ARTICLE
Auteur(s) : E. Plantin-Carrenard1, F.
Cattan1, A. Aurengo2, B. Dumérat1,
M.-J. Foglietti1, J.-L. Beaudeux1
1 Service de biochimie C,
2 Service de médecine nucléaire, Groupe hospitalier
Pitié-Salpêtrière, 47-83 boulevard de l’Hôpital,
75013 Paris
emmanuelle.plantin-carrenard@psl.ap-hop-paris.fr
Article reçu le 11 août 2003, accepté le 28 avril
2004
L’iode joue un rôle central dans la physiologie de la thyroïde,
comme constituant essentiel des hormones thyroïdiennes et
régulateur des fonctions de cette glande [1, 2]. Les études
épidémiologiques indiquent qu’actuellement un état de carence
existe dans certaines régions de la France [3]. Du fait de son
retentissement sur le développement neurologique, ce déficit est
particulièrement préjudiciable pour le fœtus et le nouveau-né.
L’élaboration d’un plan sanitaire visant à réduire le déficit en
iode dans la population française par les instances nationales de
Santé publique est en cours [4]. Des apports excessifs de cet
élément sont également responsables de dysthyroïdies d’expression
clinique parfois majeure [2]. Les hyperthyroïdies surviennent chez
environ 10 % des patients après un apport excessif en iode
[5]. Elle peut être soit révélatrice d’un état préthyrotoxique
méconnu soit induite par une surcharge iodée sur une thyroïde saine
ou pathologique [5]. Les hypothyroïdies induites par l’iode sont
plus fréquentes mais moins connues du fait de leur meilleure
tolérance et de leurs effets transitoires [6]. Cependant, dans
certains cas, une absence d’information sur les traitements
médicamenteux peut conduire à retarder le diagnostic et à conduire
à des prescriptions inutiles.
Des apports inadaptés en iode peuvent être décelés par la mesure
de l’iodurie [1, 6]. Le dosage de l’iode urinaire repose
généralement sur l’effet catalytique des iodures au cours de la
réaction de réduction des ions Ce(IV) par les ions As(III) [7]. Une
étape de minéralisation préalable est indispensable pour assurer la
destruction de la matrice organique et des substances interférentes
[8]. Ces techniques quantitatives sont de mise en œuvre délicate et
leur automatisation nécessite un matériel spécifique et coûteux, ce
qui implique la réalisation du dosage dans des laboratoires
spécialisés. Ces techniques sont également mal adaptées à un rendu
rapide des résultats. Dans certains cas (recherche d’étiologie,
suivi après retrait de la source incriminée), une appréciation
semi-quantitative de l’iodurie peut être suffisante pour apprécier
le statut iodé d’un sujet. Très récemment, une telle méthode
semi-quantitative a été décrite. Le principe est basée sur
l’utilisation d’un indicateur redox : la ferroïne
(phénanthroline en solution de sels de fer), associée à la
minéralisation douce de l’échantillon biologique par le persulfate
d’ammonium [9, 10]. Cette méthode, décrite dans une note technique,
est semblable à la mise au point récente faite dans notre
laboratoire. Ce travail a pour objectif de compléter la description
méthodologique de cette publication par l’expérience de notre
propre mise au point et des caractéristiques méthodologiques que
nous avons retenues pour sa mise en œuvre au laboratoire.
Matériel et méthodes
Réactifs
Les solutions d’acide sulfurique (H2SO4) à
95-97 %, d’acide nitrique (HNO3) à 65 %,
d’acide perchlorique (HClO4) à 70-72 %, l’hydroxyde
de sodium (NaOH) en pastilles, le chlorure de sodium (NaCl) et
l’iodate de potassium (KIO3) proviennent de VWR
International (Fontenay-sous-Bois, France). Le persulfate
d’ammonium ((NH4)2S2O8), le
sulfate d’ammonium cérique hydraté (Ce(NH4)4
(SO4)4, 4 H2O), le trioxyde
d’arsenic (AsO3), la solution aqueuse de ferroïne et le
thiocyanate de potassium (KSCN) sont de Sigma-Aldrich Chimie (Saint
Quentin Fallavier, France). La préparation des réactifs et les
procédures de dilution ont été réalisées avec de l’eau bidistillée
(Aguettant, Lyon, France).
