ARTICLE
Auteur(s) : Anne
Tessier-Marteau, Franck Geneviève, Alban Godon, Laurent Macchi,
Marc Zandecki
Laboratoire d'hématologie, CHU d'Angers
Article reçu le 15 Octobre 2009, accepté le 13 Novembre 2009
Quelle que soit leur méthodologie d'analyse, les automates
d'hématologie cellulaire (AHC) considèrent les cellules du sang
comme des particules dont ils mesurent divers critères physiques,
parmi lesquels la taille, la capacité à interrompre le passage du
courant électrique, la résistance à la traversée d'un courant de
haute fréquence, ou la dispersion et l'absorption lumineuses. Qu'il
s'agisse d'hémogrammes normaux ou anormaux, les AHC fournissent
rapidement des résultats précis et exacts. Cependant, dans
certaines circonstances, liées à des particularités de
l'échantillon sanguin, à une pathologie particulière du patient
étudié, à des modifications induites après le prélèvement, ou à la
technologie utilisée pour la mesure, les AHC peuvent produire des
résultats erronés pour un ou plusieurs des paramètres de la
numération globulaire [1] et/ou de la formule leucocytaire.
Ces anomalies ou erreurs de mesure ont été rapportées dans la
littérature dès le début d'utilisation des AHC en biologie médicale
[1, 2].
Les fabricants d'AHC ont tenu compte des diverses insuffisances
signalées par les utilisateurs, ont amélioré avec les années la
qualité d'analyse de leurs machines et, avec les progrès de
l'analyse informatique, proposent maintenant des résultats fiables
et précis pour les divers paramètres de la numération globulaire,
une analyse automatisée de la formule leucocytaire et une
numération des réticulocytes. A l'obtention de résultats
chiffrés, s'est ajoutée une visualisation au moins partielle des
particules énumérées, sous la forme d'histogrammes mono-, bi- ou
multi-paramétriques. Outre des informations sur le fonctionnement
des AHC (messages techniques), divers messages d'alerte sont
apparus en parallèle des histogrammes pour signaler plus
précisément certaines des anomalies de mesure ou d'analyse
(messages quantitatifs sur des seuils de normalité ou de linéarité
dépassés, messages analytiques et qualitatifs signalant la
difficulté de réalisation d'une analyse ou la présence possible
d'éléments anormaux ou inhabituels). Ces divers messages et
histogrammes complètent aujourd'hui l'interprétation technique et
biologique de l'hémogramme : ils font habituellement l'objet d'une
formation spécifique (formation « utilisateurs ») et sont inscrits
dans le guide technique de l'automate.
Selon les performances de l'AHC, les histogrammes et messages
d'alerte seront plus ou moins développés : chaque biologiste doit
savoir comment son AHC réagit devant les diverses situations qui
peuvent conduire à la validation de résultats erronés.
Le document qui suit reprend les diverses circonstances
pouvant perturber l'analyse automatisée de l'hémogramme. Chaque AHC
est affecté de manière variable par ces diverses anomalies de
mesure, bien que le degré par lequel il est perturbé puisse varier.
Certaines anomalies sont suffisamment fréquentes pour nécessiter la
rédaction de procédures dégradées, mentionnant comment il faut agir
sur le plan technique et sur le plan biologique, ainsi que les
niveaux de pertinence et d'urgence médicale.
Principes généraux de la numération
des plaquettes
Avec la technique de mesure par impédance initialement définie par
Wallace Coulter (tableau 1), un
échantillon de sang total prélevé sur EDTA est dilué dans une
solution tampon iso-osmotique puis aspiré au travers d'un orifice
qui sépare deux chambres, l'une contenant une électrode positive et
l'autre une électrode négative [3]. Chaque particule traversant
l'orifice produit momentanément une augmentation de la résistance
électrique qui est enregistrée comme une impulsion. En outre, la
taille de cette impulsion est proportionnelle à la taille de la
particule correspondante. Les impulsions sont enregistrées
individuellement puis classées au sein d'histogrammes : les AHC
énumèrent les plaquettes (PLT) et les globules rouges (GR) sur le
même canal de dilution et considèrent les particules de petite
taille comme des PLT et les autres particules comme des GR. Selon
les AHC, les seuils identifiant les particules comptées comme des
PLT varient de 2 à 6 fL pour le seuil inférieur
(discrimination des PLT et du bruit de fond) et de 20 à
40 fL pour le seuil supérieur (discrimination avec les GR).
Diverses améliorations ont été apportées à cette analyse : étude du
profil de l'histogramme des volumes plaquettaires et production
d'une courbe lissée (améliorant la précision du décompte) si la
distribution est (Log) normale, ou/et présence d'un seuil mobile
plutôt que fixe pour discriminer PLT et GR. Des messages
d'alerte apparaissent quand l'AHC ne réussit pas à extrapoler une
courbe lissée ou à séparer nettement les PLT des GR.
La technique de mesure par diffraction lumineuse (optique)
utilise la cytométrie en flux (tableau 1) : les particules d'un échantillon
de sang dilué sont aspirées et cheminent individuellement dans un
capillaire. Chaque particule traverse un faisceau lumineux (ou
laser) et va à la fois interrompre ce faisceau (chaque interruption
correspond au passage d'une particule, ce qui permet ultérieurement
d'en obtenir le nombre) et diffracter ce faisceau lumineux.
La quantité de lumière diffractée à 1, 2, 3 ou même
4 angles (selon les AHC) est proportionnelle au volume, mais
aussi renseigne sur le contenu de la particule. Les PLT sont
identifiées sur un histogramme biparamétrique plaquettaire
(volume/indice de réfraction). Plusieurs AHC réalisent la
numération des PLT par impédance mais peuvent, soit à la demande
soit systématiquement, énumérer en plus les PLT par technique
optique. En incorporant un composé coloré ou fluorescent au réactif
de dilution, il est en outre possible de mesurer d'autres
paramètres plaquettaires, comme par exemple la fraction immature
(ou nombre de PLT réticulées).
