ARTICLE
Auteur(s) : F Lamari1, R La
Schiazza1, R Guillevin2, B
Hainque1,3, M-J Foglietti3, J-L
Beaudeux1,3, M Bernard1,3
1Service de biochimie métabolique, Hôpital Pitié
Salpêtrière, Assistance Publique Hôpitaux de Paris
2Service de neuroradiologie, GH Pitié-Salpêtrière, et
Laboratoire d’imagerie fonctionnelle, Inserm U678, Université
Pierre et Marie Curie, Paris
3Département de biochimie, Faculté des sciences
pharmaceutiques et biologiques, Université Paris Descartes,
Paris
Article reçu le 20 Juillet 2007, accepté le 28 Decembre 2007
Les gliomes sont les tumeurs primitives du cerveau les plus
fréquentes ; on estime leur incidence à 5 à 10 pour 100 000
personnes dans la population générale [1, 2]. Le degré de malignité
des gliomes est variable et ils restent redoutables en raison de
leur transformation maligne fréquente et de leur haut potentiel
infiltrant. Les tumeurs gliales peuvent être de haut ou de bas
grade, sachant que la moitié des gliomes de bas grade connaissent
une transformation maligne dans les 5 ans [3]. Les gliomes de
bas grade affectent préférentiellement les jeunes adultes. La
progression de ces tumeurs est plus lente que celle des tumeurs de
haut grade, le processus de transformation maligne reste difficile
à prédire ce qui rend impossible l’établissement d’un pronostic
individuel. Le métabolisme énergétique des gliomes, comme celui des
autres tumeurs, est basé de façon préférentielle sur la glycolyse
plutôt que sur la phosphorylation oxydative, même en présence d’un
apport suffisant en oxygène, dit effet Warburg [4]. Depuis le
développement des techniques d’imagerie fonctionnelle telles que la
tomographie par émission de positrons (PET) facilitant l’étude des
tumeurs du cerveau in vivo, un intérêt particulier est porté au
métabolisme énergétique des gliomes [5, 6]. Des études récentes
montrent que la modification de ce métabolisme pourrait constituer
une approche thérapeutique peu agressive pour ces tumeurs [7, 8].
Par ailleurs, des études réalisées par PET ont montré des
différences significatives de la consommation du glucose entre les
gliomes de haut et de bas grade. Au sein de chaque grade des
différences ont été également observées, en relation avec
l’agressivité de la tumeur et pourraient ainsi constituer un
marqueur pronostique pour les patients atteints de gliomes [9].
De nombreux procédés thérapeutiques anti-tumoraux sont basés sur
des agents producteurs d’espèces activées de l’oxygène (EAO) au
sein de la tumeur [10]. Les tumeurs gliales sont des tumeurs
particulièrement résistantes à la chimio et à la radiothérapie
[11] ; cette résistance serait liée à une expression
anormalement élevée de certaines enzymes antioxydantes telles que
la catalase, les superoxyde dismutases et les glutathion
peroxydases, empêchant l’accumulation et la toxicité des EAO au
sein de la tumeur [12, 13].
L’objectif de ce travail a été double : 1) définir les
caractéristiques du métabolisme énergétique et du stress oxydant
cytosolique et mitochondrial de tissus d’exérèse de gliomes de bas
grade ; 2) comparer ces caractéristiques métaboliques entre le
centre de la tumeur gliale et sa partie périphérique, réputée plus
agressive. Ce travail contribuerait à l’identification d’éventuels
marqueurs métaboliques de pronostic pour les patients atteints de
GBG, et pourrait permettre d’envisager des cibles pharmacologiques
potentielles de ces métabolismes pour limiter la diffusion
tissulaire tumorale.