Préparation des réactifs
La solution de persulfate d’ammonium (1 mol/L) a été
préparée par dissolution de 22,8 g dans 100 mL d’eau
bidistillée juste avant la minéralisation des échantillons.
La solution d’arsenic (25,3 mmol/L) a été obtenue après
dissolution de 2,45 g de AsO3 et de 3,5 g de
NaOH dans 25 mL d’eau bidistillée. Après dissolution,
375 mL d’eau bidistillée et 2 gouttes (environ
50 µL) de phénolphtaléine ont été ajoutés. Après virage de
l’indicateur coloré par addition d’une solution de
H2SO4 à 95-97 % (environ 16 mL),
12,5 g de NaCl ont été ajoutés à la solution. Après
dissolution complète, le volume du réactif a été ajusté à
500 mL avec de l’eau bidistillée.
La solution de sulfate d’ammonium cérique (15,8 mmol/L) a été
préparée par dissolution de 886 mg de
Ce(NH4)4 (SO4)4, dans
une solution de H2SO4 à 1,25 mol/L pour
un volume final de 100 mL.
Préparation des solutions de calibration
La solution mère A à 1 g/L (7,9 µmol/L) a été préparée
par dissolution de 843 mg de KIO3 dans un volume
final de 500 mL. La solution peut être conservée 2 mois
à + 4 °C. Une solution mère B à 10 mg/L
(0,079 µmol/L) a été obtenue par dilution de la solution mère
A dans de l’eau bidistillée. Sa conservation maximale est de
2 mois à + 4 °C.
Les solutions de travail ont été obtenues à partir de la solution
mère B, afin d’obtenir des concentrations finales à 50, 100 et
300 µg/L (0,40 - 0,79 - 2,36 µmol/L). Les
solutions de travail ont été conservées au maximum 4 semaines
à + 4 °C.
Préparation des échantillons urinaires
Les échantillons urinaires provenaient de mictions ou d’urines
de 24 heures de 120 sujets (statut thyroïdien non
précisé) consultant dans le service de médecine nucléaire du groupe
hospitalier Pitié-Salpêtrière. Après homogénéisation, les
échantillons ont été centrifugés 10 min à 2 500 g
avant dosage. Les échantillons ont été conservés au maximum
7 jours à + 4 °C ou 3 mois à -
20 °C.
Contrôle de qualité
Le contrôle de qualité utilisé était le Lyphocheck®
Quantitative Urine Control Abnormal Level II (Biorad). En absence
de détermination de la valeur de l’iodurie par le fabricant,
celle-ci a été préalablement mesurée quantitativement sur
Autoanalyser II® Technicon. La concentration d’iodures
mesurée était de 110 µg/L (0,869 µmol/L) avec un
coefficient de variation intrasériel inférieur à 5 %
(n = 10) et intersériel inférieur à 5 %
(n = 30).
Détermination semi-quantitative
Pour la minéralisation, 200 µL de calibrant, échantillon
urinaire ou contrôle ont été distribués dans des tubes en verre de
qualité Pyrex® (dimension 13 x 100 mm) et à
bouchon à vis avec joint. Après addition de 1 mL de persulfate
d’ammonium à 1 mol/L, les tubes ont été agités puis placés
90 min à 95 °C dans un bloc chauffant Hycel Thermal
Block® (Hycel Inc., Houston Texas). Après incubation,
les tubes ont été refroidis sous un jet d’eau froide ou maintenus
1 heure à + 4 °C. Après homogénéisation, 1 mL
d’une solution de AsO3 à 25,3 mmol/L, 1 mL
d’une solution de H2SO4 à 10 M et
100 µL d’une solution aqueuse de ferroïne ont été ajoutés
successivement à chaque tube. Après agitation, le milieu
réactionnel devient rouge en présence de la ferroïne. L’addition de
200 µL d’une solution de sulfate ammoniacal cérique à
15,8 mmol/L dans tous les tubes, et de manière très rapide
(< 20 s par série), conduit à une coloration bleue du
milieu réactionnel. Les tubes sont agités fortement dans un délai
très court : le décompte du temps de développement de la
réaction est déclenché. Il est arrêté lorsque la couleur du milieu
réactionnel vire du bleu au violet. Les temps obtenus avec les
échantillons urinaires sont comparés à ceux obtenus avec les
calibrants. Les valeurs de ces derniers définissent les intervalles
de concentrations au sein desquels les échantillons sont classés en
fonction de leur propre temps de virage.
