ARTICLE
Auteur(s) : C
Rodriguez, C d’Audigier, V Bertrand
Laboratoire d’immunologie cellulaire et tissulaire, Groupe
hospitalier Pitié-Salpêtrière (AP-HP), Paris
Article reçu le 26 Mai 2006, accepté le 29 Juin 2006
La maladie de Bruton est le plus courant des déficits immunitaires
primitifs (DIP) liés au chromosome X [1] et fait partie de la
classe des déficits immunitaires humoraux. La symptomatologie
clinique correspond à des infections bactériennes récidivantes dès
le plus jeune âge. Le diagnostic de la maladie repose aujourd’hui
essentiellement sur la biologie et se caractérise par l’absence ou
la très faible quantité d’immunoglobulines circulantes associée à
un déficit sévère en lymphocytes B. Le diagnostic génétique de la
maladie permet à la fois de confirmer le diagnostic
clinico-biologique, mais aussi et surtout de proposer un dépistage
prénatal aux parents ainsi qu’aux femmes vectrices du gène muté. Ce
gène identifié comme responsable de la maladie est le gène XLA [2]
localisé en Xq21.3-Xq22 [3] qui comprend 19 exons répartis sur 37,5
kilobases. Il code pour une protéine nommée Btk (Bruton’s tyrosine
kinase) qui contient 659 acides aminés. La BTKbase
(http://bioinf.uta.fi/BTKbase/) est une base qui répertorie les
mutations des régions codantes de cette protéine ; à ce jour
il en existe plus de 400 responsables d’une observation clinique de
la maladie [4]. Des mutations symptomatologiques dans les régions
non codantes ont aussi été décrites, notamment dans les sites
d’épissage et une fois dans le site promoteur [5]. La Btk est une
protéine intervenant notamment dans la maturation du lymphocyte
pré-B (localisation médullaire) en lymphocyte B mature circulant.
Une mutation de cette protéine a pour conséquence un blocage de
maturation avec un arrêt de différenciation du lymphocyte pré-B
entraînant l’absence de lymphocyte B circulant et a fortiori une
absence de plasmocyte sécréteur d’immunoglobulines [6].Malgré une
définition clinico-biologique simple, de nombreuses formes de la
maladie peuvent être observées. C’est pourquoi le dépistage
génétique apporte une aide précieuse au clinicien ainsi qu’aux
familles en ouvrant la possibilité de leur apporter un conseil
génétique [7]. Ce dépistage s’effectue par technique de séquençage
car le nombre important de mutations possibles nécessite de
connaître la séquence codante complète et les séquences des sites
d’épissage des 18 introns.
Patients, matériel et méthodes
La mise au point du diagnostic génétique a été effectuée sur un
groupe de jeunes patients dénommé Necker. Il est constitué de
5 enfants atteints de la maladie de Bruton régulièrement suivis à
l’hôpital Necker Enfants Malades, dont le séquençage avait déjà été
réalisé par une équipe italienne (séquençage des exons uniquement).
Ce groupe a été complété par les prélèvements provenant des mères
de deux de ces enfants. L’analyse des résultats a été réalisée en
aveugle puisque seul le clinicien disposait des résultats italiens.
Les prélèvements sanguins nous ont été transmis dans des tubes
de 7 mL contenant de l’EDTA comme agent anticoagulant.
L’extraction de l’ADN a alors été réalisé sur culots leucocytaires
à l’aide d’un kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen®),
puis l’ADN et le reste des culots leucocytaires ont été congelés.
Pour chaque échantillon recueilli, il a été effectué une
amplification des 19 exons ainsi que des parties initiales et
terminales des introns de manière à inclure les sites d’épissage
(tableau 1( Tableau 1 )). Après
vérification de l’amplification sur gel d’agarose à 2 %, une
purification par technique de filtration sur plaque 96 puits
Multiscreen PCR (Millipore®) a été réalisée, puis les
amplicons purifiés ont été également vérifiés sur gel d’agarose à
2 %. La réaction de séquence a ensuite été exécutée à l’aide
d’amorce universelle -21M13 et M13 reverse (tableau 1) et du kit
Big Dye Terminator V1.1 (Applied Biosystems®). Enfin, le
séquençage a été effectué sur l’automate ABI Prism 3100 (Applied
Biosystems®). Les données obtenues par le séquenceur on
été analysées sur le logiciel SeqScape (Applied
Biosystems®). Ce dernier effectue un prétraitement des
données et sélectionne notamment les séquences exploitables selon
des normes de qualité fixées par le laboratoire, puis les aligne
par rapport à la séquence de référence [2]. Une double lecture des
séquences est alors effectuée et le résultat est rendu sous forme
de rapport de mutation (présence/absence, position, type de
mutation…).