Matériel et méthodes
Patients et échantillons
Entre 2003 et 2004, 64 biopsies de gliomes ont été collectées chez
42 patients hospitalisés pour l’exérèse d’un gliome classé de bas
grade sur des données cliniques et radiologiques. La cohorte de
patients comprend 18 femmes âgées de 26 à 54 ans, et 24 hommes
âgés de 28 à 67 ans. Pour 22 patients, deux biopsies ont pu
être réalisées : une en zone périphérique (péritumorale) et
l’autre en zone centrale de la tumeur (centrotumorale). Après
exérèse chirurgicale au bloc opératoire les tissus biopsiques ont
été immédiatement plongés dans l’azote liquide puis conservés à
– 80 °C. Les résultats obtenus pour les échantillons de
la périphérie des tumeurs (n = 22) ont été comparés à des
échantillons centraux des mêmes tumeurs auxquels ont été ajoutés,
pour augmenter la significativité statistique les échantillons
centraux de tumeurs de 20 autres patients.
Méthodes
Homogénéisation des tissus et fractionnement subcellulaire
Les pièces biopsiques ont été décongelées à + 4 °C,
débarrassées des vaisseaux sanguins et rincées avec du NaCl
0,9 % froid. Deux types d’extractions ont été réalisés pour
chaque biopsie : une extraction neutre pour la détermination
des activités enzymatiques et le dosage des substrats [14], et une
extraction acide pour le dosage des métabolites de la glycolyse
(lactate, pyruvate) et de l’adénosine triphosphate (ATP) [15].
Toutes les étapes d’extraction ont été réalisées à + 4 °C.
L’extraction neutre à été réalisée en présence d’un
tampon HEPES 20 mM, pH 7,4 contenant 0,25 M de saccharose, 1
mM d’EDTA, 10 mM de KCl et 1,5 mM de MgCl2.
L’homogénéisation a été réalisée à l’aide d’un potter téflon/verre.
Une centrifugation à 750 g pendant 10 min à + 4 °C a
permis d’éliminer les membranes et les noyaux. Une seconde
centrifugation à 10 000 g pendant 20 min à + 4 °C a
permis d’obtenir un culot enrichi en mitochondries et un surnageant
contenant le cytosol, les peroxysomes et les lysosomes. Les
différentes fractions ont été conservées au congélateur à
– 80 °C jusqu’au dosage.
L’extraction acide a été réalisée en présence d’acide
perchlorique 0,7M, avec broyage dans un potter téflon/verrre. Après
centrifugation à 750 g pendant 10 min à + 4 °C, le
surnageant a été fractionné et conservé à – 80 °C jusqu’à
l’analyse. Le culot a été dissous à nouveau dans une solution de
soude 1M pour le dosage des protéines.
La concentration en protéines de chaque fraction a été
déterminée par la méthode à l’acide bicinconinique en utilisant le
coffret BCA (Pierce). Les activités enzymatiques et les
concentrations des différents métabolites ont été exprimées par mg
de protéines de la fraction étudiée.
Détermination des activités enzymatiques et dosage des
substrats
Les activités cytosoliques des enzymes du métabolisme énergétique,
hexokinase (HK), lactate déshydrogénase (LDH) et pyruvate kinase
(PK) ainsi que les concentrations du glucose, lactate et pyruvate
ont été mesurées par spectrophotométrie en mode cinétique (pour les
enzymes) et point final (pour les substrats) sur analyseur
multiparamétrique Hitachi-Modular® (Roche Diagnostics).
Les activités des enzymes antioxydantes superoxyde dismutase (SOD)
et glutathion peroxydase (GPX) ont été mesurées en utilisant les
trousses Randox® adaptées sur automate multiparamétrique
Koné® (Thermo-Electron). L’activité de la catalase a été
mesurée par la méthode décrite par Johansson et Borg [16]. Les
concentrations du malonedialdéhyde (MDA), produit de dégradation
des lipoperoxydes ont été mesurées par spectrofluorimétrie en
utilisant la méthode décrite par Ohkawa et al. [17]. L’activité
cytochrome c oxydase (Cyt c Ox) a été mesurée par
spectrofluorimétrie en suivant la cinétique d’oxydation du
cytochrome c à 512 nm [18].
