ARTICLE
Auteur(s) : M
Pachot, F Péronnet, C Villard, A Bayle
Laboratoire de biologie polyvalente, Centre hospitalier de
Mâcon, boulevard Louis Escande, Mâcon
Article reçu le 19 Janvier 2006, accepté le 29 Avril 2006
La protéine C-réactive (CRP), protéine pentamérique synthétisée par
le foie sous l’action des cytokines (essentiellement IL-6) est un
marqueur de la réaction inflammatoire connu depuis 1930. Cette
protéine a la particularité de précipiter en présence du
polysaccharide (protéine C) du pneumocoque. Elle prépare la
phagocytose en se fixant sur la bactérie et en activant le
complément (opsonisation). La CRP est la protéine la plus sensible
de la phase aiguë de l’inflammation, sa concentration augmentant
très rapidement dans les processus inflammatoires [1]. Son dosage
est réalisé le plus souvent par des techniques
immuno-néphélométriques et immuno-turbidimétriques, ces dernières
ayant l’avantage d’être disponibles sur des analyseurs
multiparamétriques de biochimie. L’apparition de nouvelles méthodes
de dosage plus sensibles, comme les techniques Latex, permet de
l’utiliser comme témoin de l’inflammation à bas bruit et ainsi
comme marqueur précoce de l’athérosclérose. Elle prend alors
l’appellation de CRP ultrasensible. De nombreuses études ont ainsi
montré l’implication de la CRP dans le processus athéromateux et
son intérêt en tant que marqueur de risque cardiovasculaire [2].Le
laboratoire du Centre hospitalier de Mâcon réalise environ
19 700 dosages de CRP par an, demandes provenant
essentiellement des services des urgences, de pédiatrie et de
néonatologie. Ces analyses sont ainsi réalisées 24 heures sur
24 sur l’automate Roche Hitachi 917®. Il est donc
indispensable pour le laboratoire de disposer d’un test rapide
présentant un excellent rapport coût/rentabilité diagnostique afin
de répondre à la demande des cliniciens dans le diagnostic précoce
des états infectieux et pour la surveillance de l’efficacité des
traitements de nombreuses maladies inflammatoires et infectieuses.
Le réactif de la société Diasys permettant le dosage de la CRP sur
l’automate Roche Hitachi 917 a ainsi été testé en utilisant des
réactifs code-barrés et une application de l’automate. Une partie
des résultats a été comparée avec ceux obtenus par la technique
latex Roche.
Matériel et méthode
Prélèvements
Les dosages de CRP sont réalisés sur plasma hépariné après
centrifugation 10 minutes à 3 500 tours/min. Tous les dosages sont
réalisés sur plasma frais, conservés à température ambiante, et
analysés au maximum dans les 4 heures suivant leur
centrifugation. Ces prélèvements proviennent des différents
services du Centre hospitalier de Mâcon.
Principe du dosage
Réactif Diasys
La technique est de type immunoturbidimétrique classique. La
concentration en CRP est déterminée par mesure photométrique en
point final de la réaction antigène-anticorps. La limite de
détection analytique est donnée à 2 mg/L par la fiche technique. La
valeur usuelle dans le cadre du diagnostic de l’inflammation est
donnée inférieure à 5 mg/L chez l’adulte. En remarque, la notice
précise que les valeurs de CRP > 3 mg/L peuvent indiquer un
risque cardiovasculaire.
Réactif Roche : Tina Quant CRP Latex
La technique est de type immunoturbidimétrique sur particules de
latex. Elle utilise une combinaison de particules de latex de deux
tailles différentes (technologie Durel dual radius enhanced latex),
recouvertes d’anticorps monoclonaux et présentant des affinités
différentes vis-à-vis de la CRP. Les particules de grande taille
ont une forte réactivité et permettent un dosage précis dans les
très basses concentrations. Les particules de plus grande taille ne
commencent à réagir qu’à des concentrations correspondant au
plateau de densité optique des grandes particules agissant ainsi
comme un relais pour les concentrations les plus élevées. Ce
procédé assure ainsi une bonne sensibilité et linéarité de la
technique avec une sensibilité fonctionnelle évaluée à 1 mg/L.
Conditions d’évaluation
Les essais se sont déroulés durant environ 7 mois (janvier à
juillet 2005) selon un protocole réalisé avec la société Diasys et
inspiré du protocole de validation de techniques de la Société
française de biologie clinique [3, 4].
Lots de réactifs utilisés : Calibrateur : CFAS protein
(Roche) lot 165879
Contrôles : « Liquicheck Immunology Control »
(Biorad) lot 52220 analysé quotidiennement. Réactif Roche :
lot n°171467.01 (péremption 08.2005). Réactif Diasys : lot n°
60023691 (péremption 01.2007).
Analyse statistique
Elle a été effectuée selon les recommandations de la SFBC à l’aide
du protocole Valtec [3].
