ARTICLE
Auteur(s) :, J-L Orsonneau1,
EA Brassart1, M Lecame2, P
Thomare2, O Delaroche1, D
Dudouet1
1Laboratoire de biochimie générale, Nantes
2Unité fonctionnelle de pharmacie clinique oncologique,
Nantes
Article reçu le 23 Mars 2004, accepté le 21 Mai 2004
La L-asparaginase (L-asparagine amidohydrolase ; EC 3.5.1.1)
fait partie de l’arsenal thérapeutique utilisé dans la prise en
charge des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) de l’adulte et
de l’enfant. En hydrolysant la L-asparagine en acide L-aspartique
et en ammonium, elle inhibe la synthèse protéique des cellules
blastiques. Celles-ci sont en effet déficitaires en asparagine
synthétase (aspartate-ammonia Ligase ; EC 6.3.1.1), et
l’administration de L-asparaginase conduit donc à l’apoptose et à
la mort cellulaire. Seulement deux formes commerciales sont
actuellement disponibles, la Kidrolase® (extraite
d’Escherichia coli), toujours administrée en première
intention, et l’Oncaspar® (forme pégylée de la
L-asparaginase d’E. coli). Ces différentes formes donnent
des taux circulants variables [1, 2] du fait d’une grande
variabilité inter-individuelle de leurs propriétés
pharmacocinétiques. Outre des effets secondaires parfois graves au
niveau du foie et du pancréas, l’administration de L-asparaginase
peut entraîner des réactions de type allergique parfois intenses,
mais aussi une réaction immunitaire asymptomatique. Celle-ci
aboutit à la synthèse d’anticorps spécifiques anti-L-asparaginase
de type IgG d’intérêt diagnostique et pronostique [3] car pouvant
conduire à une perte d’efficacité thérapeutique. Le monitorage par
mesure de l’activité enzymatique circulante est donc essentiel [4,
5]. Un seuil de 1,7 μkat/L semble assurer une déplétion
complète en L-asparagine même s’il reste actuellement discuté [5].
Quant au suivi du taux d’asparagine, il est lui plus délicat à
réaliser en pratique clinique. Cela est dû à la fois à son
instabilité dans le prélèvement, liée en particulier à la présence
de la L-asparaginase, et aux techniques chromatographiques à mettre
en œuvre [6].Plusieurs méthodes de dosage de la L-asparaginase ont
été décrites [7-10], mais la plus fréquemment utilisée est celle
décrite par Werber et al. [8]. La mesure de l’activité
enzymatique s’effectue par incubation du sérum dans un tampon
contenant de la L-asparagine, puis après arrêt de la réaction, par
dosage de l’ammonium avec le réactif de Nessler. Cette méthode est
longue et non automatisable. Il nous a paru intéressant de
développer une technique automatique plus rapide et plus précise
pour améliorer le suivi des patients.
Matériels et méthodes
Échantillons
Tous les échantillons sanguins nécessaires à la validation de la
méthode ont été prélevés sur voie centrale chez des enfants
atteints de LAL de novo traités selon le protocole Fralle
2000 au décours de l’induction (9 injections intramusculaires
de 100 μkat/m2 chacune) et de l’intensification
no 1 (6 injections de 100 μkat/m2).
Les prélèvements étaient effectués 30 minutes et 2 heures
après la première injection, puis 2 heures avant chacune des
autres injections. Pour mémoire, un microkatal (μkat) de
Kidrolase® correspond à la production d’une micromole
d’ammonium par seconde à 37 °C. La mesure de l’activité
enzymatique est une des composantes d’un monitorage spécifique de
la L-asparaginase mis en place chez ce type de population au CHU de
Nantes. Son objectif est d’explorer le phénomène de
« répondeurs silencieux » peu décrit dans la littérature.
Ce protocole sans bénéfice individuel direct a reçu l’avis
favorable du CCPPRB des Pays de Loire, et le consentement éclairé
des parents des enfants traités a été systématiquement recueilli au
préalable par écrit. Les échantillons sanguins étaient recueillis
sur héparinate de lithium. Après centrifugation et décantation, le
plasma des patients était stocké à – 80 °C, et les dosages
effectués à la fin de chaque phase de traitement.