La numération des PLT par technique immunologique, initialement
proposée pour les cytofluoromètres généralistes, se réalise
maintenant directement sur certains AHC (Abbott) avec un anticorps
monoclonal anti-plaquettes (CD61). Bien que coûteuse, cette
méthode est recommandée pour sa précision dans les situations de
forte thrombopénie.
Si, dans la vaste majorité des cas, la numération des PLT
produite par les AHC est précise et exacte, diverses situations
peuvent conduire à des résultats erronés (tableau 2).
Tableau 1 Principales technologies actuellement
disponibles pour l'analyse automatisée de l'hémogramme
avec les automates d'hématologie les plus
performants.
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Techniques de numération
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Formule leucocytaire
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Siemens
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Advia 2120i
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Diffraction optique (leucocytes, PLT, GR) Quantification
des érythroblastes (calcul à partir d'une
analyse multicanaux) Réticulocytes : nombre, volume, fraction
immature, contenu en Hb
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Basophiles : lyse différentielle et diffraction optique
Neutrophiles, éosinophiles, monocytes et lymphocytes : mesure
par diffraction optique en fonction
de la taille et de l'absorption
en fonction de la réactivité
de la peroxydase
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Sysmex
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XE-2100
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Variation d'impédance (GR, PLT) en première analyse
Diffraction optique (GR, PLT) avec fluorochrome de l'ARN
: déclenchement automatique ou à la demande Fraction
PLT immature Leucocytes : diffraction laser (sans
et avec fluorochrome) Quantification
des érythroblastes (avec polyméthine :
diffraction et intensité de fluorescence)
Réticulocytes : nombre, fraction immature, contenu en Hb
|
Basophiles : lyse différentielle et diffraction optique
Neutrophiles, éosinophiles, monocytes et lymphocytes : mesure
par diffraction optique aux petit et grand angles,
et mesure de fluorescence Granulocytes immatures :
détection avec un courant alternatif à haute
fréquence (Radio Fréquence) et un courant continu
à basse fréquence (courant continu ou DC)
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Horiba Medical
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Pentra 120 DX
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Variation d'impédance (GR, PLT) Leucocytes : variation d'impédance
et histogramme Lymphocytes, Monocytes, Granulocytes (LMG)
Quantification des érythroblastes (thiazole orange ;
diffraction et intensité de fluorescence) Réticulocytes :
nombre, fraction immature, volume
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Basophiles : impédance après lyse des autres leucocytes
Neutrophiles, éosinophiles, monocytes et lymphocytes : mesure
par impédance électrique et transmission optique
(absorption lumineuse) après coloration par le noir
chlorazol E
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Beckman - Coulter
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LH 785
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Variation d'impédance (GR et PLT) [pour les PLT :
calcul de log-normalité, courbe lissée] Leucocytes : variation
d'impédance et histogramme LMG Quantification
des érythroblastes (calcul après expansion d'échelle
et modélisation des données) Réticulocytes : nombre,
fraction immature, volume
|
Basophiles, neutrophiles, éosinophiles, monocytes
et lymphocytes : mesure par variation d'impédance,
courant électrique haute fréquence et diffraction
d'un faisceau de lumière monochromatique (volume,
conductivité, diffraction) puis analyse multidimensionnelle
et individualisation des populations
dans un espace cubique
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Abbott diagnostics
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Cell-Dyn Sapphire
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GR et PLT : impédance et diffraction optique
en parallèle PLT : cytofluorométrie en flux
avec CD61 (à la demande) Leucocytes : diffraction
optique Quantification des érythroblastes (iodure
de propidium ; diffraction et intensité
de fluorescence) Réticulocytes : nombre, fraction immature,
volume
|
Basophiles, neutrophiles, éosinophiles, monocytes
et lymphocytes : mesure par diffraction optique MAPSS
(Multi Angular Polarised Scatter Separation : transmission,
diffraction à angle aigu et angle droit, dépolarisation)
; sans colorant ou cytochimie
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Tableau 2 Principales situations associées à une
anomalie de la numération plaquettaire automatisée.
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Anomalies de la numération plaquettaire automatisée
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Anomalies d'autres paramètres de la numération globulaire
ou de la formule leucocytaire liées
aux anomalies des PLT
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Fausse diminution
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Agrégabilité ou adhésivité excessive des PLT :
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*Agrégation des PLT entre elles (essentiellement liée
à l'EDTA)
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Agrégats de PLT comptés avec les leucocytes ;
formule leucocytaire perturbée
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*Satellitisme des PLT autour des neutrophiles (parfois
d'autres leucocytes) lié à l'EDTA
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Erreur dans la formule leucocytaire par localisation
anormale du nuage neutrophile sur le graphe
de la formule leucocytaire
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*Agrégats mixtes de PLT et de neutrophiles
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Diminution du nombre de leucocytes ; fausse
neutropénie
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Plaquettes géantes (volume supérieur au seuil discriminant
avec les GR)
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Les PLT géantes sont comptées avec les GR, parfois
les leucocytes
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Conditions préanalytiques diverses :
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*Ponction diluée (proximité d'une perfusion) *Coagulation partielle
de l'échantillon de sang *Rapport quantité
de sang/d'anticoagulant non respecté (ponction difficile)
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Altération d'autres paramètres de la NG
et de la formule
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*Tube de sang trop rempli
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Tous paramètres faussés
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*Echantillon sanguin trop âgé
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Anomalies qualitatives des leucocytes, du VGM
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Fausse augmentation
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Hématies fragmentées (schizocytes, microcytes : microangiopathies,
grands brûlés, carences en fer sévères)
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Diminution modérée de la numération des GR
(anecdotique)
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Fragments du cytoplasme de leucocytes (blastes, cellules
de lymphome)
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Cryoglobulines, cryofibrinogène
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Fausse augmentation du nombre des leucocytes et plus
rarement des GR
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Lipides (hyperlipémies, prélèvement près d'une perfusion lipidique,
ou parfois post-prandial)
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Hémoglobine faussement augmentée ; image anormale
sur le graphe de la formule leucocytaire,
formule leucocytaire automatisée perturbée
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Micro-organismes : bactéries (septicémie, tube de prélèvement
non stérile), champignons (Candida)
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Situations conduisant à une fausse diminution
de la numération plaquettaire
Pseudothrombopénie liée à l'anticoagulant EDTA (PTE)
Elle correspond à un phénomène provoqué in vitro par des anticorps
particuliers, présents dans les échantillons sanguins prélevés sur
EDTA, et qui réagissent avec les PLT pour les agréger entre elles
(figure 1A)
[1, 4]. Les AHC ne sont pas responsables de ce phénomène mais
sont incapables d'énumérer les PLT incluses dans les agrégats : ils
ne proposent alors que le décompte des PLT non agrégées, ce qui
induit une (pseudo) thrombopénie parfois majeure, jusqu'à moins de
20 G/L, alors que la numération réelle est normale [5]. En
outre, les amas de PLT perturbent de manière variable la numération
leucocytaire et la formule leucocytaire automatisée. Négliger ce
phénomène peut conduire à la réalisation d'examens non nécessaires
(ponction médullaire, transfusion de plaquettes) [4]. L'élément le
plus important est que la PTE n'est jamais accompagnée de signes
hémorragiques.