Tableau 1 Séquence des amorces utilisées nécessaires à
la réalisation du séquençage du gène XLA. En bleu apparaissent les
séquences des amorces universelles.
|
Exons
|
|
Amorces PCR Sens
|
|
EX1
|
476
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGAGGTCCCAAGCAAATGAAG
|
|
EX2
|
500
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTGTGGGAGGAGGTTGGT
|
|
EX3
|
586
|
TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCATGGTATTTGCCCTCCA
|
|
EX4
|
325
|
TGTAAAACGACGGCCAGTAGAATCAGCCTTGTCTGTGCAGG
|
|
EX5
|
296
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTGACTGAAGATTCTGCCTTT
|
|
EX6
|
551
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGGCCAGTCATGTGAGCC
|
|
EX7
|
595
|
TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGCTATGGGCTGCCAAA
|
|
EX8
|
493
|
TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGGTTGTTGAATGACTGCTGAGT
|
|
EX9
|
239
|
TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTGAGGGAGGTGCATTG
|
|
EX10
|
319
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGAATCACTGACATGGACAAGC
|
|
EX11
|
283
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCAAGCGTGGAACTTGGC
|
|
EX12
|
592
|
TGTAAAACGACGGCCAGTAGTTTGGGCAGGTGGGATGC
|
|
EX13
|
515
|
TGTAAAACGACGGCCAGTTAAGCCTGGGCTGGGAGGTG
|
|
EX14
|
510
|
TGTAAAACGACGGCCAGTTCTTGCCTTATGGCCACCTTGA
|
|
EX15
|
530
|
TGTAAAACGACGGCCAGTTGATGCTCTACTCCTAGGTCAGCCC
|
|
EX16
|
477
|
TGTAAAACGACGGCCAGTCACAGCAGGTTGCTTTCCACG
|
|
EX17
|
562
|
TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGGGAAGGAGAAGAGCAGAGA
|
|
EX18
|
548
|
TGTAAAACGACGGCCAGTCGGGGAACCAACTGATTCTA
|
|
EX19
|
512
|
TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTTACTCATTGCATTTCCC
|
|
|
Amorces PCR Anti-sens
|
|
EX1
|
476
|
CAGGAAACAGCTATGACCCCCTTTCGGCCTCTCTAATC
|
|
EX2
|
500
|
CAGGAAACAGCTATGACCGGACCTTTGACTTTCCGGCTT
|
|
EX3
|
586
|
CAGGAAACAGCTATGACCTCTGATCCTGAGAGAACTGAGGGA
|
|
EX4
|
325
|
CAGGAAACAGCTATGACCTGGTTCAGCATCCTTGTCCACC
|
|
EX5
|
296
|
CAGGAAACAGCTATGACCCTTTCCTTTTCCTCCCGTCT
|
|
EX6
|
551
|
CAGGAAACAGCTATGACCGGTCAGGGACTTTGCCGTCC
|
|
EX7
|
595
|
CAGGAAACAGCTATGACCTTCCATCGAGGAGGAAATCCTAA
|
|
EX8
|
493
|
CAGGAAACAGCTATGACCATAGGGAGCTGCACGCTGGG
|
|
EX9
|
239
|
CAGGAAACAGCTATGACCGAGAGTTCCTCCTGGAAGATTG
|
|
EX10
|
319
|
CAGGAAACAGCTATGACCAACAGGCCCTCAGTTCAAGA
|
|
EX11
|
283
|
CAGGAAACAGCTATGACCGACGGGCACAGCATCAAGGA
|
|
EX12
|
592
|
CAGGAAACAGCTATGACCCCCAGTATCACAGGGATTTCCTTTC
|
|
EX13
|
515
|
CAGGAAACAGCTATGACCTTGCAGTCCCAGTCGTAGCCA
|
|
EX14
|
510
|
CAGGAAACAGCTATGACCGGTAAACTTCAGTCCCTCGTCCCA
|
|
EX15
|
530
|
CAGGAAACAGCTATGACCCTCTGATTCCCACCACGGCA
|
|
EX16
|
477
|
CAGGAAACAGCTATGACCAGGGAGAAAGGAAGGAAAGGGA
|
|
EX17
|
562
|
CAGGAAACAGCTATGACCTGGTGGCTGACACACAGTAAGCA
|
|
EX18
|
548
|
CAGGGAACAGCTATGACCAGTCTTTGGTGGCTGAATGG
|
|
EX19
|
512
|
CAGGAAACAGCTATGACCTTGCCAAATTCGGTCCACCC
|
|
Nom
|
|
Amorces universelles séquençage
|
|
-21M13
|
|
TGTAAAACGACGGCCAGT (SENS)
|
|
M13R
|
|
CAGGAAACAGCTATGACC (ANTISENS)
|
Résultats
En ce qui concerne les résultats des patients « Necker »
(tableau 2)( Tableau 2 ), des mutations
ont été retrouvées dans 4 cas sur 5 dont une sur un site
d’épissage. Les résultats de l’équipe italienne sont conformes à
ceux obtenus pour 4 patients : les trois patients mutés sur
les parties codantes du gène XLA et le patient non muté. Le patient
présentant une mutation intronique (IVS16+1C>G) n’avait pas été
retrouvé muté par l’équipe italienne, car seules les séquences
codantes avaient été analysées. Les mères des enfants pour qui un
séquençage a été réalisé se sont révélées hétérozygotes pour la
même mutation que leur fils.