Méthode de référence
La méthode de référence (méthode de Nessler) était celle préconisée
par Werber et al. [8]. Brièvement, 100 μL de plasma
sont incubés dans 900 μL de tampon Tris pH 7,30 contenant
44 mmol/L de L-asparagine pendant 45 minutes. Après
précipitation par l’acide trichloracétique, la concentration
d’ammonium dans le surnageant est dosé avec du réactif de Nessler
par photométrie à 450 nm du complexe iodo-mercurique formé. Le
réactif de Nessler provenait de VWR International SAS
(Fontenay-sous-bois) ref. 31074.265, la L-asparagine de Sigma
Aldrich (Saint Quentin Fallavier) réf. A-7094, et les mesures
étaient effectuées sur un spectrophotomètre Beckman DU 7500
(Beckman Coulter France SA Roissy CDG). La calibration s’effectuait
à l’aide d’une gamme de sulfate d’ammonium allant de 0 à
20 mmol/L, ce dernier point correspondant à 7,40 μkat/L
de L-asparaginase.
Méthode enzymatique
La méthode testée est basée sur l’action de la glutamate
déshydrogénase (GLDH) sur l’α-cétoglutarate en présence de NADPH.
Nous avons utilisé le réactif ammonium Roche/Hitachi 917 réf.
11877984 (Roche Diagnostics, Meylan). Les réactifs 1 (substrat
tamponné) et 2 (GLDH et NADPH) étaient utilisés selon les
recommandations du fabricant. À l’un des flacons de substrat
tamponné (réactif 1) était ajouté de la L-asparagine à la
concentration de 124 mmol/L, de manière à obtenir une
concentration finale de 40 mmol/L dans le mélange réactionnel
conformément à [2] ; il devient alors le réactif 3 pour
la programmation du cycle analytique. La stabilité de celui-ci a
été vérifiée sur une semaine dans le compartiment réactif de
l’analyseur. Le dosage était effectué dans un canal ouvert d’un
Hitachi 917 selon la programmation du tableau I( Tableau I ). En résumé, après élimination
de l’ammonium endogène (échantillon, réactif 1 puis réactif
2), le réactif 3 contenant la L-asparagine est rajouté
5 minutes après le début du cycle analytique. La cinétique
d’apparition de l’ammonium produit par la L-asparaginase
plasmatique est suivi par la décroissance de DO à 340 nm entre
la 8e et la 10e minute du cycle analytique.
La Kidrolase® (Laboratoire Bellon, Montrouge) a été
utilisée pour la préparation des sérums de contrôle, les trois
niveaux ont été aliquotés et stockés à – 80 °C. Il n’a pas été
noté de dégradation de l’activité après plus d’un an de stockage.
Un pool de sérum non surchargé a été traité de manière identique
pour la mesure de la limite de détection. Le facteur de calcul a
été déterminé à partir d’une solution de Kidrolase®
(dans NaCl 9 g/L + BSA 20 g/L) passée 20 jours de
suite. La valeur obtenue (tableau I) est proche de la valeur
théorique, et analogue à celle obtenue pour des enzymes à coenzyme
nicotinique dosées dans les mêmes conditions. Sérum ou plasma
hépariné peuvent être indifféremment utilisés pour les deux
méthodes.