Analyse statistique
Les résultats ont été exprimés en médianes et quartiles ; la
comparaison des moyennes entre biopsies centrales et périphériques
a été réalisée en utilisant le test U de Mann et Whitney. Les
corrélations entre les différents paramètres ont été évaluées en
utilisant le test de corrélation de Spearman. L’analyse statistique
est effectuée par le logiciel StatView version 5.0.
Résultats
Etude du métabolisme énergétique
Les résultats des différents paramètres mesurés sont présentés dans
le tableau 1. Une grande variabilité des
activités enzymatiques et des concentrations des métabolites a été
observée d’une biopsie à une autre, témoignant de l’existence de
biopsies à forte activité métabolique, alors que d’autres sont à
faible activité métabolique. Pour l’ensemble des biopsies une
corrélation positive entre les activités enzymatiques de la LDH et
de PK (r = 0,78 ; p < 0,001) est observée (figure 1A). Cette
corrélation est encore plus significative dans les biopsies
réalisées en périphérie tumorale (r = 0,93 ; p < 0,0001)
(figure 1B). Une
corrélation positive est également observée entre les activités de
l’HK et de la PK (r = 0,61 ; p < 0,001), mais uniquement
dans les biopsies centrotumorales (figure 1C).
La concentration en glucose est inversement corrélée à
l’activité de l’hexokinase mesurée dans la fraction mitochondriale
(r = 0,561 ; p < 0,001), mais pas à celle mesurée dans la
fraction cytosolique. Ce résultat suggère que l’hexokinase liée à
la mitochondrie jouerait un rôle plus déterminant dans la
consommation du glucose par les cellules tumorales.
Parmi les 64 biopsies étudiées, 60 ont présenté un rapport
lactate/pyruvate > 1, aussi bien en zone périphérique (médiane =
6,7) qu’en zone centrale (médiane = 14,9) (p < 0,05), indiquant
que le métabolisme énergétique est principalement glycolytique, et
plus accentué au centre de la tumeur par rapport à la
périphérie.
La comparaison des résultats des paramètres du métabolisme
glucidique entre les zones péri et centro-tumorales montre que le
glucose et le lactate sont significativement plus augmentés dans le
centre de la tumeur, p < 0,01 et p < 0,05 respectivement,
alors que l’activité de la cytochrome c oxydase mitochondriale est
plus augmentée en zone périphérique des tumeurs (p < 0,005). En
revanche, aucune différence significative n’est observée pour les
activités des enzymes glycolytiques, le pyruvate et l’ATP.
Une corrélation positive entre la concentration de l’ATP et
celle du pyruvate (r = 0,847 ; p < 0,001) (figure 1D), est observée,
aussi bien en zone périphérique (r = 0,852 ; p < 0,05)
qu’en zone centrale (r = 0,845 ; p < 0,05) des tumeurs. Par
ailleurs une corrélation négative est observée sur l’ensemble de
tumeurs entre la concentration en ATP et l’activité de la PK (r =
0,72 ; p < 0,005).
Tableau 1 Activités enzymatiques et concentrations des
métabolites du métabolisme énergétique dans les homogénats de
biopsies de gliomes de bas grade. Les résultas sont exprimés en
médianes et (interquartiles). La comparaison des paramètres entre
les échantillons périphériques et centraux des tumeurs a été
effectuée en utilisant le test U de Mann–Whitney. Une différence
est considérée comme statistiquement significative pour une valeur
de p < 0,05.
