ARTICLE
Auteur(s) : A
Dandana1, S Ferchichi1, S
Khedhiri1, L Chkioua1, Z Jaidane1,
K Monastiri1, S Ben Khelifa1, R Ben
Mansour1, I Maire2, R Froissart2,
V Bonnet2, S Laradi1, A Miled1
1Laboratoire de biochimie, CHU Farhat Hached, Sousse,
Tunisie
2Centre de référence des maladies héréditaires du
métabolisme de Lyon, Hospices civils, Hôpital Debrousse, Lyon,
France
Article reçu le 26 Juin 2007, accepté le 27 Août 2007
La maladie de Gaucher est une sphingolipidose de surcharge
lysosomale. C’est une maladie génétique à transmission autosomique
récessive. Elle présente une très grande hétérogénéité
phénotypique. Elle est subdivisée en trois types (Type 1 : MIM
230800 ; Type 2 : MIM 230900 ; Type 3 : MIM
231000) selon l’absence ou la présence de manifestations
neurologiques [1]. Le type 1 est la forme non neurologique. Il est
le plus fréquent avec une incidence de 1/40 000 dans la population
générale et 1/500 chez les juifs ashkénazes [2]. Le type 2 est la
forme neurologique aiguë. Il est le plus sévère et le plus rare
avec une fréquence de 1/100 000 dans la population générale. Il est
caractérisé par une détérioration neurologique progressive. Le type
3 est la forme neurologique subaiguë et chronique. Il est subdivisé
en trois sous-types (3-a, 3-b et 3-c) [1].À cette variabilité
phénotypique de la maladie de Gaucher, s’ajoute une très grande
hétérogénéité génétique. En effet, la maladie de Gaucher est due à
un déficit en une enzyme lysosomale, la β-glucocérébrosidase (GCB)
(E.C 3.2.1.45) [3] ou plus rarement son cofacteur la saposine C
[4]. La GCB est codée par un gène localisé à la position 1q21. Il
compte 11 exons et 10 introns répartis sur 7,6 kb. Un pseudogène de
5,7 kb est situé à 16 kb en aval du gène de la GCB et présente
97 % d’homologies avec ce gène [1]. Avant la découverte de
l’enzymothérapie substitutive, certaines mesures thérapeutiques
d’ordre médical ou chirurgical sont proposées pour atténuer la
sévérité de la maladie de Gaucher. Le traitement enzymatique
substitutif est désormais au centre de la prise en charge
thérapeutique de la maladie de Gaucher.D’autres études sont menées
pour la recherche d’une thérapie génique de cette maladie. Elle
demeure l’un des modèles les plus intéressants de transfert de
gènes dans les cellules hématopoïétiques, mais les formes
neurologiques restent inaccessibles à l’enzymothérapie. D’où la
poursuite des travaux de la thérapie génique qui est en cours de
recherche [5].Actuellement, plus de 200 mutations sont décrites
[6]. On trouve des mutations ponctuelles, des délétions, des
insertions, des mutations d’épissage et de nombreux réarrangements
[7]. Chez les Juifs ashkénazes, 4 mutations sont responsables de
90 % des cas identifiés : p.Asn 370 Ser
(AAC→AGC), p.Leu 444 Pro (CTG→CCG),
c.84insG, et la IVS2+1 G→A. Dans la population non
juive, cette maladie a une faible prévalence et les mutations
communément identifiées sont p.Asn 370 Ser, p.Asp 409 His
(GAC→CAC), p.Arg 463 Cys (CGC→TGC),
p.Leu 444 Pro et la IVS2+1 [1].L’objectif de ce travail est de
mettre en œuvre une stratégie diagnostique de la maladie de Gaucher
en Tunisie. Elle comprend une étude biochimique suivie par une
étude moléculaire de la maladie de Gaucher chez 3 individus
apparentés (père et ses deux enfants).
Patients
Dans cette étude, nous avons recruté trois individus
apparentés : le père (P1) qui représente le cas
index et est âgé de 50 ans, son fils (P2) et sa fille
(P3) d’âge respectivement 18 et 26 ans. La mère a refusé
d’adhérer à notre étude. Ces deux enfants étaient cliniquement
sains. Le père a présenté une hépatosplénomégalie associée à une
anémie (hémoglobine 90 g/L) et une thrombopénie (80 G/L).
