du RV avec un fragment Fab d'un anticorps a été déterminée [36]. Cela représente la première, et jusqu'à aujourd'hui la seule, structure cristallographique d'un complexe formé d'un virus intact et d'une autre protéine. Cette prouesse technologique laisse espérer que la prochaine étape à franchir dans ce domaine sera la cristallisation d'un picornavirus attaché à un fragment soluble de son récepteur. La détermination d'une telle structure permettrait de décrire en détail les interactions qui participent à la liaison initiale entre le virus et la cellule. De plus, comme chaque picornavirus utilise comme récepteur des structures différentes, l'analyse de tels complexes mettront en évidence la façon dont chaque virus s'attaque au problème similaire de la reconnaissance spécifique.

Pourtant, même un tel avancement ne répondra pas à toutes les questions qu'on se pose. Par exemple, un complexe du PV avec son récepteur devra nécessairement être formé et cristallisé à basse température (4 °C). À plus haute température, l'attachement sur le PV de son récepteur induirait des changements de conformation irréversibles de la particule 135S et la dissociation ultérieure du complexe. Bien que certains changements de conformation de la structure du virus aient lieu même à basse température, les transformations permettant la pénétration dans la cellule ne pourront être observées. Pour contourner le problème de la production des cristaux, des études de la particule 135S à l'aide du microscope cryo-électronique sont en cours (J.M. Hogle, communication personnelle). Malheureusement, en raison de la faible résolution, l'interprétation des résultats ainsi obtenus est plus difficile que celle des données cristallographiques.

Le PV et les autres picornavirus ont prouvé qu'ils étaient des systèmes très riches pour l'étude de la relation entre la structure et la fonction du virus. Malgré le nombre important de questions restées sans réponse, l'avenir de la virologie structurale se trouve dans l'étude des virus de taille plus importante et de structure plus complexe. Grâce aux techniques développées lors de l'étude des picornavirus, auxquelles on a adjoint des moyens de calcul bien plus importants, il a été possible d'analyser les noyaux de certains virus, dont la taille est deux fois et demie plus grande. De même, pour les virus nettement plus grands et sans doute impossibles à cristalliser, de nombreuses protéines participant ou non à la structure ont été étudiées en cristallographie. À partir des structures de la protéase et de la transcriptase inverse du VIH (virus de l'immunodéficience humaine), les techniques avancées de la cristallographie et la chimie organique synthétique ont déjà permis le développement de médicaments plus efficaces. Les structures de l'hémagglutinine du virus de la grippe, sous ses formes à pH neutre et acide, ont permis la description préliminaire du processus de fusion entre les membranes virale et cellulaire, que cette protéine dirige. De plus, les structures de complexes de l'hémagglutinine avec des Fab ont contribué à la compréhension de la neutralisation des virus par des anticorps. Compte tenu de l'intérêt à trouver des traitements antiviraux contre le VIH, la grippe, et d'autres virus, on peut penser que cela n'est qu'un début.

Il est sans doute primordial de constater que l'intense collaboration entre les cristallographes et les virologistes a donné naissance à une spécialité relativement jeune, appelée virologie structurale, qui permet d'intégrer efficacement les résultats des deux disciplines. Cette base solide permet de prédire sans se tromper que la virologie structurale continuera à prospérer.