ARTICLE
Auteur(s) : H Kerspern, J-L Carré
Service de biochimie et biologie moléculaire, CHU de Brest
Article reçu le 4 Octobre 2007, accepté le 31 Decembre 2007
La L-carnitine est un ammonium quaternaire présent naturellement
chez tous les mammifères. Sa principale fonction est de faciliter
le transport des acides gras à longue chaîne à travers la membrane
mitochondriale permettant leur β-oxydation. Chez l’homme, le pool
endogène de carnitine, constitué de L-carnitine libre et d’esters
de carnitine, est maintenu constant par l’absorption de carnitine à
partir du bol alimentaire, par une synthèse endogène, et par une
réabsorption tubulaire importante. Les principaux troubles du
métabolisme de la carnitine sont des déficits ; ils
associent une cardiomyopathie, une myopathie touchant les muscles
squelettiques, une hypoglycémie et une hyperammoniémie. Des
déficits secondaires peuvent être observés dans l’hémodialyse, les
aciduries organiques, ou encore un traitement par l’acide
valproïque [1].
Il existe actuellement de nombreuses méthodes permettant le
dosage de carnitine plasmatique, parmi lesquelles la méthode
radioenzymatique, la chromatographie liquide (HPLC) ou la
spectrométrie de masse en tandem. Les méthodes
spectrophotométriques, utilisant comme enzyme la carnitine
déshydrogénase ou la carnitine acétyl transférase (EC 2.3.1.7),
restent cependant les plus appropriées pour une automatisation [2,
3]. Le but de notre étude a été d’établir une méthode qui puisse
être adaptée sur l’analyseur Dimension® HM, modèle
X-Pand (Dade Behring) sur un canal ouvert, et qui permette le
dosage de carnitine libre et totale dans le plasma grâce à la
carnitine acétyl transférase (CAT).
Matériels et méthodes
Principe
Le principe de la réaction est le suivant :
Cette réaction réversible est rendue unidirectionnelle par la
neutralisation du coenzyme A (CoA-SH) par le réactif d’Ellman
ou DTNB (acide 5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoïque)) qui
permet la formation du 5-thio-2-nitrobenzoate (TNB). La
concentration de TNB est mesurée par spectrophotométrie à 400 et
940 nm (940 nm étant la longueur d’onde utilisée pour
corriger les absorbances non spécifiques observées à 400 nm).
Après hydrolyse alcaline, le dosage de la carnitine totale (CT),
correspondant à la somme des carnitines libre (CL) et estérifiée
(CE), est réalisé dans les mêmes conditions que précédemment.
Réactifs
Les Annexes 1 et 2 précisent les références, la
préparation et la conservation des réactifs, le mode de
reconstitution des solutions de travail A et B, ainsi que la
procédure de préparation des Flex du Dimension® HM,
modèle X-Pand préconisée par la société Dade Behring.
Trois niveaux de contrôle sont utilisés pour la carnitine
libre : contrôle de bas niveau (CQ1) : solution à
12,50 μmol/L de L-carnitine (Sigma, réf. C7518) ;
contrôle de moyen niveau (CQ2) : pool de 50 ultrafiltrats
de plasmas recueillis chez des patients ne présentant cliniquement
aucun signe d’anomalie du métabolisme de la carnitine ;
contrôle de haut niveau (CQ3) : solution à 200,00 μmol/L de
L-carnitine. Les solutions de L-carnitine CQ1 et CQ3 sont préparées
indépendamment de la solution de calibration.
Pour la carnitine totale, un seul contrôle est passé
(CQ4) : il s’agit du pool de 50 ultrafiltrats ayant subi
une hydrolyse alcaline puis une neutralisation.
Tous les contrôles sont passés à chaque série.
Préparation des échantillons
Les échantillons sanguins ont été recueillis chez 123 adultes
volontaires (à jeun depuis au moins 12 heures) dans des tubes
héparinés (Vacutainer®, ref. 368484) centrifugés à 3
500 tours/min pendant 15 minutes ; les plasmas sont
immédiatement analysés ou congelés à - 20 °C. Deux millilitres de
plasma (frais ou congelé à - 20 °C) sont placés dans un
filtre Centricon Ultracel YM10 (Millipore) pour une ultrafiltration
à 8 450 tours/min (2 000 g), pendant une heure
à 25 °C. L’ultrafiltrat est ensuite recueilli pour
l’analyse.
Les échantillons pour le dosage de carnitine totale sont
préparés par hydrolyse alcaline : 200 μL d’ultrafiltrat
mélangés à 100 μL de NAOH 0,15 N sont hydrolysés pendant
une heure à 37 °C. Cet hydrolysat est ensuite neutralisé par
75 μL d’HCl 0,15 N. Un minimum de 180 μL
d’échantillon (ultrafiltrat pour la carnitine libre ou hydrolysat
pour la carnitine totale) est nécessaire pour des dosages en
double.
