ARTICLE
Au sein des pharmacies hospitalières, de nombreuses préparations
médicamenteuses sont effectuées en atmosphère contrôlée
: les poches pour nutrition parentérale, les perfusions d'antibiotiques
et d'anticancéreux.
Ces manipulations doivent se faire dans des conditions optimales d'asepsie
afin d'éviter tout risque infectieux. Dans le cadre d'une politique
d'assurance qualité, l'évaluation de la qualité microbiologique
des postes de préparations de médicaments stériles
peut être réalisée par des prélèvements
de surface.
Il faut noter qu'aucune norme sur la qualité microbiologique
des surfaces n'existe actuellement, seule une norme européenne
est en préparation [3].
Différentes techniques de prélèvements de surface
peuvent être utilisées. A la pharmacie de l'hôpital
d'enfants, les deux techniques utilisées sont l'écouvillonnage
à sec au niveau de l'isolateur (préparation des poches nutritives)
et les prélèvements par boîte Count-Tact®
au niveau des flux laminaires et des plans de travail des pièces
de préparation des antibiotiques et des cystostatiques.
L'objectif de cette étude est d'évaluer des techniques
de prélèvements microbiologiques sur des surfaces. Deux
catégories de méthodes de prélèvement sont
évaluées avec du Staphylococcus epidermidis : l'application
directe d'une boîte gélosée (Count-Tact®)
et l'écouvillonnage de surface (écouvillon sec, écouvillon
humide, écouvillon en alginate, écouvillon en Dacron®,
écouvillon en mousse) sur trois types de surfaces (inox, PVC et
latex).
Un rappel sur l'adhésion des bactéries aux surfaces, les
méthodes de prélèvement et les normes sera exposé
dans une première partie. L'étude pratique et son analyse
seront détaillées dans une seconde partie.
Rappels théoriques
Les bactéries sur les surfaces
Les micro-organismes environnementaux sont constitués d'une flore
de base à laquelle s'ajoute éventuellement une flore accidentelle.
La flore de base est omniprésente, très exceptionnellement
pathogène et se compose de bactéries très résistantes
(Bacillus, staphylocoques à coagulase négative et
Micrococcus) ou de champignons (Aspergillus, Penicillium, Mucor)
et/ou de levures (Candida). La flore accidentelle est extrêmement
variable et se compose de micro-organismes potentiellement pathogènes
issus de l'homme tels que les entérobactéries ou le staphylocoque
doré. Ces micro-organismes peuvent se fixer sur un support dans
certaines conditions et le coloniser [6].
Cette fixation bactérienne à un support est liée
à des phénomènes physiques, biologiques et chimiques.
Trois grandes étapes peuvent être décrites lors de
la formation d'un biofilm sur une surface : l'adsorption, la fixation
et la colonisation [1, 7]. L'adsorption est réversible, les forces
attractives mises en œuvre sont d'ordre physique, ponts hydrogènes
par exemple. La fixation (ou adhésion irréversible) est
la formation de contacts entre la bactérie et le support par l'intermédiaire
de polymères extracellulaires, entraînant une adhérence
permanente et irréversible des bactéries sur le support.
Ces mêmes substances favorisent également l'adhésion
des micro-organismes entre eux sous forme d'agrégats. Les bactéries
ainsi fixées, de manière irréversible, sur le support,
vont pouvoir plus facilement survivre et le coloniser. Leur multiplication
et la synthèse des produits extracellulaires réalisent la
formation d'un biofilm.
Les méthodes de détermination de
la biocontamination de surfaces
La détermination de la contamination des surfaces peut se faire
soit par des méthodes indirectes telles que des prélèvements
microbiologiques, soit par des techniques directes comme la quantification
de molécules provenant des bactéries comme l'ATP ou par
coloration (techniques d'épifluorescence). Ces deux techniques
sont inutilisables sur des surfaces stériles car le seuil de détection
est de 100 cellules pour 100 cm2 (sensibilité médiocre).
Nous allons donc envisager les techniques indirectes de prélèvement
de surface.