|
Paramètre
|
Toutes biopsies n = 64
|
Biopsies centrales n = 42
|
Biopsies périphériques n = 22
|
p
|
|
HK (mU/mg)
|
26,3 (18,8-43,3)
|
25,5 (18,3-35,6)
|
27,8 (20,7-48,7)
|
NS
|
|
56,4 (34,9-75,6)
|
57,4 (34,3-78,0)
|
51,6 (35,5-68,2)
|
NS
|
|
LDH (U/mg)
|
3,4 (2,6-4,1)
|
3,2 (2,5-3,9)
|
3,6 (3,2-4,2)
|
NS
|
|
Glucose (μmol/mg)
|
0,177 (0,135-0,230)
|
0,194 (0,152-0,254)
|
0,138 (0,114-0,199)
|
< 0,01
|
|
Lactate (mmol/mg)
|
6,4 (2,9-11,5)
|
7,4 (3,2-12,9)
|
4,4 (2,6-6,7)
|
< 0,05
|
|
Pyruvate (mmol/mg)
|
0,567 (0,321-0,967)
|
0,534 (0,130-0,992)
|
0,608 (0,486-0,943)
|
NS
|
|
Lactate/pyruvate
|
10,1 (4,2-46,5)
|
14,9 (4,6-132,0)
|
6,7 (3,4-10,1)
|
< 0,05
|
|
Cyt c Ox (mU/mg)
|
101,6 (68,2-127,2)
|
87,7 (67,0-110,4)
|
122,6 (110,5-149,1)
|
< 0,005
|
|
ATP (pmol/mg)
|
33,7 (15,3-114,5)
|
35,3 (20,1-110,8)
|
29,6 (13,1-103,8)
|
NS
|
Etude du stress oxydant
Les résultats du tableau 2 montrent une
dispersion des valeurs d’une biopsie à l’autre. Sur l’ensemble des
biopsies, une corrélation positive est observée entre les activités
GPX et SOD (r = 0,60 ; p < 0,001) (figure 2A) ; cette
relation est encore plus significative dans les biopsies
périphériques (r = 0,806 ; p < 0,001) (figure 2B).
La comparaison des résultats entre les biopsies centrales et
périphériques montre que l’activité catalasique est
significativement plus importante en périphérie tumorale par
rapport au centre (p < 0,001). La concentration en MDA est
légèrement plus élevée en périphérie tumorale, à la limite de la
significativité statistique (p = 0,057).
Tableau 2 Activités des enzymes antioxydantes et de la
concentration du malondialdéhyde (MDA) dans les homogénats de
biopsies de gliomes de bas grade. Les résultas sont exprimés en
médianes et (interquartiles). Une comparaison des paramètres entre
les échantillons périphériques et centraux des tumeurs à été
effectuée en utilisant le test U de Mann–Whitney. La différence est
considérée comme statistiquement significative pour une valeur de p
< 0,05.
|
Paramètre
|
Toutes biopsies n = 64
|
Biopsies centrales n = 42
|
Biopsies périphériques n = 22
|
p
|
|
SOD (U/mg)
|
5,8 (4,7-7,8)
|
6,2 (5,1-8,2)
|
5,4 (4,3-6,6)
|
NS
|
|
GPX (mU/mg)
|
117 (95-139)
|
115 (77-140)
|
121 (100-139)
|
NS
|
|
Catalase (mU/mg)
|
477 (196-876)
|
302 (146-711)
|
827 (545-1186)
|
< 0,001
|
|
MDA (pmol/mg)
|
260 (177-385)
|
230 (156-383)
|
303 (246-414)
|
0,057
|
Relation entre métabolisme énergétique et stress oxydant
Les résultats comparatifs du métabolisme énergétique et du stress
oxydant indiquent une corrélation positive entre l’activité des
enzymes antioxydantes SOD et GPX et l’activité de la LDH,
respectivement (r = 0,604 ; p < 0,05) et (r = 0,637 ;
p < 0,001) (figure 3A
et B). Une corrélation positive est également observée pour
l’ensemble des biopsies entre les activités cytosoliques de la SOD
et de la PK (r = 0,727 ; p < 0,001) (figure 3C). Enfin, les
concentrations de MDA sont positivement corrélées à celles de l’ATP
dans les biopsies périphériques (figure 3D).