Paramètres du programme
Cette méthode en point final utilise un canal ouvert en mode
absorbance. Le mode de paramétrage du Dimension® HM,
modèle X-Pand a été fourni par la société Dade Behring et est
mentionné en Annexe 2. Le temps d’analyse est de
16 minutes. Une calibration en 5 points est réalisée
(0,00 ; 25,00 ; 50,00 ; 100,00 ;
200,00 μmol/L). Le mode de calcul utilisé est le mode Logit.
Protocole d’étude
La réalisation de cette étude suit le protocole rédigé par les
membres de la commission «Validation de techniques» de la Société
française de biologie clinique et les recommandations édictées par
celle-ci quant aux coefficients de variations (CV %) [4]. Les
caractéristiques analytiques suivantes ont été étudiées :
précision (répétabilité et reproductibilité), linéarité, limite de
détection, exactitude (test de surcharge), comparaison avec la
méthode de référence (spectrométrie de masse en tandem). L’étude
des interférences habituelles (hémolyse, turbidité, bilirubine) n’a
pas été réalisée ici. En effet, le dosage de la carnitine
s’effectue sur l’ultrafiltrat et non sur le plasma
directement : les filtres Amicon retenant toutes les molécules
de poids moléculaire supérieur à 10 000 Da, on ne retrouve
donc dans l’ultrafiltrat aucune de ces substances susceptibles
d’interférer. L’influence de la congélation sur un échantillon,
ainsi que la stabilité dans le temps des réactifs et des
calibrateurs ont également été testées. Enfin, nous avons établi
des valeurs de référence pour la technique étudiée.
Résultats
Répétabilité
L’essai de répétabilité pour la carnitine libre a été réalisé à
trois niveaux de concentration (bas, moyen et élevé à des
concentrations respectives de 12,50 ; 50,00 ; et
200,00 μmol/L), à partir de solutions de L-carnitine, en
réalisant 20 mesures de chaque niveau en une seule série.
Concernant la carnitine totale, l’essai de répétabilité a été
réalisé sur le contrôle CQ4. Compte tenu du nombre de dosages (n =
20) et du risque α choisi à 5 %, le calcul de l’intervalle de
confiance du CV donne une limite d’acceptabilité à 3,71 % pour
CQ1, 1,48 % pour CQ2, 1,28 % pour CQ3 et 4,68 % pour
CQ4. La répétabilité, présentée dans le tableau 1 et calculée aux trois niveaux de
concentration, répond donc aux critères de validation.
Tableau 1 Etudes de répétabilité et de reproductibilité
(carnitine libre (CL) sur 3 niveaux de contrôle et carnitine totale
(CT) sur un niveau de contrôle).
|
Répétabilité
|
Contrôles (n = 20)
|
Moyenne (μmol/L)
|
Ecart-type (μmol/L)
|
Coefficient de variation (%)
|
|
CQ1
|
12,48
|
0,44
|
3,52
|
|
CQ2
|
49,88
|
0,61
|
1,22
|
|
CQ3
|
200,55
|
1,37
|
0,68
|
|
CQ4
|
61,40
|
2,26
|
3,69
|
|
Reproductibilité
|
|
Moyenne (μmol/L)
|
Ecart-type (μmol/L)
|
Coefficient de variation (%)
|
|
CQ1
|
11,32
|
0,91
|
8,02
|
|
CQ2
|
33,49
|
0,81
|
2,42
|
|
CQ3
|
201,41
|
1,36
|
0,68
|
|
CQ4
|
60,89
|
2,99
|
4,91
|
Reproductibilité
L’essai de reproductibilité a été réalisé sur les mêmes contrôles
(CQ1, CQ2, CQ3, CQ4) à raison de 2 séries par jour pendant
5 jours. Chaque jour, deux mesures de chaque échantillon ont
été réalisées. Compte tenu du nombre de dosages (n = 10) et du
risque α choisi (5 %), l’intervalle de confiance du CV donne
un CV limite calculé de 8,59 % pour CQ1, 2,92 % pour CQ2,
1,52 % pour CQ3 et 6,76 % pour CQ4 (tableau 1), ce qui est tout à fait
acceptable.
Limite de quantification
La détermination de la limite de détection est difficilement
réalisable, dans la mesure où l’automate, en deçà d’un certain
seuil, ne rend pas une valeur mais un message d’alarme
(« résultat inférieur au domaine de calcul »). La limite
de quantification, plutôt que la limite de détection, a donc été
déterminée par des dilutions successives d’une solution à
250,00 μmol/L de carnitine servant également à l’étude de la
linéarité.
