ARTICLE
Auteur(s) : J Baraud, F Schellenberg, J-C
Pagès
Laboratoire de biochimie et biologie moléculaire,
Hôpital Trousseau, CHRU de Tours
Article reçu le 31 Mars 2009, accepté le 5 Juin 2009
La transferrine est une bêta-glycoprotéine présentant plusieurs
niveaux d’hétérogénéité structurale. Les variations peuvent
affecter la chaîne peptidique, les chaînes oligosaccharidiques
fixées sur les asparagines 413 et 611 qui peuvent être bi-, tri-,
ou tétra-antennées, et enfin le nombre d’ions ferriques transportés
(de 0 à 2). Le nombre d’acides sialiques terminaux des chaînes
oligosaccharidiques détermine des glycoformes. Les principales
formes présentes dans le plasma portent de 2 à 5 acides sialiques
terminaux.
Stibler a montré que les glycoformes désialylées
(disialotransferrine [DiST] et asialotransferrine [AST]) de la
transferrine étaient anormalement élevées chez les patients
alcooliques chroniques [1]. Cette observation a permis une
définition de la CDT (carbohydrate deficient transferrin) qui
correspond à la somme de la DiST et de l’AST. Le résultat
s’exprime en pourcentage de CDT par rapport à la transferrine
totale. La CDT s’est avérée être le marqueur sanguin le plus
spécifique de la consommation alcoolique chronique [2] parmi ceux
qui sont utilisables en pratique quotidienne. La valeur
diagnostique de ce paramètre est nettement plus élevée que celle
des marqueurs antérieurement utilisés, GGT (gammaglutamyl
transférase) ou VGM (volume globulaire moyen). Le dosage de la
CDT est utilisé dans le diagnostic d’alcoolisme chronique, le suivi
de sevrage dans le cadre thérapeutique et dans un contexte
médico-légal, commission de permis de conduire par exemple.
Le dosage de la CDT est effectué le plus souvent par des
méthodes chromatographiques (HPLC) ou électrophorétiques
(électrophorèse capillaire). Dans ce dernier cas, les glycoformes
sont séparées par une migration à pH alcalin sous une tension
élevée (7-9 kV), et détectées par la mesure de l’absorbance de
la liaison peptidique à 200 nm. Une application existe pour
l’appareil d’électrophorèse capillaire Capillarys™ (Sebia, Evry,
France), présentant de bonnes performances analytiques [3] et une
cadence élevée intéressante pour un laboratoire de routine.
Toutefois, cette technique peut être affectée par une ligne de
base irrégulière qui rend impossible une quantification correcte de
la CDT. En effet, la mesure d’absorbance prend en compte toutes les
protéines migrant, comme les glycoformes de transferrine, dans la
zone des bêtaglobulines (bloc bêta gamma chez le cirrhotique,
dysglobulinémies monoclonales à chaînes entières ou à chaînes
légères libres) : elle n’est donc pas une mesure spécifique de la
CDT. De plus, dans un nombre limité de situations, l’existence
d’un pic de même amplitude que le pic de tétrasialotransferrine
(TeST) conduit à considérer à tort que l’échantillon provient d’un
sujet hétérozygote BC ou CD. Dans ces cas, la variation génétique
n’est pas confirmée par une mesure utilisant la méthode proposée
comme méthode de référence [4].
L’immunopurification des échantillons a été proposée comme
méthode de choix pour éliminer les interférences aboutissant à des
profils anormaux ou à des lignes de base affectées de dérives
importantes [5]. A cet effet, la société Sebia a mis au point
un antisérum tétravalent anti-immunoglobulines (chaînes α, γ, κ, λ)
et un antisérum anti-transferrine. L’application de ces deux
solutions précède la migration, le traitement est effectué
automatiquement par l’analyseur Capillarys2™.
Le présent travail avait pour but d’évaluer l’intérêt de
l’immunosoustraction des immunoglobulines (Ig soustraction) ou de
la transferrine (Trf soustraction) dans la technique de dosage de
la CDT par électrophorèse capillaire sur un appareil Capillarys2™
(Sebia).
Matériels et méthodes
Echantillons
Dans le laboratoire de biochimie et biologie moléculaire de
l’hôpital Trousseau CHRU de Tours, nous avons recueilli les sérums
de patients porteurs d’anomalies sur le protéinogramme
(perturbation dans les bêta et gammaglobulines) et/ou
d’augmentation des chaînes légères libres monoclonales.
Les sérums provenaient de bilans biologiques prescrits par les
services cliniques, et pour cette étude nous avons utilisé la
fraction non utilisée (« fond » de tube). Cinquante-quatre
échantillons ont été inclus dans cette étude, appartenant à 2
groupes différents. Le premier groupe comprenait 48 patients
avec une anomalie qualitative ou quantitative des immunoglobulines
(22 pics monoclonaux en zone bêta, 8 pics monoclonaux en zone
gamma, 14 hypergammaglobulinémies importantes [dont 9 blocs
bêta-gamma], 4 patients avec des chaînes légères libres
monoclonales > 1 g/L). Le second groupe était
constitué de 6 patients classés comme variants génétiques BC de la
transferrine par le dosage de la CDT sur Capillarys™.
