ARTICLE
Auteur(s) : C
Surcouf, D Delaune, T Samson, V Foissaud
Service de biologie, Hôpital d’Instruction des Armées
Percy, Clamart
Article reçu le 13 Avril 2009, accepté le 5 Juin 2009
Les progrès des automates de numération, de la cytométrie de
flux et de la biologie moléculaire n’ont jamais détrôné la
cytologie. L’étude de la morphologie cellulaire garde sa place et
la classification du groupe French American British (FAB) reste la
classification de l’urgence des hémopathies aiguës. Mais la
cytologie a ses inconvénients qui sont, outre la relative
difficulté de recourir à un expert, l’absence de traçabilité
(l’immense majorité des frottis sanguins n’est pas mémorisée) et
son caractère chronophage notamment chez l’aplasique. Cette
discipline n’attendait plus de grande nouveauté et pourtant la
société Roche Diagnostics distribue un matériel innovant, le
CellaVision DM8/96TM, qui propose une analyse
morphologique du frottis sanguin pour les lignées leucocytaire,
érythrocytaire et une aide à la numération plaquettaire.
Le cytologiste garde le contrôle du résultat qu’il visualise à
l’écran afin de le corriger et de le valider. Nous avons testé ce
matériel pendant trois jours sur 99 frottis générés par l’activité
de routine dans le but d’évaluer ses performances, sa praticabilité
et son intérêt potentiel dans les laboratoires de cytologie.
Présentation du CellaVision DM8/96TM
Le CellaVision DM8/96TM est constitué d’un microscope
motorisé dont la partie optique est équipée de trois objectifs x10,
x50, x100, les deux derniers à immersion avec distribution d’huile
automatique. L’ensemble est placé à l’abri de la poussière sous
carrosserie métallique (figure 1).
Ce microscope est piloté par un logiciel d’acquisition et de
classification CellaVision Blood DifferentialTM installé
sur ordinateur PC sous système d’exploitation Windows. Deux modèles
sont disponibles, le DM8TM et le DM96TM
capables d’embarquer respectivement 8 et 96 lames par série.
Le système est conçu pour lire des frottis minces étalés et
colorés au May Grünwald Giemsa (MGG) par un étaleur colorateur type
SP-1000i SysmexTM ou des frottis manuels si leur minceur
est suffisante. L’informatique pilote le microscope en trois temps
: 1) détermination au x10 d’une zone « monocouche » d’hématies, 2)
repérage au x50 des éléments à photographier, 3) puis retour sur
chaque élément pour une photographie au x100. L’utilisateur peut
demander la recherche de 100 à 400 éléments nucléés par frottis.
Le logiciel effectue une reconnaissance morphologique et un
classement en 12 populations leucocytaires : neutrophiles
précurseurs, neutrophiles matures, éosinophiles, basophiles,
lymphocytes, monocytes, promyélocytes, myélocytes, métamyélocytes,
cellules blastiques, variantes de lymphocytes et plasmocytes. À ces
catégories s’ajoutent les cellules non identifiées, érythroblastes,
thrombocytes géants, agglutinations thrombocytaires, cellules à
corbeilles et artefacts. La morphologie érythrocytaire est
étudiée par production d’un score de 0 à 3 points pour 6 anomalies
: polychromasie, hypochromasie, anisocytose, microcytose,
macrocytose et poïkilocytose. L’opérateur peut ajouter les
anomalies suivantes : codocytes, schizocytes, drépanocytes,
sphérocytes, elliptocytes, ovalocytes, dacryocytes, stomatocytes,
acanthocytes, échinocytes, corps de Howell-Jolly, corps de
Pappenheimer, hématies ponctuées, parasites ainsi que 10 autres
catégories qu’il peut définir selon ses besoins.
La concentration plaquettaire peut être évaluée avec
participation de l’opérateur par comptage dans un aperçu d’image.
Les résultats bruts - avant validation biologique - sont
produits à la cadence théorique de 30 frottis à l’heure sur une
centaine de cellules. Les données brutes de la formule
leucocytaire sont affichées sur un écran plat de 19 pouces sous
forme d’images unitaires de leucocytes groupées selon les
catégories morphologiques et d’un champ d’hématies pour apprécier
la morphologie érythrocytaire. Une étude d’imprécision (données
fabricant) effectuée sur 219 échantillons avance un écart standard
de 4,7 % sur les neutrophiles et 5,0 % sur les lymphocytes.