La prévalence de la PTE
Elle varie selon les études de 0,07 à 0,20 % des échantillons
sanguins analysés dans la population générale et serait de 0,1 à
2,0 % pour les patients hospitalisés [6-9]. L'incidence est assez
superposable chez les hommes, les femmes et les patients âgés.
Les patients sont soit sains à la découverte de l'anomalie
soit, quand des maladies existent, elles sont hétérogènes, bien que
certains auteurs aient émis l'hypothèse d'une relation possible
avec une maladie auto-immune, inflammatoire ou néoplasique [10].
Cependant, il n'a pas été constaté d'augmentation de l'incidence
des pathologies précitées chez les patients sains chez qui une PTE
était découverte, même après plus de dix ans de suivi [11].
Les PLT des syndromes myéloprolifératifs seraient plus
sensibles à l'agrégation, indépendamment d'une thrombopathie
associée. La PTE peut survenir chez des patients par ailleurs
déjà thrombopéniques, amplifiant la profondeur de celle-ci ou, à
l'opposé, chez des patients hyperthrombocytaires, aboutissant à une
numération des PLT faussement normale [12, 13]. La PTE est
transitoire (disparition en quelques mois) ou permanente, et peut
parfois augmenter en intensité pendant l'hospitalisation [14-16].
Elle n'a pas de relation avec l'augmentation de l'activation
plaquettaire impliquée dans la pathogénie de la thrombose
artérielle, l'infarctus du myocarde ou les accidents vasculaires
cérébraux (dans ces circonstances, des agrégats de PLT peuvent être
générés in vivo) [17].
Mécanisme de l'agrégation
Les études de transfert ont montré que le plasma EDTA des patients
présentant une PTE était capable d'agréger les PLT de tous les
patients sauf celles de la thrombasthénie de Glanzmann, suggérant
que le complexe glycoprotéique αIIb/βIIIa, récepteur du
fibrinogène, était impliqué dans la PTE [11, 18]. Un anticorps
monoclonal a d'ailleurs été produit qui reconnaît un épitope sur
l'intégrine αIIb/βIIIa, dont l'accessibilité est augmentée lors du
contact des PLT avec l'EDTA [19]. La thrombopénie
artéfactuelle qui apparaît fréquemment chez les patients traités
par des antagonistes des récepteurs αIIb/βIIIa en est une autre
preuve indirecte [20]. Le mécanisme le plus vraisemblable de
la PTE est qu'un site antigénique normalement caché (cryptique) du
complexe αIIb/βIIIa est modifié ou exposé seulement en présence
d'EDTA. Bien que plutôt restreinte à l'EDTA, l'agrégation des PLT
se produit parfois avec d'autres anticoagulants, dont le citrate
trisodique [11]. Quelques publications rapportent cependant que
d'autres protéines que des anticorps pourraient être responsables
de la PTE, voire que des complexes immuns interviendraient par un
jeu d'interactions entre Fc des immunoglobulines et récepteurs
plaquettaires [4-21].
Pourquoi ces anticorps apparaissent-ils ?
Ce sont des IgG (33 à 50 % des cas), des IgM (10 à 63 % des cas),
ou des IgA (4 à 40 % des cas) selon les séries de la littérature
[4, 22]. Les hypothèses d'auto-anticorps naturels ou
d'anticorps acquis résultant de la destruction de PLT après
septicémie, toxémie gravidique, microangiopathie thrombotique,
syndromes myélodysplasiques, ou apparaissant pendant
l'hospitalisation et particulièrement après une infection, ont été
souvent évoquées [4]. Ces anticorps sont associés dans la
plupart des cas à des anticorps antiphospholipides qui pourraient
eux aussi intervenir dans le mécanisme d'agrégation [4].
La PTE peut parfois s'amplifier à froid ou au contraire être
plus intense à 37 °C. La cinétique de l'agrégation est
rapide, débutant dans les minutes qui suivent le contact du
sang avec l'EDTA, devenant maximale soit après quelques minutes,
soit, au contraire, après quelques heures. Les amas sont de
taille très variable, allant de 2 à 5 PLT jusqu'à plusieurs
dizaines ou plusieurs centaines de PLT selon les cas. Pour certains
auteurs, la numération des PLT serait d'autant plus basse que les
amas seraient plus importants en taille [10].