Les échantillons étaient conservés à - 20 °C jusqu’à
leur utilisation.
Technique
L’électrophorèse capillaire a été réalisée pour tous les
échantillons sur un appareil multicapillaire d’analyse de routine
des protéines, le Capillarys2™ (Sebia). Les réactifs
provenaient du kit commercial Capillarys CDT incluant la solution
tampon (pH 8,8), la solution de rinçage, le diluant et les
consommables plastiques. La technique est totalement
automatisée que ce soit en méthode standard ou en méthode avec
soustraction. La version du programme de l’automate utilisée
durant cette étude était la révision 6.1.2 du programme du
Capillarys.
Quel que soit le résultat de la mesure de la CDT, les 48
premiers échantillons constituant le premier groupe ont tous été
soumis à une électrophorèse après Ig soustraction. Dans cette
configuration, le dosage utilise un sérum tétravalent composé
d’immunoglobulines de lapin dirigées contre les chaînes α, γ, κ, et
λ, fourni par la société Sebia. Techniquement, le sérum du patient
est injecté dans le capillaire après saturation en fer, l’antisérum
est injecté secondairement. Ce dernier migre plus vite que
l’échantillon, le rejoint, se lie aux immunoglobulines et chaînes
légères libres, et les entraîne en dehors de la zone de migration
de la transferrine. Lors de la mesure d’absorbance le sérum
apparaît dépourvu d’immunoglobulines et de chaînes légères
libres.
Les échantillons classés comme variants génétiques de la
transferrine constituant le second groupe ont été analysés après
transferrine soustraction. Le sérum anti-transferrine est
composé d’immunoglobulines de mammifère anti-transferrine.
Le principe est le même que pour le sérum tétravalent.
Le profil obtenu correspondra dans ce cas aux protéines qui
persisteront dans la zone théorique de la transferrine.
Interprétation
Nous avons défini des critères d’interprétation pour le dosage de
CDT sans ou avec immunosoustraction : individualisation des
différentes isoformes de la transferrine, ligne de base la plus
horizontale et stable possible et une densité optique maximale
suffisante (DO > 0,050). Pour la soustraction de la
transferrine, la disparition de tous les pics permet d’affirmer
qu’ils étaient constitués de transferrine. Dans ce cas,
l’échantillon traité provenait effectivement d’un sujet
hétérozygote BC ou CD. La persistance d’un pic permet
d’éliminer cette hypothèse, elle ne permet pas pour autant de
rendre un résultat de CDT.
Résultats et discussion
Parmi les 48 échantillons analysés, 28 présentaient à
l’électrophorèse capillaire une irrégularité de la ligne de base ou
un pic plus ou moins important pouvant masquer les glycoformes de
transferrine (figure
1). Cependant, un résultat acceptable était observé dans 19
cas, quand le pic observé était en dehors de la zone de la
transferrine ou quand l’altération de la ligne de base n’empêchait
pas une intégration acceptable des glycoformes de transferrine.
L’Ig soustraction a conduit à une amélioration partielle ou
complète des tracés dans 39 cas (tableau 1). Le nombre de tracés
permettant une intégration acceptable des glycoformes de
transferrine est ainsi passé de 19 à 38 (37 en ne considérant pas
un supposé variant génétique amélioré par l’Ig soustraction). Nous
avons vérifié que les résultats obtenus avant et après Ig
soustraction pour les 19 échantillons initialement quantifiés
étaient identiques ou non significativement différents.
Le tableau 1 indique pour
chaque groupe d’anomalies le nombre de résultats fiables obtenus
avant (n = 19) et après (n = 38) Ig soustraction. L’efficacité de
l’immunosoustraction était très bonne pour les sérums présentant un
pic dans la zone des bêtaglobulines, le nombre de résultats
interprétables passant de 7 à 19 pour 22 échantillons. L’Ig
soustraction s’est montrée moins efficace dans les échantillons
présentant un bloc bêta-gamma ou une augmentation importante des
gammaglobulines, avec un gain de 2 résultats sur 14 échantillons
traités. Parmi les échantillons pour lesquels l’immunosoustraction
n’avait pas permis d’aboutir à un résultat, deux présentaient une
absence de séparation entre la trisialo- et la disialotransferrine
connue sous le nom de ditribridge et rencontrée dans les atteintes
hépatiques [6]. Ce groupe d’échantillons reste difficile, la
méthode CLHP ne donnant un résultat que pour 7 échantillons des 13
(dans un cas, le volume d’échantillon était insuffisant pour
l’analyse en CLHP).
L’Ig soustraction a échoué dans 2 situations de pic dans les
gammaglobulines dont la concentration de la protéine monoclonale
était supérieure à 60 g/L. Il est possible que le titre
des anticorps utilisés ne permette pas l’épuration d’Ig monoclonale
à de telles concentrations. Dans plusieurs autres cas, les
altérations de la ligne de base dans la zone de la
pentasialotransferrine n’ont pas été améliorées par le traitement.
