ARTICLE
Auteur(s) : E Cavalier, A Carlisi,
J-P Chapelle
Service de chimie médicale, CHU de Liège, Belgique
Article reçu le 19 Août 2005, accepté le 10 Novembre 2005
L’ImmunoCap 250 est un automate qui permet de réaliser le dosage
des IgE spécifiques et totales dans le sérum, récemment mis sur le
marché par la société Sweden Diagnostics (Uppsala, Suède). Cet
appareil, qui arrive presque dix ans après le lancement de l’Unicap
100, vient combler le vide entre celui-ci et l’Unicap 1000 (mis sur
le marché en 2001) et permet, grâce à grande capacité de travail et
de gestion, le remplacement dans notre laboratoire de trois Unicaps
100. La possibilité de stocker les réactifs à bord, le chargement
continu des échantillons et sa capacité de travail en font un
appareil de choix pour des laboratoires qui, comme le nôtre,
réalisent 25 000 dosages d’IgE spécifiques et 8 000 dosages d’IgE
totales par an. Nous avons évalué ses caractéristiques analytiques
et redosé des échantillons sanguins que nous avions trouvés
positifs avec l’Unicap 100, appareil que nous utilisons en routine
dans notre laboratoire.
Matériel et méthodes
Échantillons
Les échantillons de sérum que nous avons analysés ont été prélevés
chez des patients provenant des consultations d’allergologie, de
pédiatrie et de dermatologie que nous recevons quotidiennement.
Nous avons étudié plus particulièrement les IgE dirigées contre 10
allergènes en raison de leur fréquence particulièrement haute
chez les patients atopiques : il s’agit de d1 (acarien), e1
(chat), e5 (chien), f1 (blanc d’œuf), f2 (lait de vache), f13
(arachide), i1 (abeille), i3 (guêpe), m5 (Candida albicans) et t3
(pollen de bouleau) ainsi que 2 mixtures d’allergènes :
gx3 (mixture de graminées) et wx6 (mixture d’herbacées).
ImmunoCap 250
L’ImmunoCap 250, automate dédié aujourd’hui uniquement à
l’allergie, dispose, conservés à 4 °C, de 178 kits
d’allergènes différents et peut être chargé de 5 racks de 10
échantillons sériques au maximum. Sa cadence maximale est de 60
résultats/heure. Le principe de fonctionnement est le
suivant : le logiciel de l’automate interroge l’informatique
centrale du laboratoire (en mode bidirectionnel) pour déterminer la
liste des analyses à réaliser ou le technicien encode celle-ci
manuellement. Ensuite la machine prélève 40 μL de sérum qu’elle
dépose dans l’immunocap, un dispositif qui contient une éponge de
polymère hydrophile flexible sur laquelle les allergènes ou le
mélange d’allergènes sont couplés de manière covalente. Après une
incubation de 30 minutes à 37 °C, les IgE non fixées à
l’allergène sont éliminées et le conjugué (un anticorps anti-IgE
greffé avec de la β-galactosidase) est ajouté. Après 24 minutes
d’incubation, le surnageant est éliminé par aspiration et le
substrat (méthyl-umbelliféryl-β-D-galactoside) est déposé dans
l’immunocap. Suit une incubation de 9 minutes, l’ajout d’une
solution qui arrête la réaction enzymatique et lecture de la
fluorescence générée par le produit de la dégradation enzymatique,
la méthyl-umbelliférone, qui est proportionnelle à la concentration
des IgE dans le sérum.
La concentration des IgE spécifiques est exprimée en unité de
masse de protéine IgE par litre, où 1 kUA /L =
0,994 kU/L, 1 unité (U) de protéine IgE étant définie par le
standard international WHO 75/502 comme correspondant à 2,42 ng.
Les courbes de calibration (IgE humaines en milieu tampon) vont de
0 à 100 kUA/L pour les IgE spécifiques et de 2 à 5 000
kU/L pour les IgE totales.
Résultats
Répétabilité et reproductibilité
La reproductibilité intra-série a été déterminée pour 4 allergènes
(d1, e1, i3, t3) et pour les IgE totales sur 20 réplicats (tableau
1( Tableau 1 )). Les coefficients de
variation sont inférieurs à 10 % sauf pour le taux faible en
i3 (0,80 kUA/L) où le coefficient a atteint 13 %.
La reproductibilité inter-série a été étudiée sur 5 niveaux, en
10 jours différents répartis sur trois mois. Tous les CV sont
inférieurs à 10 % (tableau 2( Tableau
2 )).