Méthodes
Diagnostic biochimique
L’activité enzymatique de la GCB a été déterminée dans les
lymphocytes par la méthode fluorimétrique en utilisant un substrat
synthétique, le 4-méthylumbelliféryl-ß-glucoside (Sigma Aldrich).
L’acide taurocholique a été utilisé comme activateur et à pH 5,5
pour optimiser les conditions expérimentales. Parallèlement, une
activité témoin, la N-acétyl-β-D-glucosaminidase, a été pratiquée
en utilisant un substrat fluorogénique, le 4-méthyl
umbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucopyranoside (Sigma Aldrich) pour
valider la qualité du prélèvement [8]. Le dosage des protéines est
réalisé par la méthode de Lowry modifiée par Hartree [9].
Diagnostic moléculaire
L’analyse moléculaire a porté sur la recherche des deux mutations
les plus fréquentes qui sont la p.Asn 370 Ser et la p.Leu 444
Pro. Les ADN ont été extraits au phénol chloroforme à partir des
cellules sanguines du père (cas index) et de ses deux enfants, puis
précipités par l’alcool saturé et solubilisés dans de l’eau
bidistillée stérile.
Amplification
La réaction d’amplification par PCR (polymerase chain reaction) des
exons 9 [10] et 10 [11] a été réalisée en utilisant la Go Taq
polymérase [Promega, Madison, WI]. Le tableau
1 regroupe les amorces et les conditions de PCR qui ont été
appliquées. L’amplification de l’exon 9 a été faite par PCR
mismatchée [10]. Le mismatch ou mésappariement est le non
appariement entre un ou plusieurs couples de bases non
complémentaires au sein d’une double hélice. Il a été introduit
dans l’amorce sens (p.Asn 370 Ser) afin de créer un site de
restriction pour l’enzyme de restriction correspondante.
L’amplification de la p.Leu 444 Pro a été réalisée par une PCR. Les
réactions de PCR commencent par une dénaturation de 10 minutes à
94 °C (1 cycle) suivie de 30 cycles comprenant une étape de
dénaturation pendant 30 secondes à 94 °C, une étape
d’hybridation dont les températures correspondantes ont varié selon
le couple d’amorces choisi (tableau 1), puis une étape d’extension
pendant 45 secondes à 72 °C. Enfin, l’élongation finale de 2
minutes à 72 °C est réalisée en un cycle.
Tableau 1 Couples d’amorces et enzymes de restriction
utilisés.
|
Exon
|
Mutation
|
Amorces
|
Séquences
|
Position des nucléotides
|
Taille en pb
|
Tm en °C
|
Enzymes de restriction
|
Taille des fragments en pb
|
|
N
|
M
|
|
9
|
p.Asn 370 Ser
|
|
- 5’GCCTTTGTCCTTACCCTC*GA3’
- 5’GACAAAGTTACGCACCCA3
|
|
105
|
57 °C
|
XhoI (+)
|
105
|
89 + 16
|
|
10
|
p.Leu 444 Pro
|
|
- 5’GGAGGACCCAATTGGGTGCGT3’
- 5’GCTGTCTTCAGCCCACTTC3’
|
|
638
|
60 °C
|
MspI (+)
|
638
|
536 + 102
|
Digestion enzymatique
Les produits PCR ont été digérés par les enzymes de restriction
suivantes : XhoI (p.Asn 370 Ser) et MspI (p.Leu 444 Pro)
(Promega, Madison, WI). Les fragments d’ADN obtenus après digestion
ont été analysés par électrophorèse sur gel d’acrylamide, puis
visualisés sous UV après addition du bromure d’éthidium. Les
enzymes de restriction et les fragments de PCR obtenus avant et
après digestion figurent dans le tableau 1.
Amplification de la mutation c.1263 del 55
Dans la littérature, il a été suggéré qu’une délétion de 55 pb au
niveau du nucléotide 1263 (exon 9) peut accompagner les deux
mutations p.Asn 370 Ser et p.Leu 444 Pro [11]. Cette délétion est
présente dans le gène et le pseudogène. De ce fait, nous avons
utilisé deux amorces : une amorce sens, spécifique du gène et
une amorce antisens qui est commune au gène et au pseudogène
[11](tableau 2). En absence de la
délétion, la taille du fragment amplifié est de 504 pb. Si la
délétion était présente, la taille est égale à 449 pb. La réaction
de PCR commence par une dénaturation de 10 minutes à
94 °C (1 cycle) suivie de 30 cycles comprenant une étape de
dénaturation pendant 30 secondes à 94 °C, une étape
d’hybridation pendant 30 secondes à 56 °C et une étape
d’extension pendant 45 secondes à 72 °C. L’étape d’élongation
finale a été réalisée en un seul cycle de 2 minutes à 72 °C.