Interférences analytiques
La principale interférence analytique observée avec la réaction
colorimétrique de Sandell et Kolthoff concerne les thiocyanates, en
raison de leur fréquence d’apport parfois importante dans
l’alimentation et au cours du tabagisme actif.
Pour évaluer l’influence des thiocyanates sur la méthode
semi-quantitative, un échantillon urinaire a été surchargé avant la
minéralisation, par une solution de thiocyanate de potassium
conduisant à une concentration finale en thiocyanates comprise
entre 36 et 1 000 µmol/L. L’iodurie de l’échantillon a
été préalablement dosée à 156 µg/L (1,23 µmol/L).
Afin d’apprécier l’influence des thiocyanates provenant du
métabolisme de l’acide cyanhydrique présent dans la fumée de
cigarette, la détermination semi-quantitative de l’iodurie a été
réalisée sur des urines de fumeurs de cigarettes
(n = 15), dont la concentration urinaire de thiocyanates
préalablement dosée était comprise entre 250 et 500 µmol/L
[11].
Définition des intervalles de concentration d’iodures
urinaires
Essentiellement utilisée dans un contexte épidémiologique,
l’iodurie est plus fréquemment exprimée en µg/L qu’en unités du
système international (µmol/L). Dans ce travail, les deux unités
ont été représentées (facteur de conversion
1 µg/L = 0,0079 µmol/L).
Les intervalles de valeurs d’iodurie utilisées dans ce travail
proviennent des recommandations de l’Organisation mondiale de la
santé [10, 12]. Un apport normal et régulier en iode (et en absence
de pathologie thyroïdienne) conduit à une valeur d’iodurie comprise
dans l’intervalle de concentration de [100-300 µg/L]
([0,79-2,36 µmol/L]). Les carences modérées et légères, et les
surcharges sont définies pour les intervalles de concentration
respectifs : [ < 50 µg/L]
([ < 0,4 µmol/L]), [50-100 µg/L]
([0,4-0,79 µmol/L]), et [ > 300 µg/L]
([ > 2,36 µmol/L]).
Détermination de la sensibilité et de la spécificité de la
méthode semi-quantitative
La sensibilité (Se) et la spécificité (Sp) de la méthode
semi-quantitative à discriminer des valeurs normales, des états de
carence (< 100 µg/L
ou < 0,79 µmol/L) ou de surcharge (valeur
d’iodurie > 300 µg/L
ou > 2,36 µmol/L), ont été calculées selon les
formules : Se = vrais positifs / (vrais
positifs + faux négatifs) et Sp = vrais
négatifs / (vrais négatifs + faux positifs).
Les critères définis pour cette étude sont regroupés dans le tableau Ia.
Tableau I. Dépistage des états de
carence légère à modérée et surcharge en iode par la détermination
semi-quantitative de l’iode urinaire.
|
a. Définition des critères
|
|
Résultats par la méthode
quantitative |
Résultats par la méthode
semi-quantitative |
| Vrai positif |
VP |
|
|
| carence |
< 100 µg/L |
< 100 µg/L |
| surcharge |
> 300 µg/L |
> 300 µg/L |
| Vrai
négatif |
VN |
100-300 µg/L |
100-300 µg/L |
| Faux positifs |
FP |
|
|
| carence |
100-300 µg/L |
< 100 µg/L |
| surcharge |
100-300 µg/L |
> 300 µg/L |
| Faux négatifs |
FN |
|
|
| carence |
< 100 µg/L |
100-300 µg/L ou > 300 µg/L |
| surcharge |
> 300 µg/L |
< 100 µg/L ou 100-300 µg/L |
|
|
Semi-quantitatif |
Carence |
Apport suffisant |
Surcharge |
|
Quantitatif |
|
|
|
|
|
Carence |
|
VP = 50 |
FN = 5 |
FN = 0 |
|
Apport suffisant |
|
FP = 2 |
VN = 27 |
FP = 0 |
|
Surcharge |
|
FN = 0 |
FN = 0 |
VP = 36 |
L’iodurie des échantillons urinaires (n = 120) a été
déterminée quantitativement par l’Autoanalyser ®Technicon
puis semi-quantitativement avec la méthode utilisant l’indicateur
d’oxydo-réduction la ferroïne. En cas d’apport suffisant en iode,
l’iodurie est comprise entre 100 et 300 µg/L (0,79 et
2,36 µmol/L). Une carence légère à modérée en iode est définie
pour une iodurie < 100 µg/L (0,79 µmol/L) et
une surcharge pour une iodurie > 300 µg/L
(2,36 µmol/L).
