Mise en place d’une stratégie de suivi de la maladie résiduelle chez les enfants atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques pré‐B

ARTICLE

Auteur(s) : B. Bonjean, L. Grollet, E. Visentin, F. Sigaux, J.-M. Cayuela

Laboratoire central d’hématologie, Hôpital Saint-Louis, Paris 
jm.cayuela@chu-stlouis.fr

Article reçu le 22 septembre 2003, accepté le 8 mars 2004

Plusieurs études ont montré le rôle pronostique puissant et indépendant de la quantification de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) pédiatriques. En particulier, il a été montré que la persistance dans la moelle d’un taux de blastes résiduels supérieur à 1 % des cellules mononucléées en fin d’induction est associée à un risque très élevé de rechute précoce [1].

Cette étude porte sur les LAL pré-B de l’enfant, traitées selon le protocole Fralle. Pour le diagnostic de ces hémopathies et le suivi de la maladie résiduelle, les réarrangements des chaînes lourdes des immunoglobulines (IgH) ou du récepteur T (TCR) ont été étudiés. Ces réarrangements distinguent les cellules tumorales des cellules normales dans plus de 90 % des cas [2]. Du fait de sa grande sensibilité, la PCR est la technique de choix pour l’analyse de ces marqueurs de clonalité.

La technique de PCR en temps réel est basée sur la mesure de la cinétique d’apparition du produit au fur et à mesure des cycles thermiques. Pour cela, une sonde fluorescente complémentaire du produit d’amplification est ajoutée à la réaction d’amplification. La vitesse d’apparition du produit est alors proportionnelle au logarithme du nombre de cibles présentes dans l’échantillon analysé. La méthode de quantification de la maladie résiduelle par PCR en temps réel mise au point au laboratoire, s’appuie sur le modèle décrit par Donovan et al. [3]. Ce système utilise une amorce et une sonde TaqMan^® situées sur les régions constantes des segments V et une amorce allèle spécifique (ASO) complémentaire de la région jonctionnelle des réarrangements V(D)J (figure 1). Le clivage de la sonde obtenu grâce à l’activité 5’ → 3’ exonucléasique de la Taq polymérase produit un signal fluorescent. La mesure de la fluorescence, proportionnelle à la quantité d’amplicons générés à chaque cycle de PCR, permet la quantification du nombre de cibles initiales dans l’échantillon.

Matériels et méthodes

Patients et échantillons

Notre étude porte sur 86 enfants (49 garçons et 37 filles) atteints de LAL B inclus dans le protocole Fralle. Ce protocole a reçu un avis favorable du comité consultatif de protection des personnes participant à une recherche biomédicale (CCPPRB). L’âge médian est de 5,1 ans (1,4 à 19,8 ans). Les cellules mononucléées du sang (CMS) ou de la moelle sont obtenues après Ficoll sur les prélèvements effectués au diagnostic et en fin d’induction (j35-j42). La blastose est évaluée par cytomorphologie pour tout échantillon. Les cellules sont réparties en ampoules dans un mélange de sérum de veau fétal (90 %) et de diméthylsulfoxyde (10 %) et/ou en culots secs avant congélation à – 80 °C. Après lyse cellulaire à la protéinase K, l’ADN est extrait au phénol-chloroforme, précipité à l’isopropanol et conservé à + 4 °C. Les échantillons sont dosés au fluorimètre Hoefer^® DyNA Quant^® 200 (Pharmacia Biotech) et dilués à 200 ng/µL.