Tableau 2 Résultats du séquençage pour le groupe de
patients Necker. La rubrique statut de la mutation est constituée
d’informations provenant de sources publiées, de la BTKbase ou
d’évaluation par un logiciel de prédiction d’altération de
structure de la protéine (PolyPhen).
|
Patients
|
Mutation
|
Conséquence de la mutation (publiée ou évaluée par un
logiciel)
|
Renseignements patients
|
- Groupe
- Necker
- (5 patients
- + 2 mères)
|
|
|
- Interprétation impossible sans étude de fonctionnalité
- Mutation à l’état hétérozygote
|
Pas de mutation décrite par l’équipe italienne (pas de séquençage
des introns)
|
|
|
- Décalage du cadre de lecture
- Mutation à l’état hétérozygote
|
Même mutation décrite par l’équipe italienne
|
|
1 patient
|
Q516X
|
Protéine tronquée
|
Même mutation décrite par l’équipe italienne
|
|
1 patient
|
M509V
|
Mutation reconnue responsable de la maladie [8]
|
Même mutation décrite par l’équipe Italienne
|
|
1 patient
|
Pas de mutation
|
-
|
Pas de mutation décrite par l’équipe italienne
|
Discussion
L’étude des patients Necker a permis la validation technique du
séquençage d’une part, pour les patients par comparaison des
données génétiques déjà disponibles et, d’autre part, pour les
mères hétérozygotes en vérifiant que la mutation de leur fils était
effectivement retrouvée. La principale difficulté rencontrée lors
de la validation des résultats concerne les problèmes
d’interprétation. En effet, l’absence de détection de mutation (cas
d’un des patients) n’exclut pas la présence d’une
agammaglobulinémie autre (15 % des agammaglobulinémies) [9],
et la présence de mutation non décrite dans la littérature doit
nécessairement faire l’objet d’une étude au moins prédictive pour
connaître l’altération structurale de la protéine. Ainsi, le
laboratoire s’est engagé non seulement à évaluer le statut
mutationnel de ces patients, mais aussi à se prononcer sur
l’implication dans la maladie de Bruton. Une stratégie de réponse
graduée pour chaque cas de figure a donc été envisagée. Le cas le
plus simple est constitué par le patient pour qui une mutation
(codante ou appartenant à un site d’épissage) est retrouvée et dont
la mutation est décrite dans la BTKbase ou dans la littérature
comme ayant été déjà responsable d’observation clinique de la
maladie de Bruton. Le résultat est donc simple, la mutation est
responsable de la maladie de Bruton. Si le patient présente une
mutation non répertoriée dans la partie codante de la protéine, une
étude structurale à l’aide d’un logiciel de prédiction d’altération
de structure est réalisée (PolyPhen sur
http://tux.embl-heidelberg.de/ramensky/). Ce logiciel utilise à la
fois des bases données contenant des informations sur les sites
fonctionnels de la Btk, mais aussi des bases de calculs permettant
de prédire une altération conformationnelle de la protéine. Le
résultat est rendu sous forme d’une probabilité qualitative
(altération bénigne, probablement dommageable ou possiblement
dommageable). C’est ce résultat, comparé à la symptomatologie
clinique et à la biologie, qui permettra au clinicien de juger s’il
s’agit d’une maladie de Bruton vraie ou si d’autres analyses
éliminant d’autres types de DIP sont nécessaires. Enfin, le dernier
cas concerne les mutations introniques non décrites (un cas dans le
groupe Necker). Il est démontré dans la littérature que ces
mutations ont des implications très diverses sur la quantité et la
fonctionnalité de la Btk, et il a aussi été permis de faire le lien
entre ces mutations et de nombreux cas de maladie de Bruton. Ainsi,
une analyse in vitro de la fonctionnalité (notamment l’activité
tyrosine kinase) [10], de la taille de la protéine ainsi que
l’étude de l’ARN messager (qualitative et quantitative)
actuellement en cours de mise au point permettront de lever le
doute sur le rôle des nouvelles mutations introniques qui seront
découvertes.
L’intérêt de réaliser un dépistage chez les patients suspectés
atteints de la maladie permet d’atteindre deux objectifs.