Dosage quantitatif par la méthode de Sandell et
Kolthoff
Le dosage colorimétrique sur l’appareil Autoanalyser
II® Technicon (Technicon Insrument Corp., Tarrytown, NY)
comprend une minéralisation préalable des échantillons urinaires en
milieu acide (mélange acide sulfurique / acide nitrique / acide
perchlorique) à environ 360 °C. Le développement de la
réaction colorée se fait à 56 °C sous agitation continue, et
la lecture de la variation d’absorbance en continu à 410 nm
[13].
Résultats
Optimisation et standardisation des conditions
opératoires
Afin d’optimiser et de standardiser le dosage, les conditions de
température et de durée de minéralisation ont été l’objet de
travaux préliminaires. L’influence de la durée de minéralisation a
été étudiée sur quatre échantillons urinaires dont la valeur
d’iodurie a été préalablement déterminée sur
Autoanalyser® II Technicon. Nos résultats ont montré
qu’une minéralisation de 60 min sous-estime l’iodurie pour
deux des quatre échantillons urinaires par rapport à une
minéralisation de 90 min (tableau II).
Tableau II. Influence de la
durée de minéralisation sur la détermination semi-quantitative de
la concentration urinaire.
|
Dosage quantitatif |
Méthode semi-quantitative |
| Temps de minéralisation |
|
60 min |
90 min |
| U 1 |
146 µg/L |
[100-300 µg/L] |
[100-300 µg/L] |
| U 2 |
104 µg/L |
[50-100 µg/L] |
[100-300 µg/L] |
| U 3 |
120 µg/L |
[50-100 µg/L] |
[100-300 µg/L] |
| U 4 |
258 µg/L |
[100-300 µg/L] |
[100-300 µg/L] |
Les échantillons urinaires (200 µL) ont été dilués dans une
solution de persulfate d’ammonium à 1 mol/L
(1 000 µL) puis minéralisés à 95 °C pendant 60 et
90 min. Les intervalles de concentration ont été calculés à
partir des temps de virage de l’indicateur d’oxydation réduction
des échantillons et en comparaison avec le temps de virage des
calibrants. Les résultats discordants sont indiqués en
italique.
Pour l’étude de l’influence de la température, les tubes ont été
refroidis après minéralisation soit sous jet d’eau froide soit par
maintien à + 4 °C pendant 1 h. Ainsi, avant
dosage, la température du milieu réactionnel était soit de
45 °C, soit de 4 °C. L’abaissement de la température à
4 °C entraîne une augmentation du temps d’apparition du
virage, surtout pour des ioduries inférieures à 100 µg/L
(0,79 µmol/L) (figure 1a).
Le persulfate d’ammonium est un oxydant doux instable en milieu
aqueux. Nous avons étudié l’influence d’une conservation limitée
dans le temps de la solution de persulfate d’ammonium sur la courbe
d’étalonnage de la détermination semi-quantitative. La solution de
persulfate d’ammonium a été préparée soit extemporanément soit
60 min avant la minéralisation. Le vieillissement de la
solution a conduit à un sus-décalage de la courbe pouvant induire
une erreur d’interprétation des résultats avec un risque de
sur-estimation des valeurs surtout dans la zone proche de
100 µg/L (0,79 µmol/L) (figure 1b).