L’automate ne travaille pas en automatisme, c’est-à-dire qu’il ne
valide pas seul son travail. Le cytologiste doit consulter
l’ensemble des images, apporter ses corrections éventuelles et
valider les résultats. Les dossiers, numération et images,
sont archivés sur disque dur avec sauvegarde possible sur cédérom
(graveur). Le système est interfaçable en réseau à travers une
licence de consultation System Review ou par doublement du système
et partage de données (télémédecine). Le DM96TM
peut transmettre ses images par email au format jpg. Grâce à une
connexion bidirectionnelle à la chaîne Alpha (automate XE-2100
SysmexTM + étaleur colorateur SP-1000iTM), le
SP-1000iTM imprime le n° de demande en code à barre sur
chaque lame. Ainsi le DM96TM lit le numéro de demande,
télécharge la numération depuis le concentrateur de résultats MPL
Roche DiagnosticsTM et transmet en retour la formule
validée par le cytologiste. Le DM96TM peut aussi
fonctionner à partir de frottis manuels, à condition que ceux-ci
soient très minces et très réguliers. L’utilisateur doit alors
coller un code à barre d’identification sur chaque lame et recopier
ses résultats sur l’informatique centrale. Les lames de verre
doivent être à coins rodés et polis.
Contexte de l’étude et méthodes
L’appareil testé au laboratoire de biologie de l’Hôpital
d’instruction des armées (HIA) Percy est un DM96TM réglé
pour l’occasion sur la recherche de 200 cellules par frottis ; 99
étalements sont prélevés sur la routine du laboratoire (tableau 1) ; 87 sont étalés par le
SP-1000iTM et 12 frottis d’un même sang sont étalés
manuellement par 3 opérateurs sensibilisés à la nécessaire finesse
du frottis (chacun 4 lames). Tous les étalements sont colorés par
le SP-1000iTM au May Grünwald Giemsa à pH 7,2.
Les lames sont expertisées en parallèle par le même
cytologiste en microscopie traditionnelle (méthode de référence) et
sur le DM96TM. Les délais opératoires sont mesurés
pour les deux méthodes depuis l’instant où le frottis est
disponible sur l’étaleur colorateur jusqu’à la fin de la validation
technique sur MPLTM. On considère pour cet essai que le
DM96TM est connecté au MPLTM.
Tableau 1 Échantillons de l’étude.
|
Frottis totaux
|
Étalés par SP-1000iTM
|
Étalés manuellement
|
Colorés par SP-1000i MGG pH 7,2
|
Numération leucocytaire de 1 à 75 G/L
|
Aplasiques < 1 G/L
|
Échecs de lecture
|
|
99
|
87
|
12
|
99
|
88
|
11
|
1
|
Résultats et discussion
Praticabilité
Les frottis sont disposés par portoir de 8 lames provoquant le
démarrage automatique de la lecture dès la fermeture du tiroir.
Après lecture, les lames sont restituées dans leur portoir
recouvertes d’une goutte d’huile à essuyer avant archivage.
L’interface logicielle est très intuitive. Il faut moins d’une
heure pour appréhender l’essentiel des fonctionnalités du système
sous Windows. L’appareil est conçu pour lire des frottis très
minces, mais il n’a refusé qu’une lame sur les 12 frottis étalés
manuellement. Il n’est pas possible de faire varier la lumière
ni la mise au point du microscope. L’image numérique semble un peu
plus « dure », plus contrastée qu’au microscope traditionnel.
Précisons que la caméra numérique du DM8/96TM est
calibrée avec une coloration « usine » au MGG à pH 6,8 (tendance
rose) alors que le pH de notre coloration est de 7,2 (tendance
bleue), ce qui contribue à l’accentuation du contraste des
granulations. Il est sans doute préférable de s’approcher du
pH préconisé pour optimiser la lecture.
Cadence de travail
La vitesse de lecture est remarquable puisque le DM96TM
photographie 200 éléments en 2 min 30 s environ,
hors aplasies, soit une cadence supérieure à celle d’un opérateur
entraîné (tableau 2). Pour chaque
frottis, le nombre de cellules étudiées par le DM96TM
(100 à 400) est plus important qu’en cytologie de routine où l’on
examine rarement plus de 100 cellules hormis le contexte
particulier des hémopathies au diagnostic. Cette capacité de
comptage peut contribuer au dépistage d’événements morphologiques
rares, s’ils se trouvent dans la zone mince du frottis.
Tableau 2 Comparaison des temps opératoires, de la
lecture du frottis au rendu du résultat dans le SIL.