Les « empreintes » sont une technique de prélèvement
indirecte sur la surface à analyser [2]. Elles peuvent faire appel
au tampon de velours qui manque de sensibilité ou au Pétrifilm®
qui est difficile d'utilisation. L'application de lames gélosées
est difficile à standardiser alors que l'application de boîtes
recouvertes de gélose est une méthode simple, rapide et
facile à normaliser. Le projet de norme européenne CEN/243
normalisera cette technique par application pendant 10 s d'une force constante
de 25 g/cm2 sur la boîte gélosée [9]. Cette
technique convient pour estimer la qualité microbienne de surfaces
planes et lisses, mais ne peut être utilisée pour des surfaces
de petites dimensions, verticales, humides ou fortement contaminées.
Un autre groupe de méthodes indirectes de prélèvement
de surface est représenté par les méthodes d'écouvillonnage.
Cette technique, simple d'utilisation [10], peut être utilisée
pour les surfaces importantes, non absorbantes, irrégulières
ou comportant des recoins et pour lesquelles les techniques utilisant
les boîtes gélosées ne conviennent pas. En revanche,
la reproductibilité est difficile à mettre en œuvre
et son rendement est discutable. En effet, aucune technique ne permet
de récupérer la totalité des micro-organismes présents
sur une surface. Le coefficient d'arrachement (R1) des bactéries
est applicable dans un premier temps lors du « décrochage
» des bactéries du support par l'écouvillon. Dans un
deuxième temps, le coefficient de désorption (R2) s'applique
lors du relargage des bactéries de l'écouvillon dans le
liquide. Le rendement total de l'écouvillonnage (R) s'exprime donc
par le produit de R1 et R2. Le projet de normes européennes CEN/TC
243 normalisera l'écouvillonnage [9] (tableau I) : la zone
4 correspond à une zone blanche, la zone 3 à une zone propre,
la zone 2 à une zone grise et la zone 1 à une zone dite
« sale ».
Deux autres techniques directes de prélèvement de surface
existent mais sont peu utilisées [5] : la méthode par lavage-rinçage-récupération,
non applicable en routine, et le brossage-lavage-récupération,
parfois utilisée en référence, car elle récupère,
après trois passages successifs et l'utilisation de trypsine, près
de 99 % de germes [4].
Matériels et méthodes
Pour étudier les prélèvements microbiologiques
de surface, nous avons limité la comparaison à l'étude
d'un seul germe de l'environnement, facilement mis en culture et dénombré
: un staphylocoque.
A la pharmacie de l'hôpital d'enfants, nous effectuons nos prélèvements
de surfaces :
- au niveau de l'isolateur, sur du PVC (composition de la « bulle
»), du latex (composition des gants), de l'inox (étagères),
du papier (emballage des gants de chirurgie utilisés dans l'isolateur)
et du verre (flacons) ;
- au niveau des flux laminaires, sur le plan de travail en inox.
Nous avons donc limité l'étude aux surfaces composant
les structures de l'isolateur (PVC, inox) et du flux laminaire (inox)
en ajoutant celle des gants (latex) qui sont un élément
important lors de la fabrication des produits médicamenteux.
Nous avons testé les deux techniques utilisées actuellement
à la pharmacie : le prélèvement direct par boîte
Count-Tact® et l'écouvillonnage à sec avec
des écouvillons en coton. Nous avons ajouté l'utilisation
d'écouvillons :
- en alginate : le coefficient de désorption (R2) est théoriquement
de 100 %, la récupération des germes est facilitée
;
- en Dacron® : ses fibres synthétiques inertes
sont intéressantes ;
- en mousse : habituellement utilisés pour les prélèvements
biologiques afin d'augmenter la survie des germes pathogènes dans
ses micro-alvéoles.
De plus, nous évaluerons l'efficacité de l'écouvillonnage
humide.
La température d'incubation de Staphylococcus epidermidis
a été fixée à 30 °C, température
de croissance optimale des germes de l'environnement. Le temps d'incubation
sera de 48 h, temps nécessaire à la croissance de ce germe.