Résultats
Évaluation des performances analytiques du réactif Diasys
Répétabilité et reproductibilité
La répétabilité et la reproductibilité ont été étudiées selon les
recommandations du protocole Valtec sur 3 pools de sérums
correspondant aux trois niveaux à tester : bas (15 mg/L), moyen (50
mg/L) et haut (100 mg/L) ainsi que sur 2 niveaux bas de CRP (0,8
mg/L et 1,3 mg/L) et sur le contrôle journalier (Biorad Liquicheck
Immunology Control) afin de couvrir une grande partie de la gamme
d’étalonnage. Les résultats obtenus sont tout à fait satisfaisants
(tableau 1)( Tableau 1 ). Les CV sont
inférieurs ou proches de 5 % pour des valeurs supérieures à
1 mg/L et inférieurs à 10 % pour des valeurs de CRP
inférieures à 1 mg/L.
Tableau 1 Performances du réactif CRP
Diasys® sur Roche Hitachi 917®.
|
|
Répétabilité
|
Reproductibilité
|
|
Valeur attendue
|
Moyenne
|
Écart-type
|
CV%
|
Moyenne
|
Écart-type
|
CV%
|
|
1 (n = 10)
|
0,8
|
0,8
|
0,067
|
8,3
|
|
|
|
|
2 (n = 14)
|
1,3
|
1,27
|
0,061
|
4,8
|
|
|
|
|
3 (n = 20)
|
14
|
13,82
|
0,114
|
0,8
|
13,78
|
0,523
|
3,8
|
|
4 (n = 20)
|
41
|
40,52
|
0,280
|
0,7
|
39,84
|
0,602
|
1,5
|
|
5 (n = 20)
|
74
|
78,30
|
0,412
|
0,5
|
75,5
|
4,439
|
5,9
|
|
6 (n = 185)
|
60
|
|
|
|
65,49
|
1,45
|
2,21
|
Profil de précision
Le profil de précision a été évalué en intrasérie uniquement en
valeur basse (< 20 mg/L). Des dilutions de raison 2 dans un pool
de plasma ayant une CRP < 0,1 mg/L ont ainsi été réalisées à
partir d’un plasma de patient. Chaque dilution a été analysée 10
fois. Les résultats montrent une très bonne précision de la
technique (figures 1 et 2). En effet, les CV sont inférieurs à
5 % pour des valeurs supérieures à 1 et inférieurs à 10 %
pour des valeurs à 0,3 et 0,6 mg/L.
Limite de détection
La limite de détection a été évaluée à partir de 30 mesures de
blanc (eau distillée) réalisées dans la même série. Elle a été
calculée selon la formule Ld = md + Ksd (md = moyenne des blancs
mesurés et Sd l’écart-type). Le coefficient K pour une population
étudiée supérieure à 30 et pour un risque α et β à 5 % est
donné dans la littérature à 4,65 [2]. La limite de détection a donc
été calculée à 0,3 mg/L.
Limite de linéarité
La limite de linéarité a été évaluée en valeur haute. Pour éviter
de multiplier le nombre de calibrateur à bord de l’automate Roche
Hitachi 917®, le CFAS protein (Roche) est utilisé à la
place des calibrateurs proposés par la société Diasys. Le dernier
point de gamme d’étalonnage est donné à 250 mg/L. De ce fait, la
dilution automatique d’un échantillon est réalisée pour des valeurs
de CRP supérieures à 250 mg/L. Sur une période de huit mois, nous
avons comparé les valeurs de CRP avant (prise d’essai de
10 μL) et après (prise d’essai réduite 4 μL) dilution
automatique ( (figure
2) ) en supprimant de notre étude les résultats
d’échantillons hémolysés. La droite de régression linéaire obtenue
est définie par l’équation : y = 0,736x + 92,642 avec un
coefficient de corrélation R2 = 0,87. Si nous traçons la
bissectrice (y = 1,0154x), les deux droites se coupent vers 325
mg/L. Nous pouvons ainsi évaluer la limite de linéarité aux
alentours de 325 mg/L. Nous avons donc programmé la dilution
automatique des échantillons pour des valeurs de CRP supérieures à
300 mg/L.
Comparaison avec la technique CRP Latex Roche®
Cent deux échantillons (plasmas héparinés) provenant de patients
hospitalisés dans différents services du Centre hospitalier de
Mâcon ont été analysés simultanément avec les deux réactifs sur
l’Hitachi 917. La corrélation entre les deux techniques est
excellente sur l’ensemble du domaine de mesure. La droite de
régression linéaire (Passing Bablok) est définie par l’équation y =
0,99x – 2,97 avec un coefficient de corrélation de 0,99 ( (figure 3) ).
Discussion
Cette étude a permis de confirmer les bonnes performances
analytiques de la technique Diasys pour le dosage de la
CRP dans les domaines de mesures classiques : CV
excellent en répétabilité et en reproductibilité, linéarité jusqu’à
325 mg/L. Par ailleurs, les études en valeurs basses montrent un CV
inférieur à 10 % en répétabilité pour des valeurs à 0,8 mg/L
et 1,27 mg/L, mais également pour l’ensemble des points de 1 à 20
mg/L étudiés pour le profil de précision. Le domaine de mesure en
valeurs basses pourrait donc s’étendre jusqu’à 1 mg/L. Cette
modification imposerait une confirmation des résultats avec un
autre lot de réactif et la réalisation du profil de précision sur
des jours différents. Le seuil analytique de 2 mg/L annoncé par la
fiche technique est donc tout à fait en accord avec les résultats
observés lors de cette étude.