Tableau 1 Reproductibilité intra-série.
|
Allergène
|
Nombre d’essais
|
Moyenne
|
Écart-type
|
CV (%)
|
|
d1
|
20
|
8,9 kUA/L
|
0,3 kUA/L
|
3,4
|
|
e1
|
20
|
17,2 kUA/L
|
1,6 kUA/L
|
9,2
|
|
i3
|
20
|
0,80 kUA/L
|
0,10 kUA/L
|
12,9
|
|
t3
|
20
|
51,5 kUA/L
|
2,7 kUA/L
|
5,2
|
|
IgE totales
|
20
|
60 kU/L
|
1,2 kU/L
|
2,0
|
|
IgE totales
|
20
|
365 kU/L
|
12,4 kU/L
|
3,4
|
Tableau 2 Reproductibilité inter-série.
|
Allergène
|
Moyenne
|
Écart-type
|
CV (%)
|
|
d1
|
1,37 kUA/L
|
0,09 kUA/L
|
6,9
|
|
d1
|
9,73 kUA/L
|
0,51 kUA/L
|
5,2
|
|
e1
|
15,5 kUA/L
|
1,18 kUA/L
|
7,6
|
|
ex1
|
25,8 kUA/L
|
1,29 kUA/L
|
5,0
|
|
t3
|
55,9 kUA/L
|
2,71 kUA/L
|
4,9
|
|
IgE totales
|
61 kU/L
|
1,6 kU/L
|
2,7
|
|
IgE totales
|
383 kU/L
|
13 kU/L
|
3,4
|
Limite de détection
La limite de détection a été déterminée en passant 20 fois le
standard zéro. On calcule ensuite la moyenne des unités relatives
(RU) obtenues et l’écart-type. La limite de détection est obtenue
en extrapolant sur la courbe de calibration la moyenne + 3
écarts-types. Pour les IgE spécifiques, elle est de 0,01 kU/L et
pour les IgE totales de 0,35 kU/L.
Linéarité valeurs théoriques/valeurs observées
Sept dilutions successives, de moitié en moitié, ont été effectuées
sur des échantillons de valeur élevée, soit 4 873 kU/L en IgE
totales et 85,3 kUA/L d’IgE anti-f1. Nous constatons que
les résultats obtenus (y) sont en corrélation avec le facteur de
dilution (x) pour les deux dosages. Les équations sont : y =
5020,2 × + 62,79 pour les IgE totales et y = 86,741 × + 2,2092 pour
les IgE spécifiques anti-f1.
Test d’enrichissement avec un standard international
Ce test a été effectué par ajout dosé de quinze quantités connues
d’IgE (2e Standard International NIBC/WHO code 75/502)
allant de 7 à 2 500 kU à un pool de sérums de faible concentration
en IgE totales. Les résultats obtenus montrent que la linéarité de
la méthode est excellente, car la différence moyenne entre les
valeurs mesurées et les valeurs attendues en milieu sérique est de
1,5 % (extrêmes : 11,6% ; - 4,4 %) avec un
coefficient de corrélation de 0,9997. L’équation de la droite de
régression est y (valeurs observées) = 0,9448 × (valeurs attendues)
+ 5,8323.
Pour déterminer la linéarité dans des valeurs plus basses, le
test a également été réalisé en effectuant cinq ajouts dosés de
quantités connues allant de 10 à 0,5 kU d’IgE au diluant fourni par
la société. La linéarité dans les valeurs les plus basses reste
excellente avec une différence moyenne de 4,8 %
(extrêmes : 0,6 % ; 10 %) et un coefficient de
corrélation de 0,9988. L’équation de la droite de régression est y
(valeurs observées) = 0,9409 x (valeurs attendues) + 0,0606.
Test de surcharge
Le pourcentage de récupération est déterminé en ajoutant en
parallèle dans le point zéro de la courbe et dans un échantillon
sérique une faible concentration de standard international (1, 2, 5
et 10 kU). On dose avant et après ajout dans les deux milieux. Les
résultats montrent que les pourcentages de récupération sont
compris entre 85 et 115 %. La récupération moyenne est de
103 %
Comparaison des résultats obtenus avec les deux appareils
IgE spécifiques
Nous avons comparé les résultats de 149 échantillons sériques
positifs pour 12 allergènes différents, dont certains hautement
impliqués dans des réactions invasives, comme i1, i3, f13 et f1.