Le cytologiste travaillant en série continue (lames étalées et
colorées par le SP-1000iTM, automate DM96TM
connecté au concentrateur MPLTM).
|
Jour d’étude
|
Nombre de lames
|
Temps DM96
|
Temps microscopie traditionnelle
|
Gain de temps avec DM
|
|
J1
|
19 lames
|
0 h 59
|
1 h 23
|
29 %
|
|
J2
|
22 lames
|
1 h 05
|
1 h 41
|
36 %
|
|
J3
|
21 lames
|
0 h 58
|
1 h 18
|
26 %
|
Reconnaissance d’images leucocytaires
Après lecture et classement par l’automate des cellules au sein des
différentes catégories énumérées ci dessus, le cytologiste procède
à une correction (figure 2).
Le DM96TM a placé en moyenne 6,6 cellules par
dossier dans la catégorie des cellules « non identifiées ».
Le reclassement d’une image vers sa vraie lignée
d’appartenance s’effectue très simplement avec la souris en «
glissé-déposé ». La notion de band cells étant peu utilisée en
routine, ces cellules ont été reclassées par le cytologiste dans
les neutrophiles matures ou les métamyélocytes selon leur
morphologie. On constate que les erreurs du DM96TM sont
mineures pour les numérations leucocytaires supérieures à
2 G/L si l’on excepte les hémopathies malignes.
Les granuleux ne font pas l’objet d’erreur de lignée, les
éosinophiles sont bien identifiés et le système reconnaît même
certains éosinophiles éclatés. Le regroupement des lymphocytes
à l’écran offre une grande sensation de confort visuel qui facilite
la mise en évidence d’anomalies morphologiques récurrentes.
Les lymphocytes activés contrastent nettement avec les
lymphocytes normaux. Rappelons que le système ne propose pas de
diagnostic à partir des atypies lymphocytaires. Il classe en «
corbeille » et/ou en « artefact » les cellules éclatées ou les
débris cellulaires et nous n’avons pas observé de leucocytes
normaux dans ces deux catégories. Les agrégats plaquettaires
sont très bien identifiés. On est surpris de la fréquence des
macroplaquettes chez la plupart des patients. Il est
d’ailleurs prudent de fixer un seuil de signalement élevé.
Les seules erreurs récurrentes dans notre population sont des
myélémies par excès, quelques confusions entre artefacts de grande
taille et polynucléaires basophiles et le passage de petits blastes
dans la population lymphocytaire. Le zoom sur une cellule est
possible, mais il s’agit d’un zoom numérique à quantité de pixels
fixe. Il permet de mieux détailler une anomalie type corps
d’Auer ou corps de Döhle. Notons que les ombres de Gumprecht
peuvent être, selon le contexte, reclassées par le cytologiste
parmi les lymphocytes. Ainsi les images sont d’assez bonne qualité
pour permettre le reclassement de quelques cellules avec certitude
(en dehors d’hémopathies) et aucune lame n’a demandé de corrections
importantes.
Qualité des formules leucocytaires
Nous avons choisi de comparer la formule leucocytaire établie à
l’aide du DM96TM à celle obtenue par microscopie
traditionnelle en excluant les aplasies, évoquées à part, et les
hémopathies malignes étudiées en microscopie traditionnelle.
L’effectif de lame devient n = 62. En raison de la présence
d’images de cellules « non identifiées » dans les résultats bruts
du DM96TM, nous considérons ses résultats après
validation par le cytologiste en ayant recours à deux méthodes
statistiques de comparaison :
- – l’étude de corrélation associée à un test t montre une
très bonne corrélation pour l’ensemble des lignées entre
DM96TM après validation et microscopie pour toutes les
populations leucocytaires (tableau 3). Les meilleures performances
sont obtenues avec les cellules morphologiquement « simples » que
sont les granuleux (polynucléaires + précurseurs) et les
lymphocytes normaux. Kratz et al. ont publié des données
similaires [1]. L’étude de corrélation pour les polynucléaires
basophiles est peu pertinente étant donné leur faible pourcentage
(entre 0 et 3 %) sur les échantillons analysés ;
- – l’étude de comparaison d’échantillons appareillés à
l’aide du test z montre l’absence de différence significative entre
les populations leucocytaires excepté pour les lymphocytes (p =
0,02). Cette différence faiblement significative doit être tempérée
car elle repose sur les résultats très dispersés de seulement deux
frottis dont les valeurs diffèrent jusqu’à 20 % entre cytologiste,
DM96TM et automate XE-2100TM. On incrimine
l’effet frange déjà observé [2] avec les étaleurs colorateurs
vis-à-vis duquel le DM96TM ne propose pas, à notre
connaissance, de stratégie lors de la saisie d’image.
Ces deux tests statistiques traitent uniquement de l’aspect
quantitatif des formules sans tenir compte de l’interprétation
biologique. Ainsi on pourrait conclure que les résultats du
DM96TM sont excellents. C’est vrai mathématiquement.