Pour le point de gamme 1/128 (1,95 μmol/L), l’automate rend
des résultats aléatoires : soit des valeurs, soit le message
d’alarme. Nous nous sommes donc intéressés à des dilutions
moindres, et pour le point de gamme 1/64 dilué aux 2/3, soit
environ 2,60 μmol/L, l’automate rend des valeurs tout à fait
répétables (CV = 8,90 %). Nous avons donc fixé à
3,00 μmol/L la valeur de la limite de quantification.
Linéarité
La linéarité a été étudiée grâce à une gamme de dilution
géométrique de progression 2 à partir d’une solution de L-carnitine
à 250,00 μmol/L. Trois gammes ont été passées chaque jour sur
l’automate, pendant trois jours consécutifs, et tous les points de
gamme ont été mesurés en double. Compte tenu de la limite de
quantification déterminée au paragraphe précédent, nous n’avons
conservé que les valeurs supérieures à 3,00 μmol/L.
L’observation des résultats et la courbe obtenue permettent de
conclure à une linéarité parfaite de 3,00 à 250,00 μmol/L
(figure 1).
Exactitude (test de surcharge)
Les solutions utilisées pour la surcharge ont été celles préparées
pour l’étude de linéarité. Les concentrations s’étendent donc de
250,00 à 3,91 μmol/L, l’eau distillée étant utilisée pour le
point 0,00. La surcharge a été réalisée sur un ultrafiltrat
obtenu à partir d’un pool de 20 plasmas. Pour chaque dosage
(réalisé en double), un mélange à volume égal de la solution de
concentration connue et de l’ultrafiltrat a été réalisé et les taux
de carnitine libre et totale déterminés à chaque fois. Pour chacun
des deux tests (CL et CT), une droite de régression linéaire a été
établie entre les valeurs théoriques et les valeurs mesurées.
Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les
résultats théoriques de carnitine libre et totale, et ceux obtenus
avec l’ultrafiltrat surchargé. Les coefficients de corrélation
respectifs entre les deux tests sont de 0,998 et 0,994.
Comparaison avec la technique de référence (corrélation)
Quarante-trois échantillons ont été dosés à la fois par
spectrométrie de masse en tandem à l’hôpital Debrousse à Lyon, et
par spectrophotométrie sur l’automate Dimension® HM,
modèle X-Pand. Les résultats obtenus (figure 2) nous
donnent un biais négatif pour la méthode sur Dimension®
HM, modèle X-Pand de 6,18 % pour la CL et de 12,95 % pour
la CT. En réalisant un test de Student sur séries appariées, nous
ne mettons en évidence aucune différence significative entre les
taux de CL et CT obtenus par spectrophotométrie et ceux obtenus par
spectrométrie de masse en tandem.
Stabilité des réactifs
La stabilité des réactifs A et B reconstitués et placés dans un
« flex » a été testée. Pour cela, le flex est resté à
bord de l’automate pendant 18 jours. Le taux de carnitine
libre d’un pool de plasmas a alors été mesuré deux fois par jour.
Les résultats sont les suivants : perte à j+5 :
9,36 % ; perte à j+10 : 17,30 % ; perte à
j+15 : 22,39 % ; perte à j+18 : 26,73 %.
Une perte inférieure à 10 %, jugée comme acceptable, est
observée après 5 jours de préparation du flex. Nous avons donc
fixé à 5 jours la durée de vie maximale à bord de l’automate.
Ceci est tout à fait satisfaisant, dans la mesure où les
échantillons peuvent être congelés sans altération, et donc
regroupés par séries hebdomadaires.
Stabilité de l’échantillon à la congélation
Nous avons testé l’effet de 7 jours de congélation sur 5
ultrafiltrats (dosés en double). Nous ne mettons pas en évidence de
différence significative sur les taux de CL et CT entre les plasmas
frais ou congelés.
Stabilité des calibrateurs
A la congélation
L’éventuelle altération par la congélation à - 20 °C de
la solution concentrée de L-carnitine à 200,00 μmol/L servant
à reconstituer les calibrateurs a été étudiée. Pour cela,
différents points de gamme correspondant aux calibrateurs ont été
préparés à partir d’une solution à 200 μmol/L conservée un
mois à - 20 °C. Ces solutions ont été passées sur
l’automate avec la calibration du moment. Chaque point de gamme a
été dosé en double. Aucune différence significative n’a pu être
mise en évidence entre les valeurs trouvées à j0 et celles trouvées
à j30. La solution de calibration est donc considérée comme restant
stable un mois à - 20 °C.