Tableau I Programmation de l’Analyseur Hitachi
917.
|
Analyse
|
|
Code / Tps / Point
|
Cin.A/10/27-34
|
|
Longueur d’onde (2ème/princ.)
|
700/340
|
|
Volume échantillon (normal)
|
10,0 μL
|
|
Volume échantillon (réduit)
|
5,0 μL
|
|
Diluant
|
Eau
|
|
Réactif R1
|
125 μL
|
|
Réactif R2
|
75 μL
|
|
Réactif R3
|
100 μL
|
|
DO limite
|
6 000/Décroissante
|
|
Calibration
|
|
Type
|
Linéaire
|
|
Point
|
2
|
|
Point Span
|
2
|
|
Limite DS
|
0,1
|
|
Limite duplicat.
|
20 %-200 DO
|
|
Limites
|
|
Code application/unité
|
9**/μkat/L
|
|
Limites d’alerte
|
0-10
|
|
Concentration standards
|
|
Calibrateur 1 (code / valeur)
|
Eau/0,00
|
|
Facteur de calcul
|
9 300
|
Résultats
L’évaluation de la méthode enzymatique a été effectuée selon les
préconisations de la commission de validation de techniques de la
SFBC [11] à ceci près qu’elle s’est déroulée sur plus d’un an, au
fur et à mesure de l’inclusion des patients.
Évaluation du domaine de mesure
La limite de détection (mesures des blancs dans 30 séries),
dans les conditions normales de la programmation, s’élève à
0,036 μkat/L. La limite de quantification obtenue après dix
mesures de dilutions successives du contrôle le plus faible
s’établit à 0,057 μkat/L. La limite supérieure de linéarité
s’élève, elle, à 10 μkat/L. Pour les valeurs supérieures, une
prise d’essai deux fois moindre était effectuée automatiquement par
l’analyseur.
Évaluation de la précision
La répétabilité des deux méthodes a été mesurée en passant
20 fois de suite chacun des trois niveaux de contrôle, les
résultats sont rassemblés dans le tableau II( Tableau II ). La reproductibilité a été
évaluée avec les mêmes contrôles testés systématiquement avec
chaque série de patients. Les résultats obtenus par les deux
méthodes sont rassemblés dans le tableau III( Tableau III ).
Deux cent six échantillons provenant de 16 patients traités
par la Kidrolase® ont été testés simultanément par les
deux méthodes entre septembre 2002 et décembre 2003. Les résultats
de la comparaison sont présentés sur la ( figure 1 ). La droite
d’allométrie s’établit à y (méthode
enzymatique) = 1,038 x (méthode de Nessler) –
0,370 μkat/L, et le coefficient de corrélation
r = 0,992. Il faut noter que la moyenne des résultats
obtenus sur les prélèvements (P0) précédant la 1e
injection de Kidrolase® s’élève à 0,30 μkat/L pour
la méthode de Nessler alors qu’elle est effectivement de
0,00 μkat/L pour la méthode enzymatique.
Tableau II Étude de la répétabilité
(n = 20).
|
Contrôle bas
|
Contrôle moyen
|
Contrôle elevé
|
|
Méthode de nessler
|
|
Moyenne (μkat/L)
|
0,733
|
3,738
|
8,835
|
|
Écart type (μkat/L)
|
0,108
|
0,149
|
0,217
|
|
Coefficient de variation (%)
|
14,79
|
3,98
|
2,45
|
|
Méthode enzymatique
|
|
Moyenne (μkat/L)
|
0,325
|
3,405
|
7,926
|
|
Écart type (μkat/L)
|
0,010
|
0,020
|
0,048
|
|
Coefficient de variation (%)
|
3,13
|
0,59
|
0,61
|
Tableau III Étude de la reproductibilité
(n = 30).
|
Contrôle bas
|
Contrôle moyen
|
Contrôle elevé
|
|
Méthode de nessler
|
|
Moyenne (μkat/L)
|
0,651
|
3,808
|
8,625
|
|
Écart type (μkat/L)
|
0,219
|
0,317
|
0,548
|
|
Coefficient de variation (%)
|
33,64
|
8,33
|
6,35
|
|
Méthode enzymatique
|
|
Moyenne (μkat/L)
|
0,351
|
3,394
|
8,219
|
|
Écart type (μkat/L)
|
0,027
|
0,086
|
0,179
|
|
Coefficient de variation (%)
|
7,78
|
2,55
|
2,18
|
Interférence de l’ammonium endogène
Compte tenu du principe de la méthode de référence, la présence
d’une mmol/L d’ammonium dans l’échantillon correspond à une
surestimation de 0,37 μkat/L. Pour la méthode testée il n’a
pas été observé d’interférence de l’ammonium endogène, celui-ci
étant toujours éliminé avant l’addition du réactif de déclenchement
pour les taux observés. Ceux-ci s’élevaient respectivement à 250,
380, 470 et 560 μmol/L pour le pool de sérum utilisé pour
la détermination de la limite de détection et pour les trois
niveaux de contrôle. Ces résultats corroborent d’ailleurs
l’observation de Laterza et al. [12] selon laquelle le taux
ammonium plasmatique augmente chez les patients traités par la
L-asparaginase. Une alarme analyseur prévenait de tout risque
d’erreur par épuisement de substrat en cas d’activité enzymatique
très élevée.