La réalité est plus complexe puisque l’apport théorique d’une
formule leucocytaire n’est pas seulement quantitatif, il est aussi
morphologique avec des anomalies que va omettre le
DM96TM sans jamais bousculer la « corrélation », telles
que dysgranulopoïèse, dysmonopoïèse, corps de Döhle, ou toute autre
anomalie fine. D’autres anomalies peuvent au contraire modifier
profondément la formule comme la nécessité de compter les ombres de
Gumprecht en tant que lymphocytes dans la leucémie lymphoïde
chronique. Le cytologiste reste donc maître du résultat final
en ajoutant la touche morphologique que n’apporte pas encore la
reconnaissance d’image et les hémopathies restent l’apanage du
microscope traditionnel, au moins au diagnostic.
Tableau 3 Comparaison des formules rendues par le
DM96TM et par le cytologiste (n = 62) (NS = non
significatif).
|
Facteur de corrélation r2
|
Test z
|
|
Polynucléaires neutrophiles
|
0,9007 (p < 0,001)
|
NS
|
|
Polynucléaires éosinophiles
|
0,7865 (p < 0,001)
|
NS
|
|
Immatures granuleux
|
0,6591 (p < 0,001)
|
NS
|
|
Lymphocytes
|
0,9184 (p < 0,001)
|
p = 0,02
|
|
Monocytes
|
0,5516 (p < 0,001)
|
NS
|
Cas particulier de l’aplasie
Le système parvient à photographier au moins 30 leucocytes à partir
d’une numération de 0,2 G/L et presque 90 leucocytes à partir
de 0,5 G/L (tableau 4), donc
il couvre l’ensemble des formules leucocytaires utiles si l’on
considère qu’en deçà de 0,2 G/L la nature des leucocytes – «
normaux » versus blastes – devient moins intéressante. L’examen et
la validation technique de 9 frottis d’aplasie sont effectués en
environ 30 minutes, performance hors de portée d’un cytologiste
appliqué. Ainsi le DM96TM permet de suivre
quotidiennement et rapidement les patients les plus fragiles au
moment où la numération des granulocytes conditionne la
vulnérabilité aux infections bactériennes et fongiques. C’est un
apport singulier du DM96TM par rapport à l’automate
d’hématologie dont la formule automatisée chez l’aplasique est
presque toujours affublée de messages d’alarme.
Tableau 4 Échantillons de sujets en aplasie (< 1
G/L) - nombre d’événements bruts et de leucocytes réels
photographiés par le DM96TM.
|
Numération leucocytaire G/L
|
0,02
|
0,02
|
0,02
|
0,08
|
0,13
|
0,33
|
0,53
|
0,88
|
0,99
|
|
Nombre d’images demandées
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
|
Nombre d’événements bruts photographiés
|
124
|
41
|
20
|
40
|
40
|
100
|
143
|
205
|
308
|
|
Nombre de leucocytes réels validés
|
0
|
2
|
2
|
17
|
30
|
62
|
87
|
162
|
157
|
Lignée érythrocytaire
Nous n’avons pas évalué les performances en analyse de morphologie
érythrocytaire, mais le DM96TM propose un champ
d’hématies avec une fonction zoom suffisante pour étudier la
morphologie unitaire assortie d’un classement semi quantitatif des
anomalies. L’ajout de catégories au vu des images est facile, de
même que la rédaction de commentaires libres, même si nous doutons
de la possibilité de transmettre intégralement ces commentaires
dans l’informatique du laboratoire à travers le concentrateur
MPLTM.
Validation du dossier
Le cytologiste doit visualiser toutes les images et corriger les
erreurs. Il faut rarement plus d’une minute par lame pour
reclasser des images en présence d’anomalies courantes, telles que
myélémie, éosinophilie, érythroblastémie, basophilie, syndrome
mononucléosique, dystrophies des granuleux (pseudo-Pelger-Huet),
ombres de Gumprecht, etc. La difficulté peut venir de la
qualité de certaines images gênant la reconnaissance cellulaire.
Notons que la courte expérience de la machine ne nous a pas permis
de nous familiariser totalement avec les images les plus délicates
et que notre pH de coloration à 7,2 n’était pas optimum vis-à-vis
de la calibration de la caméra. Ces détails étant réglés, le
DM96TM permettra de valider l’immense majorité de la
série quotidienne de lames. Les plus difficiles seront
examinées en microscopie traditionnelle mais malgré tout
mémorisées. Le gain de temps total déjà observé par d’autres
équipes [2-4] est estimé à 30 % sur la cytologie classique.