Identification des marqueurs au diagnostic

L’amplification des réarrangements des gènes IgH (FR1/FR2/FR3) et TCRδ(Vδ2/Dδ3) repose sur l’utilisation d’une amorce spécifique d’un segment (ou d’une famille de segments) V et d’une amorce spécifique d’un segment (ou d’une famille de segments) D ou J. Le marquage au fluorophore Cy5 (indocarbocyanine) d’une de ces amorces permet l’analyse des produits de PCR sur séquenceur automatique ALFexpress DNA Sequencer (Pharmacia Biotech). Les PCR sont réalisées sur un appareil Biometra Tgradient (Biometra). Le logiciel Fragment Manager^TM version1.2 permet de visualiser les amplicons sous forme de pics d’intensité de fluorescence. Un fragment amplifié de taille homogène donne un pic unique situé entre 70 et 150 pb pour les FR3, 200 et 350 pb pour les FR2, 250 et 400 pb pour les FR1 et enfin 170 et 220 pb pour les Vδ2/Dδ3.

Quantification de la maladie résiduelle par PCR en temps réel

Les PCR sont réalisées dans 25 µL avec 670 ng d’ADN ; 12,5 µL TaqMan^® Universal PCR Master Mix 2X (ref 4304437, Applied Biosystems, Courtabeuf, France) comprenant le tampon (TaqMan buffer a 1X), les dNTP (dATP, dCTP, dGTP à 200 µM, dUTP à 400 µM), le MgCl2 (5 mM), l’AmpErase UNG (uracil N-glycosylase à 0,01 UI/µL) et l’AmpliTaq Gold (0,05 UI/µL) ; 100 nM de sonde TaqMan et 800 nM d’amorces (tableau I) pour les réarrangements IgH ; 300 nM de sonde TaqMan et 1 200 nM d’amorces (tableau I) pour les systèmes Vδ2Dδ3.

Tableau I. Amorces et sondes TaqMan^® utilisées au laboratoire.

La quantification des points de suivi est obtenue grâce à une gamme de dilutions (10^–1 à 10^–5) de l’ADN diagnostique dans un pool de CMS normales provenant de donneurs de plaquettes. Le gène de l’albumine est utilisé pour tester la qualité des ADN étudiés et pour normaliser les résultats. La PCR est effectuée sur 670 ng des ADN diagnostiques, de suivi et du pool de CMS dans 12,5 µL TaqMan^® Universal PCR Master Mix 2X, 100 nM de sonde TaqMan et 200 nM d’amorces (tableau I) qsp 25 µL. L’amplification comprend une étape de traitement par l’UNG (2 min à 50 °C) puis une étape de dénaturation préliminaire et d’activation de la polymérase (10 min à 95 °C), suivie de 50 cycles d’amplification (15 sec à 95 °C, 1 min à 60 °C). L’amplification et l’enregistrement en temps réel des données sont réalisés sur un appareil Abiprism^® 7700 (Applied Biosystems). L’analyse des données est réalisée avec le logiciel Sequence Detector (Applied Biosystems).
L’analyse quantitative est obtenue par amplification génique IgH/TCRδ et albumine, extrapolation des valeurs des échantillons à l’aide des courbes étalons respectives et normalisation du nombre de copies de génome IgH/TCRδ en fonction du nombre de cellules analysées.

Résultats

Mise au point de la quantification de la maladie résiduelle par PCR en temps réel

Pour chaque marqueur identifié au diagnostic, le produit de PCR correspondant est envoyé à séquencer. Les segments V, D et J impliqués dans le réarrangement sont déterminés sur la séquence grâce à une base de données (www.ncbi.nlm.nih.gov.). En fonction du VH identifié, l’amorce et la sonde adéquates sont choisies dans le système de Donovan. La position de l’ASO est définie à l’aide du logiciel Oligo 4.0-s (Natl. Biosc.inc.). Un premier test vérifie la bonne hybridation des amorces et de la sonde et un deuxième permet la quantification des points de suivi par rapport à la gamme de dilutions. La spécificité étudiée sur le pool de CMS et le dosage génique de l’albumine sont évalués dans chacun de ces tests (figure 2).