La PCR a été contrôlée sur gel d’agarose 2 % en présence du
bleu de bromophénol après addition de bromure d’éthidium.
Tableau 2 Séquences des amorces de la mutation c.1263
del 55 et du séquençage.
|
Exon
|
Amorces
|
Séquences
|
Position des nucléotides
|
Tm
|
Taille en pb
|
|
La mutation 1263 del 55
|
9
|
- GCB 9 Ia (+)•
- GCB 9 Ia (-)•
|
- 5’AACCATGAT TCCCTATCTTC3’
- 5’GCTCCCTCGTGGTGTAGAGT3’
|
|
56 °C
|
N
|
M
|
|
504
|
449
|
|
Le séquençage
|
9-10
|
- GCB 9-10 (+)
- GCB 9-10 (-)
|
- 5’CAGCTTTCCCCAGCTAG3‘
- 5’CTGAGAGTGTGATCCTGCCAA3
|
|
55 °C
|
1 036
|
Séquençage
Le produit de PCR obtenu en présence du couple d’amorces GCB 9-10
(+) et GCB 9-10 (-) (tableau 2) est purifié par un Kit Quiaquik
gel-extraction (Qiagen Inc, Valencia, CA, États-Unis). Le
séquençage a été assuré grâce à un séquenceur automatique (ABI
Prism 3700 Capillary Array Sequencer, PE Biosystems) en utilisant
un kit de séquençage (Perkin-Elmer-Cetus Norwalk, CT, États-Unis).
Résultats
Diagnostic biochimique
Le tableau 3 regroupe les résultats des
activités enzymatiques : le père P1 était
déficitaire, les deux enfants (P2 et P3) ont
présenté des activités légèrement diminuées. Ce diagnostic
biochimique est complété par le diagnostic moléculaire afin de
définir la mutation responsable de ce déficit enzymatique.
Tableau 3 Résultats de l’activité enzymatique.
|
|
- β-glucocérébrosidase-H2O
- (µkat/kg)
|
- β-glucocérésidase-acide taurocholique
- (µkat/kg)
|
- Hexosaminidases totales
- (µkat/kg)
|
|
P1
|
3
|
1,05
|
0,1
|
349
|
|
P2
|
3,2
|
2,10
|
3,3
|
355
|
|
P3
|
3,5
|
2,48
|
4,1
|
286
|
|
T
|
4
|
3,10
|
5,2
|
296
|
Diagnostic moléculaire
Digestion enzymatique
Aucun allèle muté p.Leu 444 Pro n’a été détecté dans les fragments
d’ADN amplifiés traités. Ce résultat est objectivé par la présence
d’un seul fragment de 638 pb (figure 1). Concernant la
mutation p.Asn 370 Ser, les résultats obtenus par PCR mismatchée
associée à la digestion enzymatique en utilisant l’enzyme XhoI ont
montré la présence de l’allèle muté p.Asn 370 Ser. En effet, le cas
index (P1) était homozygote pour cette mutation (deux
fragments de 89 et de 16 pb) ; P2 et P3
étaient hétérozygotes (trois fragments de 105, 89 et 16 pb) (figure 2).
Amplification de la mutation c.1263 del 55
La mutation c.1263 del 55 était absente chez les trois individus.
Ceci est objectivé par la présence d’un fragment de 504 pb (figure 3).
Le séquençage
Le séquençage confirme le résultat obtenu par la digestion
enzymatique. Le profil de séquençage (figure 4A) a confirmé
l’état d’homozygotie chez le père (p.Asn 370 Ser/p.Asn 370 Ser), ce
qui se traduit par la présence d’un seul pic. Par contre, l’état
d’hétérozygotie chez les deux enfants (P2 et
P3) (figure
4B) s’est traduit sur le profil de séquençage par la
superposition de deux pics qui correspondent à un allèle normal et
un allèle muté (p.Asn 370 Ser/normal).