Globalement, le diagramme de Bland-Altmann montre une différence
moyenne de 0,4 kUA/L ainsi qu’une légère tendance pour l’Unicap 250
à trouver des valeurs plus élevées pour des échantillons fortement
positifs (( figure
1 )). La droite de régression a pour équation y (U250) =
0,9138 × (U100) + 0,314 avec un r de 0,9866 dont l’intervalle de
confiance est (0,9815-0,9903) ; p < 0,001. Quand on analyse
les données allergène par allergène, on se rend compte qu’aucun
test spécifique positif sur l’Unicap 100 n’a été retrouvé négatif
par le 250 et ce même pour les valeurs proches du cut-off.
Cependant, quelques échantillons négatifs, mais ayant des RLU
relativement plus élevées, ont été retrouvés positifs avec le 250.
IgE totales
Nous avons comparé les résultats de 15 échantillons sériques dont
les taux en IgE totales sont normaux ainsi que 15 échantillons
pathologiques. Les valeurs observées sont distribuées entre 2 et
1 963 kU/L. La droite de régression globale a pour équation y
(U250) = 0,9765 x (U100) + 12 avec un r de 0,9984 dont l’intervalle
de confiance est (0,9966-0,9992) ; p < 0,001. Il faut
cependant noter que dans les valeurs < 100 kU/L, l’ImmunoCap 250
dose significativement plus haut que l’Unicap 100 alors que ce
n’est pas le cas dans les valeurs plus élevées. Le graphique de
Bland et Altman montre qu’avec l’ImmunoCap 250, les valeurs basses
sont en moyenne de l’ordre de 30 % supérieures à celles
observées sur l’Unicap 100.
Discussion
Cette étude a pour but de comparer l’Unicap 100 avec l’ImmunoCap
250 dans le cadre de son accréditation selon la norme EN 17025. Les
résultats de l’étude de précision sont conformes aux
recommandations publiées par le National committee for clinical
laboratory standards (NCCLS), à savoir un CV intra-essai inférieur
à 10 % et un CV inter-essai inférieur à 15 % [1]. Ces
résultats sont comparables à ceux obtenus avec l’Unicap 1000 [2].
La linéarité est excellente, que ce soit dans les valeurs basses ou
élevées. Le test de récupération d’une quantité connue de standard
international par la méthode des ajouts dosés donne également
entière satisfaction, avec une récupération moyenne de 103 %.
La concordance entre les deux appareils est bonne, bien que
l’ImmunoCap 250 donne des résultats un peu plus élevés que l’Unicap
100, qui peuvent devenir positifs alors qu’ils avaient
antérieurement été classés comme négatifs. La corrélation pour les
IgE spécifiques est identique à ce que De Decker et al. ont montré
pour 7 allergènes différents [3].
L’ImmunoCap 250, en plus de ses qualités analytiques, est un
appareil facile à utiliser, bien adapté pour les laboratoires qui
réalisent entre 20 000 et 30 000 déterminations par an. Le premier
résultat est disponible après 108 minutes et ensuite, un résultat
sort après chaque minute. En pratique, le chargement de l’appareil
en début de journée prend environ une heure. En plus des curve
controls, nous passons un contrôle interne à deux niveaux en début,
milieu et fin de journée. Pour les IgE spécifiques, nous utilisons
un contrôle « titré » commercialisé par Sweden
Diagnostics et un pool de sérums positifs en d1 dont nous avons
déterminé la valeur ; au moins un des ces deux contrôles doit
se trouver dans la zone cut-off, vers 0,50 kUA/L.
L’ImmunoCap 250 est une amélioration dans le travail de notre
laboratoire : par rapport aux 3 Unicap 100 que nous
utilisions, nous économisons du temps-technicien, la qualité
augmente grâce notamment à la possibilité de garder les Caps à bord
(ce qui ne rompt pas la chaîne du froid), et aux qualités
analytiques intrinsèques de l’appareil.
Références
1 Division of Clinical Laboratory Devices, Office of Device
Evaluation. Review criteria for the assessment of allergen-specific
immunoglobulin E (IgE) in vitro diagnostics devices using
immunological methods. Washington : Public Health Service,
2000 ; 1–18.
2 Barthet C, Sabbah A, Lewin P. Setup of the Unicap 1000 in a
reference lab specialised in allergy : technical organisation
and performances. Abstract book of the XXIII EAACI Congress,
Amsterdam, 2004.
3 De Decker L, Zone A, Leborgne M. Évaluation analytique de
l’ImmunoCap 250, nouvel automate d’allergie, Poster Corata 2004
(Paris) sur
http ://www.corata.org//recueil_paris/posterparisdedecker.htm.
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