Des plasmas lipémiques, hémolysés et ictériques ont été
surchargés avec de la L-asparaginase. Aucune interférence
analytique n’a été retrouvée jusqu’à des taux de 4 mmol/L de
triglycérides, 2 g/L d’hémoglobine et 600 μmol/L de
bilirubine.
Discussion
La méthode enzymatique est très aisée à mettre en œuvre,
l’adaptation du réactif commercial est particulièrement simple
puisqu’elle se limite à ajouter 280 mg de L-asparagine dans un
flacon de 15 mL du coffret. Ce dernier permet la réalisation
d’environ 100 dosages pour un coût unitaire en réactif
largement inférieur à 1€. De ce fait, le monitorage des patients
traités par la L-asparaginase peut parfaitement s’envisager en
temps réel, avec le dosage effectué en même temps que les autres
paramètres biochimiques de suivi de la chimiothérapie, sur le même
prélèvement. Le temps de réalisation est très inférieur à celui de
la méthode de Nessler dont la seule incubation nécessite
45 minutes, et la mesure en cinétique apporte spécificité et
qualité. Les performances du dosage enzymatique sont en effet
largement supérieures tant en précision qu’en exactitude,
particulièrement pour les valeurs faibles où la méthode chimique
montre ses limites, même si cela n’a pas d’impact réel sur
l’attitude thérapeutique, du moins dans l’état actuel de nos
connaissances. Les patients avant traitement présentent en moyenne
une activité L-asparaginase apparente d’environ 0,30 μkat/L
avec la méthode de Nessler, il en va de même pour des patients non
traités, et l’on retrouve cet écart au niveau des résultats des
sérums de contrôle ainsi que comme erreur constante retrouvée dans
l’équation de la droite d’allométrie. En dehors de ce léger biais,
la comparaison entre les deux méthodes s’avère excellente, avec une
faible dispersion comme le montre la ( figure 1 ), un très bon
coefficient de corrélation, et les résultats sont tout à fait
transférables.
On remarque une répartition des valeurs observées sur une très
grande plage puisque dépassant 25 μkat/L alors que la
déplétion en L-asparagine semble être obtenue avant même
d’atteindre 1,70 μkat/L selon Tsurusawa et al. [13].
Cette dernière étude utilisait d’ailleurs une méthode enzymatique
sur microplaque plus complexe de réalisation mais aux performances
analogues pour le dosage de la L-asparaginase. La grande dispersion
des résultats reflète l’extrême variabilité des paramètres
pharmacocinétiques de la L-asparaginase d’un patient à l’autre,
alors que les doses administrées sont parfaitement standardisées
dans le cadre du protocole Fralle 2000. On voit donc tout l’intérêt
qu’il peut y avoir à effectuer un monitorage en temps réel pour
envisager de moduler les doses à administrer de manière à espérer
une diminution des effets secondaires [4, 14] tout en conservant
l’efficacité thérapeutique.
Nous disposons donc là d’une méthode fiable, précise et facile à
mettre en œuvre sur différents automates de biochimie mais aussi
manuellement sur n’importe quel spectrophotomètre. Le dosage de
L-asparaginase peut donc être réalisé avec les autres paramètres de
biochimie prescrits dans le suivi des chimiothérapies avec comme
objectif à venir une meilleure prise en charge thérapeutique.
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