ARTICLE
Auteur(s) :, F
Leduc, M Bonnière, I Farre, P Staelen
Centre Nordpathologie, Lille
Article reçu le 31 Mars 2004, accepté le 1 Juillet 2004
Le typage des papillomavirus est possible par méthode polymerase
chain reaction (PCR), méthode de référence mais coûteuse et
délicate, ou par Hybrid Capture®, développée par Digene,
seule technique actuellement applicable en routine. Cette méthode
est validée aux États-Unis à partir d’un prélèvement effectué par
Cervical Sampler™ (Digene), Thinprep® ou
Autocyte®.Le but de l’étude que nous avons menée a été
de démontrer la fiabilité de la détection de l’HPV oncogène sur le
milieu liquide conservateur cellulaire Easyfix® de
Labonord que nous utilisons en pratique courante depuis plusieurs
années pour la cytologie en milieu liquide. Déjà dans notre
expérience nous avons retrouvé un HPV oncogène dans tous les cas
testés de lésions cytologiques malpighiennes de haut grade. Nous
avons voulu savoir si les résultats du test HPV oncogène sur milieu
Easyfix et sur milieu Cervical Sampler™ étaient concordants pour
les cas d’atypies des cellules malpighiennes de signification
indéterminée (ASC-US).
Méthodologie
Nous avons sélectionné 256 femmes chez qui un premier examen
cytologique sur milieu liquide Easyfix® a retrouvé des
lésions de type ASC-US (114 cas), bas grade (122 cas),
haut grade (19 cas) ou atypies des cellules glandulaires
(1 cas). Ces patientes font partie de la consultation de
plusieurs médecins gynécologues exerçant en milieu libéral ou
hospitalier. Elles ont entre 15 et 83 ans avec un âge
moyen de 38,7 ans. Le protocole retenu a été de réaliser chez
ces patientes volontaires deux prélèvements successifs au cours du
même examen gynécologique :
- – le premier prélèvement est effectué avec une brosse
type Cervex-Brush®. L’extrémité de la brosse est placée
dans le milieu de conservation cellulaire Easyfix®. Il
servira à réaliser une étude cytologique classique et une recherche
d’HPV oncogène ;
- – le deuxième prélèvement est réalisé immédiatement
après au moyen du kit Cervical Sampler™ fourni par la société
Digene. Il permettra de réaliser une deuxième recherche d’HPV pour
étude comparative.
Les deux prélèvements sont alors adressés au laboratoire. Après
enregistrement, ils seront analysés séparément.
Étude cytologique
Les prélèvements sont agités pendant 20 minutes puis passés
sur vortex pendant 5 secondes. La concentration de leur
contenu est évaluée par le Turbitec® (Labonord). On
remplit les chambres d’une centrifugeuse Rotofix 32 avec
1,5 mL de liquide Easyfix® Réf.10056750 auquel on
ajoute une quantité de prélèvement variable selon la concentration
cellulaire estimée. On centrifuge pendant 10 min à
3 000 tours/min. On obtient un spot cellulaire sur lames
polyL Lysine. Les lames sont séchées pendant 15 min puis
colorées à l’Hématoxyline Shorr 45 mn avec un automate de
coloration Shandon. Les lames obtenues font l’objet d’une double
lecture et les résultats sont établis selon le système de Bethesda.
Détection d’HPV sur milieu Cervical Sampler™
Les prélèvements sont traités comme indiqué par Digene :
dénaturation pendant 45 min à 65 °C avec le réactif
fourni ; hybridation pendant 60 min à 65 °C avec la
sonde B (risque élevé); étape de capture d’hybride pendant
60 min à température ambiante ; mise en contact avec le
réactif de détection 1 pendant 30 min puis avec le
réactif de détection 2 pendant 15 min à température
ambiante et à l’abri de la lumière. La lecture est faite avec un
luminomètre DML 2000 et les résultats sont exprimés en RLU (unité
relative de lumière) par rapport au contrôle témoin positif ;
les échantillons sont considérés comme positifs si le rapport est
supérieur à 1, c’est-à-dire à la moyenne des rapports des témoins
positifs.
Détection d’HPV sur milieu Easyfix®
Le volume d’échantillon utilisé est fonction de sa concentration
cellulaire préalablement estimée : 10 mL pour les
concentrations faibles, 5 mL pour les autres. Le surnageant
est éliminé. Le culot est lavé avec 1 mL de PBS, passé au
vortex puis centrifugé à 2 000 t/min pendant 5 min.
Le surnageant est éliminé et le culot est séché. L’échantillon est
remis en suspension avec 100 microlitres du milieu de
transport Cervical Sampler™ pour test HPV. On réalise ensuite la
détection HPV selon le protocole Digene en modifiant simplement la
phase de dénaturation : elle est portée à 90 min avec
100 microlitres de NaOH.