Mise en évidence de la PTE
sur les automates
La présence d'amas de PLT est plus ou moins facilement détectée
selon les AHC et selon la taille des amas, les AHC les plus simples
ayant un faible niveau de détection (figure 2). Lorsque
l'agrégation est d'intensité modérée, avec un mélange de PLT libres
et de petits amas (2-5 PLT), ces derniers sont considérés comme de
grosses PLT. L'histogramme plaquettaire montre un excès d'éléments
de grande taille, sans retour à la ligne de base vers 20 fL,
et la séparation PLT-GR est difficile. Des messages d'alerte
peuvent être générés : « présence de grandes plaquettes », «
plaquettes géantes » ou « suspicion d'amas plaquettaires » (ou
équivalents). Lorsque les amas sont plus volumineux, l'histogramme
plaquettaire ne visualise que les PLT non agrégées, et les messages
d'alerte issus de cet histogramme sont liés à la difficulté
d'analyse de ces quelques PLT résiduelles : « absence de courbe
lissée », « résultats bruts », « thrombopénie ». Par contre, les
amas volumineux vont perturber l'analyse des leucocytes et sont
visualisables sur l'histogramme biparamétrique de la formule
leucocytaire (taille/un autre critère, variable selon l'AHC) sous
la forme de particules anormales non leucocytaires.
Des messages d'alerte apparaissent : « agrégats de plaquettes
», « plaquettes de grande taille ou géantes », ou un message
équivalent lié à l'existence de particules de taille modérée
(parfois : « érythroblastes ? »). Sur certains AHC, la numération
leucocytaire est réalisée sur deux canaux différents (voir les
anomalies de décompte des leucocytes) : dans le canal qui utilise
un agent de lyse puissant des GR, les membranes des leucocytes et
des PLT (libres et en amas) sont détruites et la numération
leucocytaire est exacte. À l'inverse, dans le canal dédié à la
formule leucocytaire, l'agent de lyse des GR respecte les membranes
des leucocytes, des PLT et des amas de PLT, et ces derniers seront
comptés comme leucocytes et vont surestimer la numération
leucocytaire de ce canal. Une différence entre les 2 mesures
est alors signalée, et cette discordance doit faire évoquer, entre
autres, la présence d'amas plaquettaires.
Les AHC qui réalisent la numération et la formule leucocytaires
sur le même canal seront moins sensibles à la détection des amas de
PLT, et une observation attentive des histogrammes sera d'autant
plus nécessaire. Les AHC les plus simples qui ne réalisent pas
de formule, même approchée, visualisent mal les agrégats. Avec les
AHC qui analysent les particules du canal de numération
leucocytaire en trois populations (lymphocytes, monocytes,
granulocytes) (Beckman, Horiba Medical), les amas de PLT
apparaissent sous forme d'un pic de particules de petite taille :
les messages d'alerte générés sont souvent communs aux trois
principaux artéfacts interférant dans cette région, c'est-à-dire
les agrégats de PLT, les PLT géantes et les noyaux
d'érythroblastes.
Conduite pratique
Lorsque l'on soupçonne une PTE (message d'alerte ou thrombopénie
nouvellement découverte), l'examen du frottis sanguin coloré est
nécessaire à la recherche d'amas plaquettaires : l'étude attentive
des franges latérales et de l'extrémité est nécessaire, les amas
très volumineux étant rejetés en périphérie lors de l'étalement.
La présence d'un message d'alerte rend erroné ou au minimum
suspect le résultat de numération des PLT rendue par l'AHC, et il
n'est pas réaliste d'effectuer une numération plaquettaire par une
autre technique à partir du même tube de sang (par exemple optique
si la première numération a été réalisée par impédance). En
pratique, un autre prélèvement doit être analysé. Mais il est
nécessaire d'estimer approximativement le nombre de PLT (à partir
du frottis sanguin) afin d'éviter de temporiser si l'agrégation
survient dans un contexte de vraie thrombopénie. Un échantillon de
sang prélevé sur citrate trisodique (1 volume pour 9 volumes
de sang) et analysé dans les 2 heures qui suivent est la
démarche habituelle (ne pas oublier la correction mathématique du
fait de la dilution liée au citrate liquide). La détermination
de la numération plaquettaire sur prélèvement hépariné est à
déconseiller. Dans quelques cas, une agrégation avec l'EDTA et avec
d'autres anticoagulants dont le citrate trisodique a été rapportée,
et la dilution immédiate du sang capillaire avec le système
Unopette® qui contient de l'oxalate d'ammonium (Becton
Dickinson), ou un système équivalent, puis la numération en chambre
hématimétrique permet d'obtenir un résultat. Quand l'agrégation
survient avec tous les anticoagulants, l'emploi de mélanges
spéciaux contenant diverses molécules (dextrose, théophylline,
aminoglycosides) a été proposé. Dans certaines circonstances,
l'agglutination a été rapportée comme faible ou absente dans les
premières minutes suivant le prélèvement, l'analyse rapide
permettant d'éviter l'écueil. Il a été également décrit qu'un
échantillon prélevé et maintenu à 37 °C pouvait s'analyser
convenablement, mais ceci n'est valable que dans quelques cas, et
quand l'agrégation survient à température ordinaire, elle disparaît
rarement après incubation à 37 °C : dans la plupart des cas,
on constate plutôt une augmentation de taille des amas
plaquettaires [6, 23].
Les plaquettes géantes
Dans les conditions normales et dans diverses situations
pathologiques, quelques PLT ont un volume plus élevé, et, pour
cette raison, les AHC considèrent que les PLT peuvent avoir un
volume atteignant 36, 40, voire même 60 fL. Il faudra avoir à
l'esprit que dans certaines pathologies (syndromes
myéloprolifératifs ou myélodysplasiques), quelques PLT peuvent
présenter une taille (volume) identique ou proche de celle des
leucocytes et ne sont pas identifiées comme telles, ou peuvent être
incluses dans le décompte des GR ou/et celui des leucocytes (voir
le chapitre consacré aux anomalies d'analyse des leucocytes). Mais
c'est au cours des thrombopénies que l'absence d'identification
convenable des grandes PLT constitue un réel problème (figure 1B). Même si
des améliorations considérables ont été apportées afin de
discriminer les grandes PLT et les autres particules (histogramme
volumétrique avec courbe lissée, seuil mobile entre PLT et GR,
diffraction lumineuse à plusieurs angles, analyse de l'indice de
réfraction), la précision et l'exactitude de la numération des PLT
restent faibles dans cette circonstance, comme le montre par
exemple leur faible reproductibilité au cours des
macrothrombopénies constitutionnelles [24].