Optimisation de la PCR en temps réel

Des tests préliminaires ont été réalisés pour déterminer les conditions optimales concernant les quantités d’amorces, de sonde et d’ADN à ajouter dans le mélange réactionnel, le diluant de la gamme, les étapes du cycle d’amplification et la température d’hybridation des amorces. Notre expérience nous a également permis de conclure que l’ASO ne devait pas empiéter de plus de cinq bases sur le segment VH pour réduire au maximum l’hybridation non spécifique. D’autre part, nous avons configuré chez certains patients pour lesquels l’approche consensuelle de Donovan n’était pas satisfaisante, des amorces et sondes « spécifiques patient » donnant de très bons résultats.

Validation analytique de la technique de quantification

Des critères ont été définis pour déterminer le domaine de linéarité, la sensibilité et la spécificité de la méthode. Ces critères coïncident en grande partie avec ceux proposés par l’European study group on MRD detection in ALL (ESG-MRD-ALL) lors du congrès de Rosendaal en octobre 2002. L’étude de la reproductibilité a montré qu’un écart de ± 20 % en nombre de copies pouvait être toléré. La précision de la mesure n’est satisfaisante qu’à partir de 100 copies et s’améliore sensiblement dès 1 000 copies.

Validation biologique

Elle repose sur la concordance entre le résultat de maladie résiduelle et les autres paramètres d’évaluation de la réponse au traitement (corticosensibilité sur frottis sanguin à j8 et chimiosensibilité sur la moelle de j21). Les résultats sont également mis en regard des facteurs diagnostiques de mauvais pronostic (âge, leucocytose, caryotype...).

Étude des patients

L’applicabilité de la méthode est de 66 % (57/86) (tableau II). Cinquante allèles IgH et 22 allèles Vδ2Dδ3 ont été étudiés. Une sensibilité à 10^–4 a été obtenue dans 72 % des cas pour les allèles IgH et dans 54,5 % des cas pour les Vδ2Dδ3. La maladie résiduelle à j35 a été détectée chez 27 patients (47 %) dont 6 à un taux supérieur à 1 %. Parmi les 30 patients sans maladie résiduelle détectable, le seuil de détection de la technique est de 10^–3, 10^–4 et 10^–5 dans 5, 18 et 7 cas respectivement.

Tableau II. Étude des patients par PCR en temps réel.

Résultats comparatifs PCR compétitive/PCR en temps réel

Les deux méthodes ont rapporté 17 cas de maladie résiduelle positive (32 %) et 27 (51 %) de maladie résiduelle indétectable. Neuf patients (17 %) sont positifs uniquement en PCR en temps réel ce qui nous permet de dire que cette technique est plus sensible que la PCR compétitive. La spécificité de la PCR en temps réel est également supérieure car elle utilise une amorce allèle spécifique et une sonde famille spécifique versus des amorces consensus pour la compétition.

Discussion

La PCR en temps réel permet une quantification précise de la cible pendant la phase exponentielle de la réaction d’amplification et présente plusieurs atouts par rapport aux méthodes en point final [4, 5]. L’absence de manipulation post-amplification réduit le risque de contamination, diminue le temps d’analyse et garantit la sécurité du personnel. La qualité de l’amplification est appréciée par l’allure de la courbe et la mise en forme des résultats est facilitée par l’utilisation de logiciels. Enfin, le gain en sensibilité et en spécificité par rapport à la PCR compétitive est manifeste. Toutefois, cette technique est relativement lourde et coûteuse. L’évolution clonale des marqueurs au cours de la maladie pouvant être responsable de faux négatifs [6], l’utilisation de plusieurs marqueurs est recommandée, ce qui alourdit encore l’analyse. Des problèmes rencontrés à différentes étapes de l’analyse ont restreint le nombre de patients quantifiables (taux d’échec de 23 % soit 25/86 patients) (tableau II). En effet, certains patients n’ont pu être évalués par épuisement des prélèvements lors de l’analyse par PCR compétitive. Afin d’obtenir suffisamment de matériel, une réforme de la technique de prélèvement peut s’avérer nécessaire. Travailler sur du sang plutôt que sur la moelle permettrait de récupérer plus d’ADN et apporterait plus de confort aux patients. Toutefois, une étude préliminaire de Brisco et al. [7] montre que les techniques de quantification de la maladie résiduelle doivent être au moins 10 fois plus sensibles (≤ 10^–5) lors du suivi sur prélèvement sanguin. D’autre part, l’absence de marqueurs au diagnostic (6,3 % des cas) pose la question de l’efficacité de nos méthodes de détection et invite au développement de nouveaux systèmes. Enfin, les échecs de séquençage (n = 6) nous ont amenés à perfectionner les étapes de séparation et de purification des produits de PCR.
Dans l’étude de la maladie résiduelle, plusieurs modèles de PCR en temps réel allèle spécifique ont été décrits et diffèrent en fonction de la nature de l’ASO. Initialement, les systèmes utilisaient la sonde comme oligonucléotide spécifique de la jonction [8]. Les performances analytiques ont nettement été améliorées grâce à la stratégie utilisant non plus une sonde mais une amorce spécifique de la région jonctionnelle [9]. Dans notre étude, nous avons jugé qu’un système était valable pour une sensibilité d’au moins 10^–3. Cela a été observé chez 87,7 % (50/57) des patients ce qui paraît tout à fait satisfaisant.
Globalement, si la lourdeur de la technique est réelle, l’amortissement est en partie assuré par la possibilité d’analyser un grand nombre de points de suivi. De plus, le délai d’analyse raccourci permet une meilleure compatibilité avec la prise en charge du patient.