A bord de l’automate
Quatre contrôles de qualité ont été passés en double
quotidiennement pendant un mois. Un mois après la calibration, les
contrôles passés quotidiennement rendent des valeurs correctes dont
les CV restent inférieurs aux CV limites calculés à partir de
l’intervalle de confiance du CV (6,85 % pour CQ1, 3,69 %
pour CQ2, 1,40 % pour CQ3 et 6,27 % pour CQ4). La
calibration est donc stable un mois au minimum.
Intervalles de référence
Les valeurs de carnitine libre et totale ont été mesurées dans le
plasma de 123 volontaires adultes (47 hommes et 76 femmes), ce qui
nous a permis d’établir des valeurs moyennes de référence :
24,15 à 43,39 μmol/L pour la carnitine libre, et 32,34 à
55,97 μmol/L pour la carnitine totale. L’âge moyen est de
42 ans (16 à 81 ans).
Discussion et conclusion
Nous décrivons ici une méthode de mesure de la carnitine libre et
totale dans le plasma, mise au point sur l’automate
Dimension® HM, modèle X-Pand (société Dade-Behring). Les
résultats obtenus pour la validation technique sont tout à fait
satisfaisants : cette méthode spectrophotométrique est
précise, simple et rapide (les résultats sont obtenus en moins de
20 minutes). La limite de quantification (3,00 μmol/L) et
la linéarité sont acceptables par rapport au domaine de mesure
habituellement exploité. La limite de quantification, pouvant
parfois être atteinte lors de déficits en carnitine (par exemple
chez l’hémodialysé), est cohérente par rapport à celle obtenue par
les autres méthodes automatisées [2, 3]. Le test de surcharge donne
un taux de recouvrement de 99,8 % pour la carnitine libre, et
de 99,4 % pour la carnitine totale. La stabilité des réactifs
à bord (5 jours), et celle de la solution de calibration (un
mois au minimum) sont largement compatibles avec une utilisation en
routine, d’autant que les dosages peuvent être réalisés par séries,
sur des échantillons dont la stabilité n’est pas altérée par la
congélation. Les interférences habituelles telles que l’hémolyse,
la bilirubine et les triglycérides n’interviennent pas ici du fait
de l’ultrafiltration. La comparaison avec la méthode par
spectrométrie de masse en tandem montre une excellente corrélation
(r > 0,956 pour CL et CT). Il n’a pas été mis en évidence de
différence significative entre les valeurs de CL et CT obtenues par
spectrophotométrie et par spectrométrie de masse en tandem.
Cependant, il est observé un biais négatif pour la méthode sur
Dimension® HM, modèle X-Pand respectivement de
6,18 % et de 12,95 % pour la CL et la CT. Il est
difficile de comparer ces résultats à ceux de la littérature car
les auteurs comparent le plus souvent la méthode
spectrophotométrique à la méthode radioenzymatique, ou à d’autres
méthodes spectrophotométriques [2, 3]. En outre, la corrélation
entre les deux méthodes spectrophotométriques automatisées
(Dimension® HM, modèle X-Pand et Hitachi 917) a révélé
un biais négatif pour la méthode sur X-Pand respectivement de
5,40 % et de 6,30 % pour la CL et la CT [2]. Les
intervalles de référence obtenus pour une population adulte (24,15
à 43,39 μmol/L pour la carnitine libre, et 32,34 à
55,97 μmol/L pour la carnitine totale) sont comparables à ceux
obtenus dans la littérature [5]. En définitive, cette méthode est
caractérisée par sa fiabilité et son automatisation, et donc sa
capacité à être employée dans un laboratoire de routine.
Remerciements
Les auteurs remercient le docteur Vianey-Saban (Service de
biochimie, Lyon) pour la réalisation des dosages par spectrométrie
de masse, et le docteur Simard (Service de biochimie, Angers) pour
sa collaboration biologique.
Références
1 Hoppel C. The role of carnitine in normal and altered fatty
acid metabolism. Am J Kidney Dis 2003 ; 41(Suppl. 4) :
S4-S12.
2 Ghoshal AK, Soldin SJ. Determination of total and
free plasma carnitine concentrations on the Dade Behring Dimension
RxL : Integrated chemistry system. Clin Chim Acta 2005 ;
361 : 80-5.
3 Cibulka R, Siroka R, Trefil L, Racek J,
Vesela E. Measurement of carnitine in hemodialysis patients -
adaptation of an enzymatic photometric method for an automatic
analyser. Clin Chem Lab Med 2006 ; 44 : 983-6.
4 Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C, et al.
Protocole de validations de techniques. Ann Biol Clin (Paris)
1986 ; 44 : 686-745.
5 Lennon DL, Shrago ER, Madden M, Nagle FJ,
Handson P. Dietary carnitine intake related to skeletal muscle
and plasma carnitine concentrations in adult men and women. Am J
Clin Nutr 1986 ; 43 : 234-8.
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