De nombreuses études ont montré l’intérêt du dosage de la CRP
dans la prédiction du risque vasculaire. En effet, la présence de
CRP dans les plaques aortiques humaines a été montrée dès 1985 [5].
La CRP peut agir comme procoagulant en induisant l’expression de
facteurs tissulaires par les monocytes dont le chimiotactisme est
également activé [6]. Elle facilite l’incorporation des LDL natives
ou peu modifiées par les macrophages au niveau de la paroi
vasculaire en se liant aux agrégats de LDL et de VLDL [7]. Enfin,
la CRP active la voie classique du complément et peut ainsi
participer à l’aggravation des lésions tissulaires [8].
Le dosage de la CRP permet ainsi de prédire le risque
cardiovasculaire : une hs-CRP < 1 mg/L donne un risque
faible de développer une maladie cardiovasculaire, une hs-CRP
comprise entre 1 et 3 mg/L un risque modéré et une hs-CRP > 3
mg/L un risque élevé. Ces dosages respectent différentes
conditions : la hs-CRP doit être exprimée uniquement en mg/L,
la réalisation de deux dosages à un intervalle de 2 semaines
donne une estimation plus stable du niveau de ce marqueur. Si un
résultat est rendu >10 mg/L il faut exclure toute source
d’infection ou d’inflammation qui pourrait gêner à la prédiction du
risque coronarien et le résultat devra être contrôlé à un
intervalle de deux semaines [9].
Un réactif de CRP peut être utilisé pour le dépistage du risque
cardiovasculaire si le CV pour des valeurs comprises entre 0,3 et
10 mg/L est inférieur à 10 % [9, 10]. La CRP de la société
Diasys répond ainsi à ces critères pour des valeurs supérieures à 1
mg/L et peut donc être utilisée pour classer les patients des 2
terciles ayant un risque cardiovasculaire modéré ou élevé.
Conclusion
Le laboratoire dispose ainsi avec la CRP Diasys d’un réactif bien
adapté à la routine et à l’urgence : réactif code barré
utilisant une application standard de l’automate Roche Hitachi 917.
Suite à cette étude, la limite de linéarité (seuil au-dessus de
laquelle l’automate réanalyse automatiquement en volume réduit
l’échantillon) a pu être augmentée de 250 à 300 mg/L permettant
ainsi une réduction de 2 % des réanalyses. Bien qu’elle n’ait
pas l’appellation d’ultrasensible, la qualité des mesures pour des
valeurs comprises entre 1 et 3 mg/L permet de l’utiliser en tant
que marqueur prédictif du risque cardiovasculaire.
Références
1 Gabay C, Kushner I. Acute-phase proteins and other
systemic responses to inflammation. N Engl J Med 1999 ;
340 : 448-54.
2 Yeh ET. High-sensitivity C-reactive protein as a risk
assessment tool for cardiovascular disease. Clin Cardiol
2005 ; 28 : 408-12.
3 Vassault A, Azzedine MC, Bailly M, et al.
Protocole de validation de techniques (document B, stade 3). Ann
Biol Clin (Paris) 1986 : 686-745.
4 Capolaghi B, Vassault A, Grafmeyer D,
Yvert JP. Adaptation du protocole de validation de techniques.
Ann Biol Clin (Paris) 1997 ; 55 : 167-8.
5 Vlaicu R, Rus HG, Niculescu F. Cristea. A.
Immunoglobulins and complement components in human aortic
atherosclerotic intima. Atherosclerosis 1985 ; 55 :
35-50.
6 Cermak J, Key NS, Bach RR, Balla J,
Jacob HS, Vercellotti GM. C-reactive protein induces
human peripheral blood monocytes to synthesize tissue factor. Blood
1993 ; 82 : 513-20.
7 Rowe IF, Walker LN, Bowyer DE, Soutar AK,
Smith LC, Pepys MB. Immunohistochemical studies of
C-reactive protein and apolipoprotein B in inflammatory and
arterial lesions. J Pathol 1985 ; 145 : 241-9.
8 Torzewski J, Bowyer DE, Waltenberger J,
Fitzsimmons C. Processes in atherogenesis : complement
activation. Atherosclerosis 1997 ; 132 : 131-8.
9 Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW,
et al. Centers for Disease Control and Prevention American
Heart Association. Markers of inflammation and cardiovascular
disease : application to clinical and public health
practice : a statement for healthcare professionals from the
Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart
Association. Circulation 2003 ; 107 : 499-511.
10 Roberts WL, Moulton L, Law TC, et al.
Evaluation of nine automated high-sensitivity C-reactive protein
methods : implications for clinical and epidemiological
applications. Part 2. Clin Chem 2001 ; 47 : 418-25.
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