Discussion
La maladie de Gaucher est une sphingolipidose décrite par Philippe
Gaucher en 1882. Elle est héréditaire, à transmission autosomique
récessive. Elle résulte d’un déficit en β-glucocérébrosidase ou
plus rarement de son cofacteur la saposine C (SAP-C pour
sphingolipid activator protein-C) [4]. Le déficit ou l’inactivation
du gène de la saposine C engendre l’apparition d’une forme clinique
qui ressemble au type 3 de la maladie de Gaucher et qui est
caractérisée par des atteintes viscérales et des manifestations
neurologiques bien que l’enzyme soit normalement synthétisée [4].
Devant l’hétérogénéité symptomatique de la maladie de Gaucher et
les difficultés pronostiques, le diagnostic associe l’étude
clinique à des moyens analytiques qui permettent un diagnostic de
certitude [5].
Le diagnostic biologique comprend un diagnostic d’orientation
qui repose sur la réalisation d’une ponction médullaire qui permet
la détection des cellules de Gaucher. Mais des pseudocellules de
Gaucher ont été rencontrées dans d’autres affections génétiques (la
maladie de Niemann-Pick, la leucémie myéloïde chronique, la maladie
de Hodgkin et le myélome multiple). Elles ont la même morphologie
que la cellule de Gaucher [5] et de plus la ponction médullaire
reste un examen invasif. Plusieurs marqueurs sériques (l’enzyme de
conversion de l’angiotensine A (ECA), la ferritinémie, la
phosphatase acide tartrate résistante (PATR), la chitotriosidase,
les chémokines, la LDL (low-density lipoprotein), la HDL
(high-density lipoprotein), les transaminases, la 5’-nucléotidase…)
peuvent être mesurés afin d’apporter d’autres éléments
diagnostiques.
La mesure de l’activité enzymatique est le diagnostic de
certitude de la maladie de Gaucher et repose sur la mise en
évidence du déficit en GCB. La β-glucocérébrosidase est ubiquitaire
et la mesure de l’activité enzymatique est réalisée sur un
prélèvement sanguin après isolement des lymphocytes mais également
sur des fibroblastes. Plusieurs auteurs utilisent également un
substrat radioactif pour déterminer l’activité résiduelle de la
GCB. Selon Beutler et Kull [15], l’activité glucosidasique
lymphocytaire est maximale à pH 4 et à pH 5,5. En effet, le pH
optimal varie en fonction des tampons, des détergents, de la nature
du substrat et de la lyse ou non des membranes cellulaires. Peters
et al. déterminent l’activité résiduelle de la GCB au niveau des
lymphocytes à la seule valeur de pH de 5,5 [16]. Le taurocholate de
sodium présente parfois des problèmes de reproductibilité et il est
remplacé dans d’autres études par l’acide taurocholique pur [15].
La méthode fluorimétrique reste la technique la plus utilisée en
pratique car elle est reproductible, facile à pratiquer et moins
coûteuse malgré sa moindre sensibilité et spécificité par rapport à
la méthode radioactive. L’étude de l’activité enzymatique ne permet
pas de diagnostiquer l’état hétérozygote, ni de distinguer et de
différencier les trois phénotypes de la maladie de Gaucher. Par
conséquent, il n’existe pas de corrélation entre l’activité
résiduelle de la β-glucocérébrosidase et l’ensemble des phénotypes
cliniques de la maladie de Gaucher [5]. Chez les patients atteints
par la maladie de Gaucher, les valeurs habituelles de l’activité
enzymatique varient entre 0 et 30 % de la valeur de référence
[2]. L’activité enzymatique peut diminuer de 50 % dans les
lymphocytes circulants et les cultures de fibroblastes cutanés des
sujets hétérozygotes [17]. Plusieurs laboratoires ont développé des
méthodes de biologie moléculaire pour détecter les mutations qui
affectent le gène de la β-glucocérébrosidase [7]. Ces mutations
résultent de deux mécanismes, soit la présence d’une nouvelle
mutation ponctuelle ou de phénomènes de recombinaison
(crossing-over) entre le gène et le pseudogène [17]. L’analyse de
la structure du pseudogène est importante dans la compréhension de
certaines mutations qu’on rencontre aussi bien dans la séquence du
gène que du pseudogène [18]. En effet, plusieurs modifications
nucléotidiques sont distribuées le long de la séquence du
pseudogène et qui ont été identifiées au niveau de l’allèle muté du
gène [5] ce qui complique le diagnostic. L’identification des
mutations spécifiques du gène dépend alors du choix judicieux des
amorces. En conséquence, certaines séquences sont spécifiques du
gène uniquement et n’amplifient pas le pseudogène. D’autres
stratégies moléculaires sont adoptées pour valider les résultats de
la PCR dans notre étude. Le séquençage utilise des amorces
spécifiques du gène et permettent la vérification de la
mutation.
