Détection de l’ARN du virus de l’hépatite delta par une RT‐PCR rapide en une étape

ARTICLE

Auteur(s) : E. Ombandza-Moussa, E. Dussaix, A.M. Roque-Afonso

Laboratoire de virologie, Hôpital Paul Brousse, Université Paris XI, 12, avenue Paul Vaillant Couturier, 94804 Villejuif

Article reçu le 11 août 2003, accepté le 13 octobre 2003

Les techniques sérologiques sont insuffisantes pour affirmer le caractère actif d’une infection par le virus de l’hépatite delta (VHD). L’infection active peut être montrée par la présence de l’antigène delta (Ag HD) par immuno-histochimie sur des biopsies hépatiques. Mais la détection de l’ARN viral dans le sérum ou le plasma peut être réalisée par des techniques de biologie moléculaire et permet de façon non invasive de déterminer si une infection est active ou non [1]. Il n’existe pas actuellement de trousse commercialisée ni de technique moléculaire consensus standardisée. Les techniques d’hybridation moléculaire (northern blot) de sensibilité insuffisante sont abandonnées au profit des techniques d’amplification de la cible où, après une étape de transcription inverse (RT) de l’ARN en ADN complémentaire, une courte région du génome viral est amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) [2]. En l’absence de standard de quantification, la comparaison des sensibilités affichées des techniques déjà publiées est difficile. Pour augmenter la sensibilité, certains auteurs font appel à la PCR nichée qui comporte un risque important de contamination. Mais le plus souvent, c’est par l’hybridation du produit d’amplification avec une sonde marquée que la sensibilité de la technique est améliorée. Cette étape d’hybridation permet également de confirmer la spécificité de l’amplification. Dans toutes ces techniques, l’étape de transcription inverse est réalisée de façon indépendante et il est nécessaire de transférer l’ADN complémentaire vers le tube où se réalisera l’amplification.
L’objectif de ce travail a été de mettre au point une méthode simple et rapide où la transcription inverse et la PCR sont effectuées dans le même tube (RT-PCR One-step), suivie d’une hybridation des produits d’amplification par une sonde spécifique. Nous l’avons comparée à une technique où la RT et la PCR se font séparément.

Matériels et méthodes

Échantillons

Quarante-sept sérums ou plasmas provenant de 41 patients ont été testés dans cette étude. Ces échantillons ont été conservés à – 20 °C dans la sérothèque du laboratoire de virologie.
Dix-sept patients avaient des anticorps anti-VHD : il s’agissait de 5 femmes et 12 hommes âgés de 30 à 61 ans (moyenne 47,6 ± 8,4 ans) et suivis au centre hépatobiliaire de l’hôpital Paul Brousse pour hépatite chronique (n = 6) ou cirrhose (n = 11). Trois d’entre eux étaient également infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Les dossiers cliniques, radiologiques (échographie), biologiques (ALAT) et anatomo-pathologiques ont été revus pour cette étude. Douze sujets suivis en médecine du travail (anticorps VHB, VHC, et VIH négatifs) ont constitué notre groupe de témoins négatifs. Douze patients infectés par un virus hépatique autre que le VHD ont également été étudiés : hépatite B (n = 5), hépatite C (n = 5) et hépatite G (n = 2).
Un échantillon d’ARN VHD extrait de tissu hépatique de marmotte a été fourni gracieusement par le professeur Paul Dény. Le titre de cet échantillon a été calculé en estimant que l’ARN du VHD représente de 0,01 à 0,3 % de l’ARN hépatique total soit 6 × 10⁶ – 1,8 × 10⁸ équivalents génomes/µL d’extrait [3].

Marqueurs virologiques

Tous les patients ont bénéficié de sérologies VHB (DiaSorin, Sienne, Italie), VHC (Innogenetics, Gent, Belgique) et VIH (Dade Behring, Marburg, Allemagne et Biorad, Marnes-la-coquette, France). Chez les patients porteurs de l’antigène HBs, l’Ag HD, les IgM anti-VHD, et les anticorps anti-VHD totaux ont été recherchés par des techniques Elisa (DiaSorin).
L’infection active par d’autres virus hépatiques était définie par la présence d’ARN VHC (Cobas Amplicor HCV, Roche Diagnostics, Meylan, France), d’ARN VHG ou d’ADN VHB (Quantiplex HBV-DNA, Bayer Diagnostics, Eragny, France).
La recherche d’ARN delta est pratiquée en routine dans le service de virologie de l’hôpital Avicenne (professeur Dény). Les résultats de ce laboratoire ont été pris comme référence pour notre mise au point.