Conclusion

La PCR en temps réel allèle spécifique est plus sensible et plus spécifique que la PCR compétitive. Nous proposons que cette technique soit utilisée en première intention dans l’évaluation de la maladie résiduelle dans les LAL pré-B de l’enfant. La stratégie présentée (figure 3). semble adaptée au suivi de la maladie résiduelle. Afin d’augmenter l’applicabilité de la méthode, plusieurs systèmes de quantification reposant sur les réarrangements au locus Kappa, les autres réarrangements du TCRδ, certains réarrangements préférentiels du TCRβ et du TCRα sont actuellement à l’étude. En cas d’échec ou en présence de profils oligoclonaux, on aura recours à la quantification par PCR compétitive.

Références

1. Cave H, van der Werff Ten Bosch BJ, Suciu S, et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. European organization for research and treatment of Cancer-Childhood-Leukemia Cooperative Group. N Engl J Med 1998 ; 339 : 591-8.

2. Langerak AW, Wolvers-Teterro ILM, van Dongen JJM. Immunoglobulin and T-cell receptor gene analysis in the diagnosis of lymphoid malignancies. Rev Clin Exp Hematol 1997 ; 3 : 3-27.

3. Donovan JW, Ladetto M, Zou G, et al. Immunoglobulin heavy-chain consensus probes for real-time PCR quantification of residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000 ; 95 : 2651-8.

4. D’Auriol L, Sigaux F. The detection of minimal residual disease (MRD) in acute lymphoblastic leukemia using clone-specific probes directed against V(D)J junctional sequences. In : Mullis K, Ferre F, Gibbs R, eds. The polymerase chain reaction. Boston : Birkhauser, 1994.

5. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques 1992 ; 13 : 444-9.

6. Baruchel A, Cayuela JM, Macintyre E, Berger R, Sigaux F. Assessment of clonal evolution at Ig/TCR loci in acute lymphoblastic leukaemia by stringle-strand conformation polymorphism studies and highly resolutive PCR derived methods : implication for a general strategy of minimal residual disease detection. Br J Haematol 1995 ; 90 : 85-93.

7. Brisco MJ, Sykes PJ, Hughes E, et al. Monitoring minimal residual disease in peripheral blood in B-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol 1997 ; 99 : 314-9.

8. Pongers-Willemse MJ, Verhagen OJ, Tibbe GJ, et al. Real-time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia using junctional region specific TaqMan probes. Leukemia 1998 ; 12 : 2006-14.

9. Verhagen OJ, Willemse MJ, Breunis WB, et al. Application of germline IGH probes in real-time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2000 ; 14 : 1426-35.