Il est possible qu’une augmentation du C3 ait contribué à
cette anomalie.
Parmi les échantillons présentant un pic monoclonal, 4
comportaient une IgM (chaîne lourde μ). Malgré l’absence
d’anticorps anti-μ, le traitement de ces 4 échantillons a été
efficace, ce qui montre que les IgM peuvent être extraites par leur
seule chaîne légère.
Six échantillons étaient classés comme variants BC de la
transferrine lors de l’analyse initiale. Le logiciel du
Capillarys™ aboutit à cette conclusion lorsque 2 pics importants et
contigus sont détectés dans la zone de la tétrasialotransferrine.
L’Ig soustraction n’a pas modifié le profil de ces échantillons,
bien que l’un n’ait plus été classé comme variant après le
traitement. Cinq de ces échantillons ont été soumis à une
soustraction de la transferrine. Parmi ceux-ci, deux présentaient 2
pics dans la zone de la pentasialotransferrine ; ces pics
demeuraient identiques après Ig soustraction ou soustraction de la
transferrine, signifiant qu’ils n’étaient pas constitués
d’immunoglobulines ni de transferrine. De plus, l’analyse de
ces échantillons en HPLC a confirmé que ces 2 sérums étaient
homozygotes C et non des variants BC. Un des deux avait été
quantifié par le système, fournissant un résultat ne pouvant être
considéré comme fiable. Pour les trois autres échantillons, la
disparition de tous les pics a confirmé qu’il s’agissait
effectivement de variants BC de la transferrine.
Tableau 1 Efficacité de la soustraction des
immunoglobulines ou de la transferrine selon le type d’anomalie des
immunoglobulines ou la détection d’un variant génétique dans le
dosage de la CDT par électrophorèse capillaire. Les deux
patients classés à tort comme variants génétiques par le Capillarys
n’ont pas été inclus dans ce tableau.
|
Nombre
|
Nombre de résultats
|
|
Avant Ig soustraction
|
Après Ig soustraction
|
|
Fraction monoclonale dans les bêtaglobulines
|
22
|
7 (0,32)
|
19 (0,86)
|
|
Fraction monoclonale dans les gammaglobulines
|
8
|
3 (0,38)
|
6 (0,75)
|
|
Hypergammaglobulinémie
|
14
|
7 (0,50)
|
9 (0,64)
|
|
Chaîne légère libre monoclonale
|
4
|
2 (0,50)
|
3 (0,75)
|
|
Variant génétique
|
4
|
0 (0,00)
|
1 (0,17)
|
|
Total
|
52
|
19 (0,35)
|
38 (0,70)
|
Conclusion
L’immunosoustraction des immunoglobulines permet de diviser par 2
le nombre de cas où une protéine monoclonale empêche la mesure de
la CDT en électrophorèse capillaire, aboutissant à un résultat
interprétable plus de 8 fois sur 10. L’automatisation de cette
procédure sur Capillarys™ permet son utilisation en pratique
courante pour les échantillons présentant une altération de la
ligne de base ou un profil anormal. Elle ne permet cependant pas de
statuer sur les échantillons considérés comme variants génétiques
par l’analyseur. L’existence d’un variant devra être confirmée par
une immunosoustraction de la transferrine ou par la ré-analyse de
l’échantillon par une technique CLHP.
Remerciements
Les auteurs remercient la société SEBIA pour le prêt de l’appareil
et la fourniture des réactifs utilsés dans cette étude.
Références
1 Stibler H. Carbohydrate-deficient transferrin in serum : a
new marker of potentially harmful alcohol consumption reviewed.
Clin Chem 1991 ; 37 : 2029-37.
2 Arndt T. Carbohydrate-deficient transferrin as a marker
of chronic alcohol abuse : a critical review of preanalysis,
analysis, and interpretation. Clin Chem 2001 ; 47 :
13-7.
3 Bortolotti F, De Paoli G, Pascali JP,
Tagliaro F. Fully automated analysis of carbohydrate-deficient
transferrin (CDT) by using a multicapillary electrophoresis system.
Clin Chim Acta 2007 ; 380 : 4-7.
4 Helander A, Husa A, Jeppsson JO. Improved HPLC
method for carbohydrate-deficient transferrin in serum. Clin Chem
2003 ; 49 : 1881-90.
5 Lanz C, Falmagne JB, de l’Escaille F,
Marti U, Thormann W. Determination of
carbohydrate-deficient transferrin in human serum with capillary
zone electrophoresis. Sample preparation strategies for the removal
of interferences caused by increased levels of immunoglobulins. J
Chromatogr A 2008 ; 1206 : 33-40.
6 Arndt T, van der Meijden BB, Wielders JP.
Atypical serum transferrin isoform distribution in liver cirrhosis
studied by HPLC, capillary electrophoresis and transferrin
genotyping. Clin Chim Acta 2008 ; 394 : 42-6.
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