Extraction de l’ARN

L’ARN est extrait à partir de 140 µL de sérum ou de plasma à l’aide du kit QIAamp^® viral RNA (QIAgen, Les Ulis, France) selon les instructions du fabricant. Les extraits sont repris dans 60 µL de tampon d’élution puis aliquotés, et conservés à – 80 °C.

Choix des amorces et de la sonde

L’alignement des séquences nucléotidiques d’une dizaine d’isolats grâce au logiciel ClustalW a permis de choisir une zone conservée que nous avons soumise au logiciel Primer 3 pour obtenir des amorces et une sonde d’hybridation. L’amorce sens HDV1 (nucléotides : 679-699 ; 5’-CGC GTT CCA TCC TTT CTT AC-3’) est situé dans la séquence autocatalytique génomique, l’amorce antisens HDV2 (nucléotides : 959-979 ; 5’-TGA ATA AAG CGG GTT TCC AC-3’), dans le site de polyadénylation et la sonde HDV3 (nucléotides : 920-940 ; 5’-CCC GAA GAG GAA AGA AGG AC-3’) est proche de la séquence autocatalytique antigénomique (figure 1). La numérotation des nucléotides correspond à la séquence du génome VHD publiée par Makino et al. [4]. Pour permettre la révélation du produit d’amplification par hybridation, l’amorce antisens est biotinylée en 3’ et la sonde est digoxigéninée en 5’. Les amorces sont reconstituées à une concentration de 12,5 pmol/µL et la sonde à une concentration de 1 pmol/µL. Les aliquotes sont conservées à – 20 °C.

RT-PCR en deux étapes

La transcription inverse est effectuée à l’aide du kit cDNA synthesis for RT-PCR (Roche Diagnostics) à partir de 5 µL d’ARN extrait, dans un volume de 20 µL. Cette étape dure 90 minutes. La PCR s’effectue dans un volume final de 50 µL à partir de 2 µL d’ADNc. L’utilisation d’un anticorps anti-Taq (Clontech, Saint-Quentin Yvelines, France) permet d’augmenter l’efficacité et la spécificité de la réaction d’amplification réalisée à l’aide de la Taq polymérase (Pharmacia Biotech, Orsay, France). Cette dernière n’est active qu’après dénaturation du complexe antigène-anticorps par chauffage à 95 °C. Le protocole d’amplification comporte 40 cycles et dure plus de 120 minutes.

RT-PCR One-step

Le kit One-step RT-PCR de QIAgen a été utilisé selon les instructions du fabricant : 2 à 7 µL d’ARN extrait sont ajoutés au mélange réactionnel pour un volume final de 50 µL. Les enzymes réalisant la RT et la PCR sont présentes dans le même tube tout au long de la réaction. La transcription inverse est effectuée par une incubation de 30 minutes entre 50 °C et 60 °C. Inactive aux températures où s’effectue la RT, la Taq polymérase HotStart est activée par une incubation de 15 minutes à 95 °C et assure ensuite une amplification de 40 cycles. La durée totale de la RT-PCR est de 165 minutes. L’optimisation de cette technique nous a conduit à tester les différents protocoles décrits dans le tableau I.

Témoins de contamination

La survenue d’éventuelles contaminations est contrôlée à chaque étape : 140 µL d’eau sont extraits en même temps que les échantillons, constituant ainsi le témoin d’extraction. Un témoin de contamination du mélange réactionnel est réalisé en remplaçant dans l’un des tubes l’extrait ARN par un volume d’eau équivalent. Ces témoins suivent ensuite toutes les étapes comme des échantillons habituels.

Détection des produits d’amplification des deux techniques

Les produits d’amplification sont visualisés après électrophorèse en gel d’agarose à 2 %. La taille du produit amplifié est de 300 paires de base. Les amplicons sont également révélés par hybridation en milieu liquide suivant une technique précédemment décrite [5] : les produits d’amplification biotinylés en 3’ sont déposés sur une microplaque avidinée. Après l’incubation, ils sont dénaturés par la soude à 0,25 M et le brin sens est éliminé par lavage. La sonde HDV3 complémentaire du brin antisens et digoxigéninée est ajoutée. Après incubation à 37 °C, le complexe est révélé à l’aide d’un anticorps anti-digoxigénine (Roche Diagnostics) couplé à la phosphatase alcaline. L’addition de para-nitrophényl phosphate (Sigma diagnostics, Saint-Quentin Fallavier, France), substrat de la phosphatase alcaline, permet le développement d’une coloration jaune mesurée au spectrophotomètre à 405 nm. Le seuil de positivité de la technique a été déterminé de manière classique pour un test Elisa : moyenne des densités optiques (DO) du blanc de réaction plus trois déviations standards. Une densité optique supérieure à 0,150 correspond à un résultat positif. Les densités optiques obtenues ne sont pas proportionnelles à la quantité de matrice présente dans l’échantillon, la technique n’étant pas quantitative.