L’impression des données chiffrées est possible depuis le
MPLTM. Elle est horodatée et précise les résultats
relatifs (%) et absolus de la formule sanguine, ainsi que l’étude
morphologique des hématies.
Traçabilité
Elle est complète, révolution en cytologie, puisque la formule est
archivée avec toutes ses images. Cet archivage peut se révéler
utile dans le suivi d’une hémopathie ou l’observation rétrospective
d’un cas.
Enseignement
Le gain de convivialité est considérable puisque la vocation du
système est d’être installé sur paillasse à proximité de l’automate
et de l’étaleur colorateur. L’image est alors immédiatement
disponible pour les techniciens et cytologistes. Le système
affiche sur demande des « cellules de référence » (figure 3).
Ces images fournies par le constructeur peuvent être
complétées par les images de la routine au gré du cytologiste.
Connexion, archivage des résultats
La connexion au concentrateur MPL permet d’importer les numérations
de l’automate. Le DM96TM constitue ainsi des
dossiers complets de numération formule, images comprises, sans
risque d’erreur d’identité. Les fichiers peuvent être
sauvegardés sur disque dur externe ou gravés sur DVD.
Travail à distance, télémédecine
Les Stations Review (logiciel pour PC sous Windows) sont des postes
clients permettant la consultation à distance d’une formule déjà
validée. Le DM96TM peut également, s’il est
connecté à un réseau type intranet ou internet, envoyer des images
cellulaires par email. La connexion de deux équipements
semblables permet de traiter intégralement la validation d’une
formule leucocytaire à distance, corrections comprises, dans une
activité d’expertise de type télémédecine.
Maintenance
Elle est quotidienne avec le nettoyage de la platine au chiffon sec
et hebdomadaire avec le nettoyage des objectifs et des guides de
lames. L’ensemble est d’une grande simplicité d’autant que le
carrossage protège le système optique de la poussière.
Limites actuelles du DM96TM
et développements souhaitables
Au plan technique, la possibilité de faire varier la mise au point
sur certaines cellules contribuerait à une meilleure qualité
d’image (réglages en « z »). La hiérarchisation des
lymphocytes par taille offrirait un confort visuel et des
informations morphologiques supplémentaires. Dans l’étude des
hématies, la saisie de plusieurs champs de grande taille semble
indispensable. Elle permettrait d’offrir une méthode alternative
pour le décompte des schizocytes, domaine très délicat de la
cytologie. Au plan matériel, un très grand écran comme il en existe
pour certains systèmes d’imagerie en anatomopathologie permettrait
un meilleur confort d’utilisation en limitant le recours aux «
ascenseurs » d’image. Ajoutons que la lecture du myélogramme n’est
pas réalisable sur DM96TM car les frottis sont
généralement épais et/ou trop riches pour le repérage des cellules,
mais il existe dans ce contexte d’autres systèmes de prise d’images
plus adaptés.
Conclusion
Au niveau des laboratoires hospitaliers ou privés, dans sa
configuration actuelle, le CellaVision DM8/96TM est un
outil de travail et de formation innovant et performant, capable de
faire gagner environ 30 % de temps sur les frottis de routine en
offrant une traçabilité inconnue en cytologie. Il intéresse
tous les laboratoires et notamment ceux qui soutiennent un service
d’hématologie clinique. L’examen du frottis sanguin à distance est
une fonctionnalité innovante qui mériterait d’être évaluée dans un
certain nombre de contextes : structures sanitaires de grande
taille, laboratoires isolés et expertise en temps réel par des
experts.
Références
1 Kratz A, Bengtsson HI, Casey JE, Keefe JM,
Beatrice GH, Grzybek DY, et al. Performance
evaluation of the CellaVision DM96 system : WBC differentials by
automated digital image analysis supported by an artificial neural
network. Am J Clin Pathol 2005 ; 124 : 770-81.
2 Cornet E, Perol JP, Troussard X. Performance
evaluation and relevance of the CellaVisionTM DM96 system in
routine analysis and in patients with malignant hematological
diseases. Int J Lab Hematol 2008 ; 30 : 536-42.
3 Ceelie H, Dinkelaar RB, van Gelder W.
Examination of peripheral blood films using automated microscopy :
evaluation of Diffmaster Octavia and CellaVision DM96. J Clin
Pathol 2007 ; 60 : 72-9.
4 Briggs C, Longair I, Slavik M, Thwaite K,
Mills R, Thavaraja V, et al. Can automated blood
film analysis replace the manual differential ? An evaluation of
the CellaVision DM96 automated image analysis system. Int J Lab
Hematol 2009 ; 31 : 48-60.
|
Version imprimable
Version PDF