Discussion
Cette étude fournit une description biochimique du métabolisme
énergétique et du stress oxydant dans un ensemble de 64 tumeurs
gliales présentant les caractéristiques cliniques et radiologiques
de gliomes de bas grade. L’analyse de 22 tumeurs pour lesquelles
nous disposons à la fois d’un prélèvement périphérique et d’un
prélèvement central permet de révéler certaines différences
métaboliques entre le centre et la périphérie des gliomes. On note
une grande dispersion des valeurs des différents paramètres, aussi
bien au sein de la même tumeur que d’une tumeur à une autre. Cette
variabilité des résultats est probablement liée à la grande
hétérogénéité cellulaire et métabolique qui caractérise les tumeurs
gliales [19]. Cependant, l’analyse détaillée des résultats des
différents paramètres du métabolisme et des corrélations qui
existent entre eux permet de dégager certaines caractéristiques
importantes.
Pour l’ensemble des tumeurs, une corrélation positive et
significative est observée entre les principales enzymes de la
glycolyse : HK, PK et LDH. De plus, certaines tumeurs ont une
activité métabolique augmentée alors que d’autres présentent un
métabolisme plus faible. Ces résultats confirment ce qui a été
rapporté dans des études réalisées par PET, qui ont montré qu’en
fonction de la captation du 18-fluoro-déoxyglucose (18-FDG) les
tumeurs peuvent être classées en hypermétaboliques ou en
hypométaboliques [20]. Les gliomes hypermétaboliques, qu’ils soient
de haut ou de bas grade, sont souvent associés à une médiane de
survie plus courte [20]. Le rapport lactate/pyruvate très supérieur
à 1 dans l’ensemble des tumeurs montre que le métabolisme
énergétique est principalement glycolytique, ce qui est tout à fait
en accord avec l’effet Warburg décrit dans les tumeurs en général
et plus particulièrement dans les gliomes [21-23]. Nos résultats
montrent que la glycolyse dans les gliomes de bas grade aboutit
préférentiellement à la formation de lactate comme cela avait été
décrit pour les gliomes de haut grade [24]. L’effet Warburg semble
plus accentué au centre de la tumeur comme le suggère la
concentration en lactate et des rapports lactate/pyruvate plus
élevés. Ceci pourrait être lié à une meilleure oxygénation des
tissus de la zone péri-tumorale. Les cellules tumorales seraient en
effet susceptibles d’adapter leur activité métabolique en fonction
de l’apport en oxygène, ce qui leur permettrait de conserver leur
autonomie métabolique. Il a été rapporté par Oudard et al. [23] que
le rapport lactate/pyruvate est plus élevé dans les tissus de
gliomes de haut grade par rapport à ce qui a été retrouvé dans un
tissu cérébral sain. Les résultats que nous avons obtenus sur les
gliomes de bas grade sont proches de ceux obtenus par Oudard dans
les tumeurs de haut grade, suggérant que le métabolisme énergétique
des gliomes de bas grade est plus proche de celui des hauts grades
que du tissu normal. La concentration en glucose est plus élevée au
centre des tumeurs qu’à la périphérie, suggérant une consommation
de glucose plus importante à la périphérie des tumeurs. Les études
du métabolisme réalisées par des techniques d’imagerie par TEP ont
montré que la captation du 18-FDG est plus importante dans le tissu
tumoral par rapport au tissu sain adjacent [25], et que les tissus
tumoraux les plus invasifs sont également ceux dont la consommation
en glucose est plus élevée [26]. Associés à ces données de la
littérature, nos résultats suggèrent donc que le tissu tumoral
périphérique porte le potentiel invasif des gliomes de bas grade.