Le nombre de bactéries présentes dans le bouillon initial
est obtenu par l'utilisation d'un bioluminomètre qui détecte
théoriquement 100 % des germes. Il donne les résultats en
RLU (relative light units : intégration de la quantité
de lumière émise pendant 10 s) ou en nombre de bactéries
selon des abaques établies entre les RLU et le nombre d'Escherichia
coli. Les résultats du nombre de germes ne sont pas exacts,
mais ils nous ont permis d'évaluer le nombre de germes déposés
afin d'obtenir un nombre de colonies dénombrables après
prélèvement.
Les écouvillons, après le prélèvement, sont
introduits dans du bouillon nutritif trypticase-soja et agités
1 min au Vortex®. Puis, le bouillon est immédiatement
ensemencé sur une boîte de gélose mise à incuber
en vue du dénombrement.
Le matériel utilisé se compose de :
- la souche de référence de Staphylococcus epidermidis
n° CIP-EPI 6821-189 CIP-EPI 6821-189 (collection Institut Pasteur-Staphylococcus
epidermidis) ;
- les supports : la surface inox est étudiée sur
des plateaux en acier inoxydable, la surface PVC est obtenue en découpant
une enveloppe de l'isolateur de transfert usagée (la Calhène),
la surface latex est réalisée à partir de gants chirurgicaux
(Gammex, Ansell Medical) ;
- les écouvillons en coton (Sayag), en alginate (CML),
en Dacron® (CML), en mousse (Unipath) ;
- les boîtes Count-Tact® (diamètre
de 55 mm) (Unipath) et leur applicateur (BioMérieux). Le milieu
qu'elles contiennent assure une croissance optimale des bactéries
de l'environnement et contient quatre agents neutralisants qui inactivent
les désinfectants résiduels présents sur la surface
à tester ;
- un bioluminomètre (Bioprobe®, laboratoire
AES).
Les six techniques (écouvillonnage avec un écouvillon
sec, humide, en alginate, en mousse et application d'une boîte Count-Tact®)
sont testées en parallèle.
Résultats
Les résultats sont donnés dans le tableau II.
L'étude statistique consiste à comparer les six techniques
ensemble (comparaison globale), puis entre elles (2 à 2) (comparaisons
multiples) (tableaux II à V).
Pour la comparaison globale, le plan d'expérience est à
2 facteurs (la nature de la surface et la méthode) avec une mesure
répétée 10 fois. La variable mesurée est le
nombre de colonies comptées et le test employé est l'analyse
de variance (Anova). Si les variances sont très différentes
(test de Bartlett) avec un nombre de sujets inférieur à
30, on doit utiliser un test non paramétrique de type Anova à
2 facteurs et à mesures répétées : le test
non paramétrique de Friedman. Ce test permet le calcul de z (donnée
statistique).
Pour les comparaisons multiples, les variances sont comparées
2 à 2 dans chaque groupe en utilisant les rangs de classement (test
non paramétrique).
Donc, d'après ces tests statistiques, sur les trois surfaces
étudiées (inox, PVC et latex), il apparaît que les
méthodes d'écouvillonnage à sec en coton, en alginate,
en Dacron® ou en mousse sont d'efficacité comparable,
car il n'existe pas de différences significatives au risque 5 %.
Les deux méthodes écouvillon en coton humide et application
de la boîte Count-Tact® sont également équivalentes.
De plus, le groupe écouvillonnage à sec en coton, en alginate,
en Dacron® et en mousse diffère donc du groupe écouvillonnage
humide et application de la boîte Count-Tact®.
Discussion
Les résultats obtenus sur les trois surfaces (inox, PVC, latex)
ne sont pas différents. Les prélèvements sont ainsi
simplifiés par utilisation d'une même procédure sans
distinction de matériau de la surface échantillonnée.
L'écouvillonnage humide est une méthode de prélèvement
plus efficace que l'écouvillonnage à sec : par analogie
au brossage-lavage-récupération, la supériorité
de l'écouvillonnage humide s'explique par un contact support/écouvillon
amélioré par la présence d'eau.