Premièrement, chez des patients pour qui la clinique n’est pas
typique (notamment les patients atteints de déficit immunitaire
commun variable DICV), la génétique permet de lever certaines
ambiguïtés. En effet, il a déjà été montré dans certaines études
que lorsque la cohorte de patients DICV était bien définie
(lymphopénie B profonde et hypogammaglobulinémie), il était
retrouvé avec des pourcentages élevés (jusqu’à 10 % des
patients DICV) une maladie de Bruton [11]. Il serait donc
recommandé d’effectuer un dépistage de la maladie devant tout
tableau biologique associant une lymphopénie B à une
hypogammaglobulinémie congénitale. Deuxièmement, une fois la
maladie diagnostiquée, une prise en charge de la famille du patient
en termes de conseil génétique permettra de proposer la mise en
œuvre d’outils de diagnostic prénatal ou préimplantatoire [7].
Enfin, l’étude de la relation phénotype/génotype de la maladie
n’a à ce jour pas pu être établie, probablement par un manque de
puissance de ces études, tant les mutations sont diverses et la
maladie rare. Il apparaît donc que seule la centralisation des
données nationales et internationales dans des fichiers accessibles
à tous comme ceux de la BTKbase permettra la réalisation de
méta-analayses pour mieux comprendre cette pathologie.
Conclusion
La maladie de Bruton est une affection qui nécessite un traitement
à vie avec plus ou moins de contraintes et de séquelles liées aux
infections récidivantes. Le séquençage du gène XLA est aujourd’hui
non seulement une aide au clinicien pour confirmer le diagnostic
clinique, mais permet aussi de mieux informer les familles
vectrices du gène muté des risques potentiels pour les futures
grossesses et enfin de leur proposer un diagnostic prénatal ou
pré-implantatoire. En effet, une adaptation de la technique est
actuellement en cours de validation à partir du liquide amniotique.
La constitution d’une base de données clinico-biologiques comparée
au statut mutationnel des patients et la création d’une
bibliothèque d’ADN permettront aussi de mieux étudier cette
maladie. En effet, le diagnostic génétique jusqu’ici non réalisé en
France permettra de centraliser les données des patients français,
mais aussi de réaliser des études comparatives
« génotype/phénotype » qui nécessitent des cohortes de
patients importantes. Enfin, la détection et la déclaration de
nouvelles mutations dans la BTKbase permettent une mise en commun
des données internationales.
Références
1 Cooper MA, Pommering TL, Koranyi K. Primary
immunodeficiencies. Am Fam Physician 2003 ; 68 : 2001-8.
2 Vetrie D, Vorechovsky I, Sideras P, et al.
The gene involved in X-linked agammaglobulinaemia is a member of
the src family of protein-tyrosine kinases. Nature 1993 ;
361 : 226-33.
3 Mensink EJBM, Thompson A, Schot JDL,
et al. Mapping of a gene for X-linked agammaglobulinemia and
evidence for genetic heterogeneity. Hum Genet 1986 ; 73 :
327-32.
4 Vihinen M, Brandau O, Branden LJ, et al.
BTKbase, mutation database for X-linked agammaglobulinemia (XLA).
Nucleic Acids Res 1998 ; 26 : 242-7.
5 Holinski-Feder E, Weiss M, Brandau O,
et al. Mutation screening of the BTK gene in 56 families with
X-linked agammaglobulinemia (XLA) : 47 unique mutations
without correlation to clinical course. Pediatrics 1998 ;
101 : 276-84.
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et al. Bruton’s tyrosine kinase : cell biology, sequence
conservation, mutation spectrum, siRNA modifications, and
expression profiling. Immunol Rev 2005 ; 203 :
200-15.
7 d’Audigier C, Rodriguez C. Déficits immunitaires
primitifs et analyse génétique de la maladie de Bruton :
quelles perspectives offre ce diagnostic génétique ? Ann Biol Clin
(Paris) 2006 ; 64 : 421-8.
8 Vorechovsky I, Vihinen M, de Saint Basile G,
et al. DNA-based mutation analysis of Bruton’s tyrosine kinase
gene in patients with X-linked agammaglobulinaemia. Hum Mol Genet
1995 ; 4 : 51-8.
9 Conley ME, Broides A, Hernandez-Trujillo V,
et al. Genetic analysis of patients with defects in early
B-cell development. Immunol Rev 2005 ; 203 : 216-34.
10 Stewart DM, Tian L, Nelson DL. A case of
X-linked agammaglobulinemia diagnosed in adulthood. Clin Immunol
2001 ; 1 : 94-9.
11 Kanegane H, Tsukada S, Iwata T, et al.
Detection of Bruton’s tyrosine kinase mutations in
hypogammaglobulinaemic males registered as common variable
immunodeficiency (CVID) in the Japanese Immunodeficiency Registry.
Clin Exp Immunol 2000 ; 3 : 512-7.
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