En Tunisie, on est amené à utiliser les moyens de diagnostic de
base (PCR et digestion enzymatique) afin d’assurer l’analyse
moléculaire de la maladie de Gaucher. Le séquençage s’avère dans
notre laboratoire plus coûteux. Seules trois d’entre elles, la
mutation p.Asn 370 Ser, la p.Leu 444 Pro et la c.84insG qui
représentent respectivement 55, 20 et 8 % des allèles sont
étudiées dans la maladie de Gaucher [1]. Mais la fréquence et la
distribution de ces mutations varient selon les populations
étudiées. En Tunisie, et selon une étude menée par Châabouni et al.
en 2004 [19], la maladie de Gaucher ne paraît pas exceptionnelle.
Sur 27 cas étudiés, 20 cas sont de type 1 (74 %) tandis que le
type 2 et le type 3 sont présents chacun avec 3 cas (11 %) et
un seul cas de type non déterminé.
Dans notre étude, le sujet index P1 est homozygote
pour la p.Asn370 Ser. Ce patient manifeste le type 1 de la maladie
de Gaucher avec une hépatosplénomégalie, et aucune atteinte
neurologique n’a été signalée. En effet, plusieurs études ont
montré que les patients de type 1 de la maladie de Gaucher et ayant
au moins un allèle p.Asn 370 Ser ne présentent aucune manifestation
neurologique [5].
Certains auteurs confirment qu’il y a une corrélation entre la
présence d’au moins un allèle p.Asn 370 Ser et le type 1 de la
maladie de Gaucher [5]. L’allèle p.Asn 370 Ser peut atténuer la
sévérité de la maladie. Par contre, la mutation p.Leu 444 Pro est
généralement associée au type sévère de la maladie [20], avec
l’apparition de manifestations neurologiques. Elle est fréquemment
trouvée chez des patients qui manifestent le type 2 et 3 de la
maladie de Gaucher. Elle est commune au gène et au pseudogène. La
présence d’une délétion de 55 pb au niveau de l’exon 9 pourrait
induire des erreurs dans l’interprétation des résultats des deux
mutations, la p.Asn 370 Ser et la p.Leu 444 Pro, par la formation
des mutations faussement homozygotes [11]. La mutation c.1263 del
55 est due soit au phénomène de recombinaison entre le gène de la
β-glucocérébrosidase et son pseudogène, soit à une conversion du
gène fonctionnel, du fait de la grande homologie entre les deux
gènes. Toutefois, cette mutation est fréquente surtout dans la
population non juive [11]. En outre, la corrélation phénotype -
génotype demeure ainsi imparfaite en raison des variations
phénotypiques inter et intrafamiliales [5]. Plusieurs facteurs sont
responsables de ces variations tels que les gènes modificateurs et
les facteurs environnementaux, ce qui affecterait l’expression
phénotypique de la maladie [7].
Conclusion
Du fait de la grande hétérogénéité phénotypique, le diagnostic de
la maladie de Gaucher doit faire appel à la clinique, la biologie
et l’étude moléculaire. Dans notre laboratoire, la détermination de
l’activité enzymatique permet le diagnostic de certitude. Par
ailleurs, le diagnostic moléculaire est possible par la recherche
des mutations les plus fréquentes. Par contre, le diagnostic
antinatal n’est proposé que dans le cas de la maladie de Gaucher de
type 2 et 3. Le suivi de l’évolution de la maladie de Gaucher avant
et après traitement se fait par la mesure des différents marqueurs
biologiques (chitotriosidase, hémoglobines, plaquettes, enzyme de
conversion…). Actuellement, la maladie de Gaucher bénéficie de
l’enzymothérapie substitutive mais elle reste très coûteuse. Les
avancées de la génétique moléculaire ont aussi permis d’explorer
d’autres options thérapeutiques potentielles telles que les
molécules chaperonnes.
Références
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