L'application de la boîte gélosée et l'écouvillonnage
humide sont équivalents. Or Niskanen et al. [8] ont montré
que le prélèvement par boîte Count-Tact®
est meilleur que par écouvillonnage humide. En effet, si nous comparons
les moyennes du nombre de colonies comptées pour un même
nombre de bactéries déposées, nous constatons, comme
ces auteurs, que le nombre de bactéries prélevées
est largement supérieur avec la boîte Count-Tact®
qu'avec l'écouvillonnage humide. Pour démontrer ces résultats
par un test statistique, il aurait fallu augmenter le nombre de manipulations
afin que les variances diffèrent peu et que les résultats
puissent être analysés par des tests statistiques paramétriques
de type Anova et test de Student.
Étant donné ces résultats, ces deux techniques
de prélèvement de surface, écouvillonnage humide
et application d'une boîte Count-Tact®, peuvent être
utilisées.
Notons qu'il est plus facile de standardiser l'application de la boîte
Count-Tact® que l'écouvillonnage : la force d'application
sur la boîte est déterminée par une masse alors que,
sur l'écouvillon, elle dépend du manipulateur. Il est donc
conseillé d'utiliser en priorité la boîte gélosée
pour les prélèvements bactériologiques effectués
en routine.
L'application de la boîte gélosée ne peut pas être
effectuée dans les conditions suivantes : pour une surface inaccessible,
rugueuse, humide, ou quand tout dépôt de milieu nutritif
sur une surface peut être dangereux, comme par exemple lors d'une
utilisation dans une enceinte close tel qu'un isolateur. Dans ces conditions,
l'écouvillonnage humide est utilisé.
CONCLUSION
Pour les trois surfaces testées (inox, PVC, latex), avec Staphylococcus
epidermidis, les deux meilleures méthodes sur les six techniques
expérimentées (écouvillonnage à sec en coton,
alginate, Dacron®, mousse, écouvillonnage humide
en coton et l'application de la boîte Count-Tact®)
sont l'écouvillonnage humide avec un écouvillon en coton
et l'application standardisée d'une boîte Count-Tact®.
Dans le programme d'assurance qualité de la pharmacie de l'hôpital
d'enfants, les prélèvements de surface sont donc effectués
avec :
- des boîtes gélosées sur les plans de travail et
les flux des pièces blanches et propres ;
- des écouvillons en coton humidifié au niveau des surfaces
de l'isolateur.
REFERENCES
1. Bellon-Fontaine MN, Cerf O. Étude de l'adhésion
des micro-organismes aux surfaces de matériaux chimiquement inertes
; perspectives d'application. Premières journées d'étude
de la Fondation hospitalière internationale (1, 1987, Lyon). Infection
hygiène hospitalière perspectives an 2000. Fondation Marcel-Mérieux,
1987 : 281-95.
2. Darbord JC, Brion F. Contrôles microbiologiques
des surfaces en milieu hospitalier. Nouv Presse Med 1976 ; 5 :
1349-52.
3. Devaux F, Demoulin A, Harel A, Vidal JL, et al.
Assurance qualité au bloc opératoire et en stérilisation
centrale, bilan de 4 ans de contrôles microbiologiques d'environnement.
Ph Hosp Fr 1994 ; 110 : 423-33.
4. Girard N, Vergnaud T, Isoard P, Dufour C, Kurz JP. Étude
comparative de trois méthodes d'évaluation de la flore de
surface. Forum international Contaminexpert, Versailles, 1989.
5. Isoard P. Désinfection des sols. In : Guide
de la biocontamination. Paris : Cobac, 1988 : 154-8.
6. Lévy A, Jourdan R. Contaminations intrahospitalières
par micro-organismes. Paris : Masson, 1975 : 227 p.
7. Mozes N. The ways we study interfacial phenomena of living
cells. In : Adhésion des micro-organismes aux surfaces.
Paris : Lavoisier, 1994 : 3-13.
8. Niskanen A, Pohja MS. Comparative studies on the sampling
and investigation of microbial contamination of surfaces by the countact
plate and swab methods. J Appl Bact 1977 ; 42 : 53-63.
9. Norme européenne CEN/TC 243. Part 6 : Biocontamination
control/methods of analyzing and measuring biocontamination of surfaces
in zones at risk. Comité européen de normalisation, 1994
: 1-21.
10. Squinazi F, Festy B. Contamination de l'air et des surfaces
en milieu hospitalier. Rev Fr Santé Publ 1985 ; 30 : 50-5.
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