Regroupement des données
Pour chaque cas, les items suivants ont été colligés : âge de
la patiente, diagnostic cytologique du premier frottis avec densité
cellulaire, qualité du prélèvement, richesse en cellules
malpighiennes, intensité de l’inflammation éventuelle, diagnostic
cytologique du deuxième frottis concomitant, résultat du test HPV
avec valeurs RLU sur milieu Easyfix® et sur milieu
Cervical Sampler™, résultat d’une éventuelle biopsie. Les résultats
concordants et discordants ont été comparés par le calcul du
coefficient kappa de Cohen et par le test de khi2 de Mac Nemar.
Résultats
Répartition des cas sélectionnés
Les 256 cas sélectionnés au début de l’étude correspondent à
114 cas ASC-US, 122 lésions de bas grade, 19 lésions
de haut grade et 1 cas d’anomalies des cellules glandulaires
(AGC).
Répartition des résultats cytologiques sur le deuxième
prélèvement
Le délai moyen entre le premier prélèvement (ASC-US) et le deuxième
prélèvement est de 184 jours. Les résultats du deuxième examen
cytologique sont : 108 cas cytologiquement normaux,
35 ASC-US, 97 lésions de bas grade, 14 lésions de
haut grade, 1 AGC et 1 cas non satisfaisant pour
l’interprétation.
Répartition des résultats HPV oncogènes
Les résultats des tests HPV en milieu Easyfix® et sur
milieu Cervical Sampler™ sont rapportés dans le tableau I( Tableau I ). La comparaison des résultats
du test HPV sur les deux milieux (tableau II( Tableau II )) montre une concordance pour
215 cas (121 HPV/E+ et HPV/C+, 94 HPV/E - et HPV/C
-) et une discordance pour 41 cas (26 HPV/E - et HPV/C +,
15 HPV/E + et HPV/C -). Le coefficient kappa est égal à
0,74 confirmant que la concordance moyenne entre les deux
méthodes est significative. De même le khi2 égal à
2,44 confirme l’absence d’anomalie statistique de répartition
des discordances.
La comparaison des résultats du test HPV sur les deux milieux en
fonction du résultat cytologique est rapportée dans le tableau
II.
Tableau I Résultats des tests HPV en milieu
Easyfix® (HPV/E) et sur milieu Cervical Sampler™
(HPV/CS) en fonction du résultat cytologique.
|
Cytologie
|
Normal
|
ASC-US
|
Bas grade
|
Haut grade
|
AGC
|
Non satisfaisant
|
|
HPV/E -
|
77
|
18
|
24
|
0
|
0
|
1
|
|
(30,0 %)
|
(7,0 %)
|
(9,4 %)
|
|
|
(0,4 %)
|
|
HPV/E+
|
31
|
17
|
73
|
14
|
1
|
0
|
|
(12,1 %)
|
(6,6 %)
|
(28,5 %)
|
(5,5 %)
|
(0,4%)
|
|
|
HPV/CS-
|
65
|
17
|
25
|
1
|
0
|
1
|
|
(25,4 %)
|
(6,6 %)
|
(9,8 %)
|
(0,4 %)
|
|
(0,4 %)
|
|
HPV/CS+
|
43
|
18
|
72
|
13
|
1
|
0
|
|
(16,8 %)
|
(7,3 %)
|
(28,1 %)
|
(5,1 %)
|
(0,4 %)
|
|
Tableau II Résultats des cas avec tests HPV
concordants et discordants en fonction du résultat cytologique.
|
Normal
|
ASC-US
|
Bas grade
|
Haut grade
|
AGC
|
Non satisfaisant
|
|
Cas concordants en HPV
|
|
HPV/E -
|
59
|
15
|
19
|
|
|
1
|
|
HPV/CS -
|
|
|
|
|
|
|
|
HPV/E +
|
25
|
15
|
67
|
13
|
1
|
|
|
HPV/CS +
|
|
|
|
|
|
|
|
Cas discordants en HPV
|
|
HPV/E -
|
18
|
3
|
5
|
|
|
|
|
HPV/CS +
|
|
|
|
|
|
|
|
HPV/E +
|
6
|
2
|
6
|
1
|
|
|
|
HPV/CS -
|
|
|
|
|
|
|
Sensibilité des tests HPV selon les lésions histologiques
Parmi les 98 patientes ayant bénéficié d’une biopsie montrant
une lésion au moins de bas grade, il a été retrouvé de l’HPV
oncogène dans 50 % des prélèvements en milieu
Easyfix® et dans 50 % des prélèvements en milieu
Cervical Sampler™.
Spécificité des tests HPV selon les lésions histologiques
Parmi les 24 patientes ayant bénéficié d’une biopsie montrant
un col normal ou une simple dystrophie, le test HPV oncogène a été
négatif dans 13 prélèvements en milieu Easyfix® et
dans 11 prélèvements en milieu Cervical Sampler™.
Parmi les frottis ASC-US réalisés en même temps que le test HPV,
15 cas sont concordants négatifs (HPV/C - et HPV/E -) et
15 cas sont concordants positifs (HPV/C + et HPV/E +). À
l’inverse, 5 cas sont discordants avec 2 cas HPV/C - et
HPV/E + et 3 cas HPV/C + et HPV/E -. Le coefficient kappa est
égal à 0,76 confirmant là encore que la concordance moyenne
entre les deux méthodes est significative. Le khi2 est non
significatif.