Il nous est apparu nécessaire de standardiser la lecture du
virage. L’homogéinisation du milieu réactionnel a été obtenue par
agitation juste après l’ajout de la solution de sulfate cérique
ammoniacal. Comme il peut être observé avec d’autres indicateurs
colorés, le virage débute à un point du tube pour s’étendre à
l’ensemble du milieu réactionnel. Une agitation du tube en cours de
développement de la coloration peut modifier la vitesse
d’apparition du virage complet. Pour limiter les facteurs
aléatoires et dépendants de l’opérateur et améliorer les
performances analytiques de la méthode, nous avons choisi de ne pas
agiter les tubes en cours de développement de la coloration
violette. L’arrêt du chronomètre a ainsi été effectué lorsque
l’ensemble du milieu réactionnel était violet.
Les conditions opératoires retenues ont donc été finalement les
suivantes : une minéralisation à 95 °C pendant
90 min en présence d’une solution de persulfate d’ammonium
préparée extemporanément, suivie d’un refroidissement
à + 4 °C. La figure 2 témoigne de la
régularité des courbes obtenues à partir des temps de lecture, en
utilisant ces conditions opératoires.
Répétabilité et reproductibilité
La répétabilité (n = 10) a été établie à partir de
trois échantillons urinaires ayant une iodurie de 36 µg/L
(0,28 µmol/L), 156 µg/L (1,23 µmol/L) et
408 µg/L (3,22 µmol/L). Toutes les déterminations de la
valeur d’iodurie ont été lues dans les intervalles de concentration
correspondants.
La reproductibilité a été établie sur 20 jours avec le
contrôle Lyphocheck®. La valeur de l’iodurie était de
110 µg/L (0,87 µmol/L). Le contrôle urinaire a été lu
pour 19 mesures dans l’intervalle de concentration
[100-300 µl/L] [0,79-2,36 µmol/L], et 1 dans l’intervalle
[50-100 µg/L] [0,40-0,79 µmol/L].
Interférences avec les thiocyanates
La présence de thiocyanates jusqu’à une concentration de
1 000 µmol/L n’interfère pas dans la détermination de
l’iodurie par la méthode semi-quantitative. De plus, aucune
discordance n’a été observée sur les 15 urines des fumeurs
analysées indiquant une absence d’interférence par les thiocyanates
urinaires. Ces résultats sont en accord avec la littérature pour
une méthode cérimétrique couplée à une minéralisation par le
persulfate d’ammonium [8, 10].
Comparaison avec la méthode quantitative
L’iodurie des 120 échantillons a été évaluée par la méthode
semi-quantitative puis dosée par l’Autoanalyseur® II
Technicon. Cent neuf échantillons (91 %) ont été lus dans les
intervalles de concentration correspondants à la valeur déterminée
par la méthode quantitative (tableau III). Aucune erreur de classement
des échantillons n’est observée dans le cas de dépistage d’une
surcharge en iode.
Tableau III. Récapitulatif des
résultats obtenus par la méthode semi-quantitative.
|
|
Carence modérée
< 50 µg/L
< 0,40 µmol/L |
Carence légère
50-100 µg/L
0,40-0,79 µmol/L |
Apport adéquat
100-300 µg/L
0,79-2,36 µmol/L |
Surcharge
> 300 µg/L
> 2,36 µmol/L |
|
Bien classés |
n = 25 |
n = 21 |
n = 27 |
n = 36 |
| Mal
classés |
n = 3(1) |
n = 2(2) |
n = 5(4) |
n = 0 |
|
|
|
n = 1(3) |
|
|
L’iodurie de 120 échantillons urinaires a été dosée
quantitativement sur l’AutoAnalyseur® II Technicon, et
déterminée semi-quantitativement par la méthode utilisant
l’indicateur d’oxydo-réduction, la ferroïne. En cas d’apport
suffisant en iode, l’iodurie est comprise entre 100 et
300 µg/L (0,79 et 2,36 µmol/L). Les états de carence
légère ou modérée en iode sont définis pour une iodurie de
50-100 µg/L (0,40-0,79 µmol/L)
et < 50 µg/L (0,40 µmol/L)
respectivement ; une surcharge pour une
iodurie > 300 µg/L (2,36 µmol/L). Les
résultats sont classés en considérant le dosage quantitatif comme
référent.