Les AHC signalent le plus souvent ces grandes PLT (ou PLT
géantes) avec un message d'alerte, mais dont la spécificité est
faible car croisée avec la présence de petits agrégats de PLT,
voire de noyaux d'érythroblastes. La présence de
tels messages doit conduire à l'examen de l'histogramme
volumétrique des PLT, à vérifier si l'AHC a réalisé une bonne
discrimination des PLT-GR, et en cas de thrombopénie, surtout pour
un patient inconnu, à regarder le frottis sanguin, au moins pour
confirmer la présence de PLT géantes (ou visualiser des agrégats de
PLT ou des érythroblastes). La numération des PLT par méthode
optique est parfois moins imprécise. La présence d'un nombre
élevé de grandes PLT, surtout en cas de thrombopénie vraie
associée, est une situation de choix pour utiliser la méthode
immunologique de numération des PLT à l'aide d'anticorps
monoclonaux. Enfin, l'affichage d'un volume moyen plaquettaire
élevé peut aider à identifier une macrothrombopénie, mais
uniquement après avoir examiné l'étalement sanguin et éliminé
l'existence de petits agrégats de PLT [24, 25].
Satellitisme des plaquettes autour
des leucocytes
Le satellitisme des plaquettes, ou satellitose, ou rosettes
leucoplaquettaires, est un phénomène acquis in vitro en présence
d'EDTA et lié à l'adhésion des plaquettes à la membrane des
polynucléaires neutrophiles (PNN) matures (figure 1C) ou parfois
à d'autres cellules (figure 1D) [26-29].
Il s'agit d'une situation rare (estimée à environ 1 pour
12 000 échantillons sanguins), quelquefois reliée à
un processus auto-immun mais, dans la plupart des cas, sans
relation avec une maladie spécifique [29]. Sa signification
clinique n'est pas connue. Il a été montré à plusieurs
reprises, en utilisant soit des anticorps anti-Ig soit avec une
absorption spécifique de chacune des fractions d'Ig, que les IgG
étaient le médiateur, avec ou sans participation des récepteurs Fc
gamma des PNN [29, 30]. L'implication du complexe glycoprotéique
αIIb/βIIIa de la membrane des PLT a été également avancée [30],
tout comme la présence d'auto-anticorps IgG dirigés contre un
antigène cryptique commun au complexe αIIb/βIIIa des PLT et au
récepteur Fc gamma III (CD16) des PNN et possiblement démasqué en
présence d'EDTA [30], ou la présence de cryofibrinogène ou de
thrombospondine [31, 32].
Dans notre expérience concernant cette anomalie, des aspects
morphologiques différents s'observent parfois avec le temps au sein
de l'échantillon sanguin EDTA : le satellitisme observé dans les
premières minutes suivant le prélèvement évolue en quelques heures
par migration progressive des plaquettes à un pôle du PNN,
conférant un aspect d'amas de PLT collées à la membrane
leucocytaire, puis après quelques heures supplémentaires « l'amas
plaquettaire » se détache de la membrane du PNN, conduisant à des
PNN libres d'une part et des amas de plaquettes d'autre part. Selon
le temps écoulé de l'échantillon à l'analyse, le satellitisme ou
les agrégats plaquettaires sont l'élément dominant observable.
Quand le satellitisme est présent, la numération des PLT est en
général diminuée de 50 à 100 G/L (on peut énumérer
approximativement le nombre de PLT adhérant aux PNN). Une (pseudo)
thrombopénie n'est donc pas constante. Il n'y a pas de message
d'alerte spécifique : dans la plupart des cas, c'est l'histogramme
biparamétrique de la formule leucocytaire qui montre une
localisation anormale des PNN (figure 3), souvent de
taille inhabituellement grande, et les messages d'alerte indiquent
la localisation anormale des PNN et/ou la présence de granulocytes
immatures (car de grande taille). Parfois, les amas de PLT libres
vont polluer le nuage des lymphocytes. Un message signalant la
présence de leucocytes avec une forte activité peroxydase est
parfois généré sur les AHC réalisant la formule leucocytaire par
cytochimie (Advia 2120i, Siemens). Le satellitisme ne survient
pas avec l'anticoagulant citrate et un prélèvement de cette nature
est alors préconisé.
Plus rarement, le satellitisme des PLT a pu être rapporté autour
d'autres cellules, notamment autour des monocytes dans des
échantillons de sang EDTA ou/et hépariné [33, 34], ou
spécifiquement autour des polynucléaires basophiles dans un cas de
leucémie myéloïde chronique [27], ou spécifiquement autour
d'éosinophiles [29]. Le satellitisme des PLT autour des
lymphocytes (figure 1D) ou autour
de cellules de lymphome a été également rapporté, les quelques
manipulations réalisées dans ces cas impliquant ou non une Ig et le
CD16 [28, 35]. D'autres situations reliées à l'EDTA ont été
décrites sous le terme de satellitisme, mais correspondent soit à
des amas de lymphocytes, soit à des GR entourant des lymphocytes ou
des PNN en présence d'EDTA [36].