En parallèle, l’activité mitochondriale au centre de la tumeur
apparaît plus basse par rapport à la périphérie, comme le suggère
l’activité cytochrome c oxydase plus faible. Nos résultats sont en
accord avec ceux d’autres travaux [27, 28] ayant montré que le
nombre et les fonctions des mitochondries sont diminués dans les
gliomes par rapport au tissu normal. L’activité plus basse de la
cytochrome c oxydase peut expliquer la faible consommation du
glucose et l’accumulation de lactate dans le tissu central. La
corrélation positive entre les concentrations du pyruvate et celles
de l’ATP observée sur l’ensemble des biopsies montre que, dans les
gliomes de bas grade, l’essentiel de la charge énergétique reflétée
par l’ATP proviendrait du pyruvate.
Les gliomes sont des tumeurs particulièrement résistantes à la
chimiothérapie et à la radiothérapie. De nombreux travaux suggèrent
l’existence d’une relation entre la résistance des gliomes aux
thérapeutiques anticancéreuses et l’expression des enzymes
antioxydantes [12, 13]. Ainsi, il a été rapporté que les activités
des enzymes SOD, GPX et glutathion réductase étaient 5 fois plus
élevées dans une lignée cellulaire de gliome radiorésistante par
rapport à une lignée non résistante [11]. La mesure de l’activité
des principales enzymes antioxydantes dans les biopsies a montré
une corrélation positive entre les activités de la SOD et la GPX
dans l’ensemble des biopsies ; cette corrélation est
particulièrement significative dans les prélèvements périphériques.
La comparaison des activités enzymatiques antioxydantes entre les
biopsies centrales et périphériques a montré une activité catalase
plus augmentée en périphérie des tumeurs par rapport au centre. La
catalase a été rapportée comme étant une enzyme qui confère la
résistance des cellules de gliomes aux molécules anticancéreuses,
l’inhibition de la catalase dans ces cellules les rend donc plus
sensibles [29]. Une augmentation significative de l’activité
catalasique à la périphérie des gliomes peut donc laisser supposer
une plus grande résistance de la tumeur aux procédés
thérapeutiques, souvent basés sur une génération d’espèces activées
de l’oxygène au sein de la tumeur comme le
1,3-bis(2-chlorethyl)-1-nitrosouree (BCNU) et la buthionine
sulfoximine (BSO) [30]. La concentration du MDA, produit de
dégradation des lipides oxydés est légèrement diminuée au centre
des tumeurs, probablement en raison d’une glycolyse anaérobie plus
importante. Une corrélation positive entre les concentrations du
MDA et de l’ATP est observée dans les biopsies périphériques
indiquant l’existence d’une relation entre le métabolisme oxydatif
générateur d’EAO et la peroxydation lipidique. Cette corrélation
n’est pas observée dans les biopsies centrales, probablement à
cause d’un effet Warburg plus accentué. Cirak et al. [31] ont
rapporté que la concentration tissulaire du MDA était plus
augmentée dans les gliomes que dans le tissu cérébral non tumoral,
et qu’au sein de la cohorte des gliomes le MDA était 1,5 fois plus
élevé dans les hauts grades par rapport aux bas grades. Selon ces
auteurs, le MDA malgré sa mauvaise spécificité pourrait constituer
un marqueur supplémentaire permettant de différencier les tumeurs
gliales de haut et de bas grade [31].
Conclusion
Cette étude montre que les GBG ont un métabolisme énergétique
principalement basé sur la glycolyse comme ce qui a été rapporté
dans les gliomes de haut grade. Le tissu péritumoral semble plus
actif métaboliquement que le tissu centrotumoral avec une
consommation de glucose et une activité mitochondriale plus
importantes. La protection enzymatique antiradicalaire est apparue
non significativement différente entre le centre et la périphérie
tumorale, à l’exception de la catalase, plus augmentée en
périphérie en accord avec une peroxydation lipidique plus élevée,
suggérant un stress oxydant accru dans cette partie de la tumeur.
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