Discussion
Nous avons choisi d’étudier le typage HPV à partir du milieu
Easyfix® parce que le recueil en milieu liquide offre
plusieurs avantages. D’abord, le milieu liquide permet en un seul
prélèvement de recueillir le matériel nécessaire à la réalisation
d’un examen cytologique classique, un test HPV et d’autres études
éventuelles comme la cellularité ou la quantification d’ADN [1].
Cette concomitance d’examens permet d’avoir un contrôle cytologique
sur le matériel utilisé pour la recherche HPV. Tout matériel
cytologiquement insatisfaisant peut ainsi être écarté. Ensuite, le
milieu liquide permet une étude ciblée en ne réalisant un test HPV
que sur les prélèvements montrant une cytologie ASC-US. Enfin le
milieu liquide Easyfix® est un milieu de conservation
cellulaire à la différence du milieu Cervical Sampler™ qui est un
milieu de transport qui ne permet pas d’étude rétrospective de
l’HPV à distance du prélèvement (sauf s’il est congelé). La
stabilité de détection de l’HPV dans le milieu Easyfix®
a été évaluée par la présence de la bêta-actine (professeur
Delvenne, CHU de Liège, soumis pour publication).
Le test HPV en milieu Easyfix® a une bonne
sensibilité puisqu’il a permis de retrouver un virus oncogène dans
76,3 % des cas de lésions au moins de bas grade.
Comparativement, le même test en milieu Cervical Sampler™ a une
sensibilité de 76,5 %. Il a toujours été retrouvé du virus
oncogène dans le milieu Easyfix® des lésions de haut
grade. Par contre, un cas de lésion de haut grade s’est révélé HPV
négatif en milieu Cervical Sampler™ ; une étude est en cours
pour comprendre ce résultat (qualité cytologique optimale, dosage
d’ADN non réalisable a posteriori sur Cervical Sampler™). En tout
cas, il témoigne de la nécessité de ne pas se limiter à la seule
détection d’HPV mais de conjuguer la recherche d’HPV avec l’examen
cytologique habituel pour ne pas laisser passer de dysplasie sévère
à travers les mailles du dépistage.
Dans le milieu Easyfix®, nous avons retrouvé de l’HPV
oncogène dans 100 % des lésions de haut grade, dans
75,2 % des lésions de bas grade, dans 49,9 % des lésions
ASC-US et dans 28,7 % des cas sans anomalies cytologiques. Ces
résultats sont tout à fait parallèles aux différentes données de la
littérature [2-8] et permettent d’affirmer la validité du milieu
testé pour la recherche d’HPV oncogène. Ils confirment le peu
d’intérêt de la recherche d’HPV dans les lésions de haut grade, où
elle sera toujours positive et par contre son utilité dans les
ASC-US qui ont un risque sur deux de correspondre à une lésion liée
à un virus oncogène [2, 3, 7, 9, 10].
Quarante et un cas se sont révélés discordants avec des
résultats HPV contraires sur les deux milieux pour la même
patiente. Ces discordances sont d’interprétation délicate [9].
Elles peuvent être liées à un défaut de qualité des échantillons
testés. C’est pourquoi ces cas ont fait l’objet d’une évaluation de
la quantité d’ADN recueilli (professeur Delvenne, CHU de Liège).
Sur les 33 cas ayant pu être étudiés, 8 ont montré une
quantité d’ADN très faible. Parallèlement, si on examine
cytologiquement la qualité des frottis, 4 cas montrent une
faible richesse en cellules malpighiennes.
Ces cas discordants correspondent aussi parfois à des valeurs de
RLU proches de part et d’autre du seuil de positivité. Dix-sept cas
ont des valeurs entrant dans cette « zone grise » entre
0,8 et 1,2.
Conclusion
Notre étude a démontré la fiabilité de la recherche d’HPV par
Hybrid Capture® sur milieu Easyfix®. Elle a
confirmé la nécessité du couplage du test HPV avec l’étude
cytologique traditionnelle. En raison des multiples avantages du
milieu liquide sur le milieu Cervical Sampler™ (concomitance de
l’étude cytologique et du test HPV, possibilité d’une étude
rétrospective, possibilité d’autres études sur le même
prélèvement…), ce mode de recueil cellulaire devient incontournable
dans la stratégie de dépistage des lésions du col utérin. Du fait
de leur hétérogénéité de composition, tous les milieux liquides
devraient bénéficier de la même étude de validation.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les techniciennes E. Detrez et L.
Cesteleyn ainsi que les médecins gynécologues pour leur
contribution à cette étude.
Références
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1605-10.
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7 Zuna RE, Moore W, Dunn T. HPV DNA Testing of
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9 Federschneider JM, Crum CP. HPV testing :
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DNA test in cervical cancer screening : a study by the French
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