Agrégation mixte neutrophiles-plaquettes en présence
d'EDTA
L'observation de volumineux agrégats contenant des centaines de PLT
et des centaines de PNN a été rapportée, semblant être le point
final d'un processus initié par un satellitisme classique des PLT
autour des PNN [37, 38]. Le nombre de cas rapportés est faible
et il y a peu d'études sur ce phénomène et sur ses différences avec
le satellitisme plaquettaire classique autour des PNN. Chez un
patient qui montrait à la fois une agrégation des PLT et une
agrégation mixte PLT-PNN, diverses différences entre les
températures optimales d'agrégation, la restriction ou non à l'EDTA
et l'abolition avec le dithiothréitol suggéraient des mécanismes
différents entre ces deux phénomènes [37]. Ces amas mixtes
PLT-PNN sont suffisamment volumineux pour ne pas être détectés en
tant que tels par les AHC et, dans les observations
rapportées, on note une diminution de la numération des PLT (soit
avec un résultat restant au sein de valeurs normales soit une
(pseudo) thrombopénie) et une tendance à la leucopénie [37, 38].
C'est d'ailleurs par une tendance leuco-neutropénique qu'est
parfois révélée la situation. Il y a peu de cas rapportés et
analysés avec les AHC les plus récents : la numération
leucocytaire par décompte des noyaux après lyse des membranes
leucocytaires et plaquettaires ne devrait pas être perturbée, à
l'inverse du décompte leucocytaire réalisé dans le canal formule.
L'examen au faible grossissement du frottis sanguin est nécessaire
devant chaque échantillon leucopénique d'un patient inconnu ou
lorsque le nombre des leucocytes chute fortement : il faut avoir à
l'esprit ce type d'artéfact et rechercher les amas, peu nombreux
mais parfois très volumineux, localisés plutôt aux extrémités des
frottis. Dans un cas, la fausse numération leucocytaire était liée
à la fois à une diminution du nombre des PNN (localisés dans les
amas) et à la présence d'amas de PLT faussement comptés comme
leucocytes [37].
Le phénomène décrit ci-dessus est lié à la présence d'EDTA et
apparaît in vitro : il est tout à fait différent de l'apparition in
vivo des agrégats PLT-leucocytes rapportés dans divers états
inflammatoires et thrombotiques et liés à une augmentation de
l'expression de la P-sélectine après activation des PLT [38].
Une numération par cytométrie en flux est d'ailleurs proposée pour
énumérer ce type d'agrégats mixtes leucocytaires et plaquettaires
[39].
Considérations préanalytiques liées à l'échantillon
Les dysfonctionnements préanalytiques peuvent contribuer à des
résultats anormaux et sont sans doute plus fréquents que les
anomalies analytiques. Un décompte anormalement bas peut être
retrouvé dans les échantillons sanguins dilués par prélèvement à
proximité d'une perfusion ou sur une voie de perfusion.
Indépendamment de l'anticoagulant utilisé, une augmentation de sa
concentration dans l'échantillon (défaut de sang par ponction
veineuse difficile ou prélèvement difficile comme chez le
nouveau-né) ou un retard entre le prélèvement et l'analyse peuvent
modifier le volume des PLT, conduisant à une difficulté de
l'automate à générer une courbe lissée ou à retrouver
précisément les critères habituels de définition des PLT [2]. Un
retard de contact entre le sang prélevé et l'anticoagulant ou une
difficulté de ponction peuvent initier la coagulation et générer
des amas plaquettaires. Un prélèvement sous vide trop rempli a été
rapporté comme pouvant générer des anomalies des divers paramètres
de la numération globulaire, et notamment, une numération
plaquettaire basse par la difficulté à homogénéiser l'échantillon
de manière adéquate (un retour progressif à des résultats proches
des résultats réels était obtenu après plusieurs aspirations).
Situations conduisant à des fausses élévations
de la numération des plaquettes
Les hématies fragmentées
La détermination de la numération des PLT et des GR se réalise sur
le même canal ou les mêmes canaux. Pour les AHC utilisant la
technique par impédance, le critère primordial de séparation entre
PLT et GR est la taille (volume). Quand le sang est riche en GR de
volume très réduit (carences martiales avec microcytose importante,
nombre élevé de schizocytes, grands brûlés), ces particules peuvent
se localiser dans une région correspondant habituellement aux
grandes PLT et faire générer de fausses courbes lissées avec excès
d'éléments de grande taille (figure 4A,B), qui
conduisent à une numération plaquettaire faussement augmentée [40].
Une erreur par défaut de la numération des GR a également été
rapportée dans ce cas, mais elle reste modeste (voir chapitre
correspondant à la numération des GR). Dans les brûlures sévères,
les GR qui éclatent en donnant naissance à de nombreux petits
fragments perturbent la numération des PLT et génèrent des
histogrammes assez superposables à ceux que l'on peut observer en
présence d'autres types de petites particules, comme les
cryoglobulines (voir paragraphe correspondant). Pour les AHC
utilisant la mesure par diffraction optique, la détermination du
volume, d'une part, et l'indice de réfraction (Abbott, Siemens) ou
l'intensité de fluorescence des PLT (Sysmex), d'autre part, permet
dans la plupart des cas une bonne séparation avec les GR très
microcytaires ou les schizocytes. Certains AHC énumèrent les PLT
avec la technique d'impédance, et à la demande ou systématiquement,
ajoutent la numération par diffraction optique [Abbott (figure 4C,D), Sysmex]
: l'affichage comparatif ou le plus réaliste est proposé. Dans des
situations extrêmes, la numération par technique immunologique avec
un anticorps monoclonal (CD61) sur le même échantillon (Abbott)
permet d'obtenir le résultat exact.
Les messages d'erreur observables dans cette circonstance se
rapportent à la présence de « plaquettes géantes »
et/ou l'inaptitude à séparer convenablement PLT et GR.
L'examen des histogrammes des volumes plaquettaires
et érythrocytaires est crucial. L'examen du frottis sanguin,
le décompte microscopique ou/et l'utilisation d'une
autre méthode de comptage (diffraction optique plutôt
qu'impédance) sont souhaitables quand l'histogramme des volumes
plaquettaires ne revient pas à la ligne de base à 20 fL, quand
une population de microcytes apparaît sur l'histogramme
plaquettaire et que celui-ci n'est pas lissé (Beckman), quand le
volume plaquettaire moyen est exagérément élevé, ou quand la
distribution des volumes des GR est très étendue [40].