1) 3 échantillons urinaires dosés à 80, 64 et
86 µg (0,63-0,51 et 0,68 µmol/L) et classés
< 50 µg/L (< 0,40 µmol/L) ;
2) 2 échantillons urinaires dosés à 125 et
132 µg (0,99 et 104 µmol/L) et classés en
50-100 µg/L (0,40-0,79 µmol/L) ; 3)
1 échantillon urinaire dosé à 36 µg (0,28 µmol/L) et
classé en 50-100 µg/L (0,40-0,79 µmol/L) ;
4) 5 échantillons urinaires dosés à 90, 80, 84, 72
et 88 µg/L (0,71-0,63-0,66-0,57 et 70 µmol/L) et classés
en 100-300 µg/L (0,79-2,36 µmol/L).
Sensibilité et spécificité de la méthode
semi-quantitative
À partir des résultats obtenus avec les échantillons urinaires
(n = 120), ont été déterminées la sensibilité et la
spécificité de la méthode semi-quantitative à dépister des états de
carence légère à modérée (iodurie < 100 µg/L ou
0,79 µmol/L), ou de surcharge en iode selon les critères
définis au préalable (tableau Ia).
La sensibilité et la spécificité de la méthode semi-quantitative
ont été de 91 % et de 93 % respectivement pour le
dépistage d’une carence. Dans un contexte de dépistage d’une
surcharge, elles ont été de 100 %.
Commentaires
Le dosage quantitatif de l’iodurie s’appuie sur des techniques
complexes et de mise en œuvre délicate. Des méthodes alternatives à
la technique automatisée utilisée sur un analyseur en flux continu
ont été proposées mais elles ne correspondent pas toujours à
l’ensemble des impératifs de dosage de l’iode en biologie
clinique : activation neutronique et spectrométrie de masse
avec dilution isotopique, électrochimie avec des électrodes
spécifiques des iodures, chromatographie en phase gazeuse ou
chromatographie liquide en phase inverse par appariement d’ions [1,
14, 15]. Ces techniques nécessitent souvent un matériel très
spécifique et coûteux.
La détermination semi-quantitative de l’iode urinaire avec
l’indicateur coloré d’oxydo-réduction, la ferroïne, s’avère être
une méthode de bonne spécificité et sensibilité pour le dépistage
d’un apport inadapté en iode chez les sujets (carence ou
surcharge). Ce test semi-quantitatif présente les avantages
suivants : court délai d’exécution, pas de nécessité d’un
appareillage spécifique, facilité de mise en œuvre, faible coût. Il
peut facilement être adapté en laboratoire de biologie médicale.
Une standardisation du protocole opératoire à toutes les étapes est
nécessaire pour faciliter la lecture du virage de coloration et
limiter les facteurs dépendants de l’opérateur. Dans ces
conditions, les résultats de notre laboratoire sont en accord avec
la récente publication de Gnat et al. [10]. Celle-ci montre
que, selon les critères définis par l’OMS, 90 % des carences
légères (iodurie entre 50 et 100 µg/L ou
0,40-0,79 µmol/L) ou modérées
(iodurie < 50 µg/L ou 0,40 µmol/L) et
100 % des surcharges (iodurie > 300 µg/L ou
2,36 µmol/L) sont détectées. Ces résultats apparaissent
satisfaisants pour une méthode semi-quantitative.
L’intérêt de ce test est donc de pouvoir donner au clinicien une
orientation fiable sur l’origine d’une dysthyroïdie dans un délai
court. La connaissance d’une surcharge en iode pourra dans certains
cas permettre de limiter des prescriptions inutiles ou
difficilement interprétables dans ce contexte. Le développement de
ce test semi-quantitatif pourrait prendre son importance dans le
cadre du dépis-tage des carences en iode dans une population ou un
groupe à risque (femmes enceintes, nouveau-nés) et dans le contrôle
de l’efficacité d’une supplémentation collective.
Références
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Physiopathologie de l’iode : intérêt actuel de son dosage en
biologie clinique. Ann Biol Clin 2000 ; 58 :
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2. Aurengo A, Leenhardt L, Aurengo H. Adaptation de
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Pelletier B, Hercberg S. Iodine deficiency in France. Lancet
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