Les fragments de cytoplasme de cellules nucléées
Comme les fragments de GR, les fragments du cytoplasme des
leucocytes peuvent provoquer une augmentation de la numération des
PLT. Il peut s'agir de fragments de blastes (monoblastes ou
lymphoblastes), de cellules lymphomateuses lors de la phase de
dissémination de lymphomes diffus à grandes cellules au diagnostic
ou pendant la chimiothérapie, ou de tricholeucocytes [41-44].
La cytochimie (butyrate estérase), l'immunocytochimie
(myéloperoxydase, CD61) ou la microscopie électronique confirment
l'origine leucémique de ces particules. On peut les observer sur
les frottis sanguins colorés : ces fragments cytoplasmiques sont
plus hétérogènes en taille et en contenu que les PLT, et paraissent
souvent plus nettement basophiles (figure 5A).
L'incidence de cette anomalie est loin d'être négligeable et une
étude a récemment montré que l'on pouvait trouver au moins quelques
fragments cytoplasmiques sur les frottis sanguins de 25,4 % des
patients ayant une leucémie aiguë, et que dans 7 cas (4,1 %),
la numération plaquettaire vraie était inférieure à 15 G/L, alors
que le compte automatisé variait entre 21 et 75 G/L (moyenne =
39 G/L) [45]. Une transfusion de PLT a parfois été retardée du fait
de cette fausse augmentation. Une telle situation doit être évoquée
par le clinicien comme par le biologiste lorsqu'il existe un
syndrome hémorragique alors que la numération des PLT n'est pas
effondrée [42, 43].
Sur les AHC, un message d'alerte est en général présent, mais
sans spécificité : « PLT géantes », « agrégats plaquettaires ? », «
fantômes de globules rouges », ou divers autres messages liés à
l'impossibilité de produire une courbe lissée. La numération
des PLT est fausse, aussi bien avec la technique d'impédance que la
technique de diffraction optique (figure 5B).
La mesure par technique immunologique a ici une place de choix
(figure 5B). On peut
réaliser sur frottis sanguin le décompte de ces
fragments pour 100 PLT et faire ensuite la correction de
la numération plaquettaire brute rendue par l'AHC, afin de proposer
un résultat plus proche de la réalité.
Les micro-organismes
La présence in vivo de bactéries peut induire une fausse
augmentation de la numération des PLT, bien qu'il s'agisse d'une
situation rare, même chez les patients septiques [46, 47].
L'histogramme des volumes plaquettaires est anormal et montre un
décalage vers un excès de particules de petite taille qui
correspondent à des bactéries ou à des amas de bactéries (figure 6). Dans
notre expérience chez les patients présentant un sepsis sévère,
lorsqu'un histogramme plaquettaire était anormal par présence de
petites particules, des bactéries étaient constamment observées sur
le frottis sanguin [48]. Une situation intermédiaire est celle liée
à la croissance bactérienne au sein de l'échantillon sanguin
provenant d'un patient infecté, quand le délai entre le prélèvement
et l'analyse est important [47]. Enfin, la responsabilité d'un tube
non stérile utilisé pour le prélèvement et dans lequel a eu lieu
une croissance bactérienne peut être aussi évoquée : dans ce cas,
l'histogramme des volumes et la numération des PLT sont anormaux,
alors que la situation clinique est sans rapport avec un état
infectieux sévère. Un pic de particules de taille réduite à
l'extrême gauche de l'histogramme des volumes plaquettaires ou un
nuage de points dans la région proche de l'origine de l'histogramme
bi- ou multiparamétrique de la formule leucocytaire doivent faire
penser à ce type d'artéfact. Certains automates ont un seuil
minimum de définition des PLT fixé à 3 fL ou variable de
2 à 6 fL qui améliore la fiabilité du résultat rendu par
l'AHC.
Des champignons peuvent présenter la même taille que des PLT, et
chez des patients thrombopéniques infectés par des Candida, ces
derniers ont été observés sur les frottis sanguins et ont provoqué
une fausse augmentation de la numération des PLT [49]. Chez un
patient traité pour paludisme, de petits GR infectés par des
trophozoïtes de Plasmodium falciparum ont été identifiés à tort
comme étant des PLT (Abbott), conduisant à une numération
plaquettaire faussement normale [50].
Les lipides
En présence d'un excès de chylomicrons ou avec des échantillons de
sang prélevé après un repas, ou au cours de nutritions parentérales
avec lipides, il peut se former de petites micelles lipidiques
in vitro, lesquelles peuvent perturber la numération des PLT [51].
Cet excès de lipides peut également perturber la détermination de
l'hémoglobine, de paramètres érythrocytaires et leucocytaires (voir
les chapitres correspondants). Certains auteurs ont comparé
l'influence de l'excès de chylomicrons sur la numération des PLT
réalisée par deux types d'AHC : ils ont observé une augmentation
modérée pour l'AHC utilisant une technique de comptage optique par
rapport à celui utilisant la méthode de mesure par impédance, ce
dernier ne paraissant pas affecté [51, 52]. Si l'augmentation était
faible et négligeable chez les patients avec une numération
plaquettaire normale (augmentation de 2 à 40 G/L), elle
ne l'était plus chez les patients thrombopéniques, notamment en cas
de leucémie traitée par L-asparaginase [51, 52]. Les lipides
possèdent un indice de réfraction élevé et peuvent générer des
signaux anormaux qui se localisent sur les histogrammes
biparamétriques près de la région des PLT ou à la même place que
les petits GR ou les débris de GR. Pour les AHC qui analysent les
leucocytes sur deux canaux, les réactifs utilisés dans chaque canal
ne sont pas sensibles de la même manière à la présence de
lipides et, en fonction de la quantité et de la composition de ces
derniers, une discordance entre la numération des leucocytes sur
chacun des deux canaux peut être observée (Siemens, Sysmex).
Des messages d'erreur (« schizocytes ? », « fragments de GR ?
») et l'analyse attentive des histogrammes leucocytaires
(il existe des images particulières qui seront discutées plus
loin dans le document consacré aux leucocytes) sont les points clés
pour apprécier l'interférence potentielle des lipides sur la
numération des PLT. Dans la mesure où les lipides perturbent
la quantification de l'hémoglobine, des leucocytes et/ou la formule
leucocytaire automatisée (tableau 2), des messages d'alarme
correspondant à ces perturbations apparaissent (« turbidité cuve Hb
», « interférence lipides »). Les méthodes proposées pour
éliminer spécifiquement les lipides de l'échantillon (extraction à
l'éther, remplacement du plasma par un volume identique de diluant
iso-osmotique) sont à éviter car elles peuvent conduire elles-mêmes
à de fausses numérations plaquettaires, soit par défaut soit par
excès. Des modifications plus ou moins superposables à celles
observées avec les micelles lipidiques ont été rapportées par
ailleurs avec l'utilisation d'émulsions de perfluorocarbone [53].
Cryoglobulines et cryofibrinogène
La présence de cryoglobulines dans le sang (figure 7A) induit
fréquemment des anomalies de la numération des PLT (figure 7B), des
leucocytes, et plus rarement des anomalies de la numération des GR
ou de l'hémoglobine [54]. Comme le mécanisme qui conduit à la
fausse élévation des PLT et des leucocytes est similaire, ces deux
modifications seront discutées plus en détail dans le document
consacré aux anomalies de décompte des leucocytes, tout comme les
fausses élévations de la numération des PLT observées en présence
de cryofibrinogène. Quand la présence de cryoglobulines se traduit
par la gélification plus ou moins totale de l'échantillon de sang,
l'aspiration est difficile, insuffisante ou nulle, et se rapproche
du cas de l'échantillon coagulé : un message d'erreur peut
apparaître (« aspiration insuffisante ? »). Souvent, les
cryoprotéines précipitent en amas plus ou moins volumineux qui
perturbent les AHC en fonction de leur taille : les précipités de
taille réduite induisent une fausse augmentation de la numération
des PLT (des valeurs jusqu'à huit fois la valeur vraie ont été
rapportées), alors que les particules de plus grande taille ou les
agrégats de petites particules perturbent la numération des
leucocytes. Ces anomalies sont plus évidentes sur les AHC
utilisant des réactifs à température du laboratoire, mais ceux qui
utilisent des réactifs à 37 °C ne sont pas totalement
dépourvus d'anomalies (Siemens).
Divers
Des bulles d'air résultant de fuites dans les tuyauteries
des AHC peuvent se mélanger au flux de cellules et perturber
les techniques de numération par impédance [2]. De même, la
contamination des réactifs (poussière, champignons) ou des débris
introduits dans l'analyseur peuvent fausser la numération des PLT.
Un nettoyage et des techniques de mesure du bruit de fond
selon les préconisations des constructeurs sont nécessaires, tout
comme le respect du contrôle de qualité, et permettent en général
d'éviter de tels ennuis. Dans les échantillons sanguins trop
âgés (au-delà de 1 à 2 jours) des variations du volume
plaquettaire peuvent modifier la distribution Log normale des
volumes des PLT et une impossibilité à générer une courbe
lissée, ce qui diminue la précision de la mesure [2, 55].
Les automates des générations précédentes
Certains AHC des générations précédentes, comme l'Hemalog 8
(Technicon-Bayer), réalisaient la numération des PLT sur le sang
total après lyse des GR. Avec cette technique, diverses particules
intra-érythrocytaires comme le noyau des érythroblastes, les corps
de Howell-Jolly, les parasites de type Plasmodium, et de gros
agrégats de corps de Pappenheimer (le cas échéant) étaient libérés
dans les AHC lors de l'hémolyse et perturbaient la numération des
PLT [56]. D'autres anomalies comme des stromas érythrocytaires
agrégés par des anticorps, dans le cadre d'anémies hémolytiques,
ont été rapportées comme pouvant augmenter la numération des PLT
sur certains anciens AHC [56].
Commentaires
La pseudothrombopénie induite par l'EDTA est certainement
l'anomalie la plus fréquemment associée à des décomptes erronés sur
les AHC, bien qu'elle soit liée à des conditions préanalytiques et
non à l'AHC lui-même. Même avec les matériels les plus performants,
un message d'alerte n'est pas constant et, chez un patient inconnu,
une numération plaquettaire basse sur l'AHC doit au moins faire
rechercher la présence d'éventuels amas plaquettaires, soit sur le
frottis sanguin, soit dans une chambre hématimétrique. De tels
échantillons ne devraient pas être réchauffés car la dissociation
des agrégats est aléatoire ; dans la plupart des cas, un autre
échantillon sanguin (sang prélevé sur citrate de sodium) sera
utile. Les diverses autres situations qui peuvent induire de
fausses numérations plaquettaires sont reportées dans le tableau 2 et correspondent à des
situations plus ou moins rares. Même si l'on possède l'explication
d'une numération erronée, la même cause génère des écarts entre le
résultat vrai et le résultat faux, variables d'un patient à
l'autre. De plus, comme mentionné dans le tableau 2, certaines anomalies sont
restreintes aux PLT, mais le plus souvent, une fausse numération
plaquettaire est associée à une ou plusieurs autres anomalies de
l'hémogramme. Il faut avoir à l'esprit que dans de nombreux
cas, les messages d'alerte concernant la numération des PLT sont
générés à partir de l'histogramme biparamétrique de la formule
leucocytaire : les AHC qui n'analysent pas les sous-populations
leucocytaires (AHC sans formule leucocytaire 5 paramètres)
vont donc plus fréquemment négliger ces anomalies de décompte.
De même, pour le fonctionnement hospitalier, le choix
d'utiliser le mode de décompte « numération globulaire » de son AHC
sans le mode « formule leucocytaire » nécessite de bien comprendre
quels messages d'erreur on supprime de ce fait.
Conflit d'intérêts
aucun.
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