Résultats

Optimisation de la RT-PCR One-step et performances

Les résultats de la RT PCR en deux étapes et du protocole A de la RT-PCR One-step sur 10 échantillons étaient concordants dans 9 cas/10 : 5 échantillons négatifs (DO < 0,150) et 4 positifs. L’échantillon discordant était positif en RT-PCR deux étapes (DO = 0,519) mais négatif en RT-PCR One-step (DO = 0,149). L’augmentation de la température de RT (protocole B) n’a pas modifié les résultats (DO = 0,142). En revanche, l’augmentation de la quantité d’extrait ajouté au mélange réactionnel (protocole C) a permis de détecter par RT-PCR One-step la présence du génome viral de cet échantillon (DO = 0,198). Le protocole C a ensuite été utilisé pour tester la sensibilité de la technique One-Step.
L’échantillon titré WHV s’est avéré détectable jusqu’à la dilution 10^–4 par RT-PCR en deux étapes et jusqu’à la dilution 10^–5 par RT-PCR One-step, soit 420 copies/tube (figure 2). L’addition de DMSO, supposé « déplier » les structures secondaires des acides nucléiques, n’a pas amélioré la sensibilité de la RT-PCR One-Step et donc le protocole C a été adopté pour la suite (tableau II). La dilution 10^–5 de l’échantillon titré WHV a été trouvée positive dans 5 séries de manipulations réalisées avec des lots de réactifs différents, montrant la reproductibilité inter-essai de la technique.

Tous les échantillons de sérums ou plasmas provenant de sujets témoins et des patients atteints d’hépatites virales autres que liées au VHD ont été trouvés négatifs par RT-PCR One-step (protocole C) avec des DO = 0,050. Aucune réaction croisée n’est observée entre les génomes viraux VHB, VHC, VHG et les amorces ou la sonde VHD utilisées.

Application clinique

Les 17 patients étudiés avaient tous un antigène HBs positif, des anticorps totaux anti-VHD positifs et un antigène HD indétectable (tableau III). L’ARN VHD a été détecté par RT-PCR One-step chez 15 de ces 17 patients, résultats concordants avec la virologie d’Avicenne. Seulement 7 de ces 15 patients avaient des IgM anti-VHD positifs.

Seul le patient n° 3, parmi les 15 virémiques pour le VHD, avait un ADN VHB détectable. Ce patient était également infecté par le VIH.
Le taux de transaminases était élevé chez 14 des 15 patients ARN VHD positif et chez les 2 patients non virémiques. Seul le patient n° 11 a des transaminases normales.

Discussion

Plusieurs études ont montré l’intérêt de la RT-PCR pour le diagnostic et le suivi des patients infectés par le VHD [1]. La RT-PCR One-step mise au point ici apparaît comme une technique rapide, spécifique, reproductible et de sensibilité cliniquement suffisante, puisque aucune discordance n’a été relevée lors de l’analyse des échantillons cliniques entre nos résultats et ceux du laboratoire de virologie de l’hôpital Avicenne, où l’ARN VHD est recherché en routine.
L’optimisation d’une technique fait appel à la variation de plusieurs paramètres tels que la procédure d’extraction de l’ARN, le choix des amorces, des enzymes, l’adjonction d’agents dénaturants lors de l’amplification, etc. [2, 6]. Parmi les techniques de détection de l’ARN VHD décrites, beaucoup utilisent le phénol-chloroforme. Ce procédé efficace nécessite l’utilisation de produits toxiques et de nombreuses manipulations. En revanche, le kit d’extraction sur microcolonnes de silice utilisé ici permet une extraction reproductible et rapide (moins de 30 minutes). Dinolfo et al. ont montré que l’étape limitante de la détection du VHD pouvait être la transcription inverse [6]. Les réactions de transcription inverse décrites durent de 30 à 60 minutes et utilisent des enzymes travaillant entre 37 °C à 45 °C. Le choix d’une région susceptible d’être rétro-transcrite tient compte de sa conservation parmi les différents isolats, mais également des structures secondaires possibles, liées à un fort pourcentage de guanines et de cytosines dans le génome. Nous avons placé nos amorces sur des régions très conservées (ribozymes) mais très structurées, ce qui a pu limiter la sensibilité de notre technique One-step bien que la RT soit réalisée par l’association de deux enzymes actives à des températures allant de 50 à 60 °C, ce qui permet souvent de résoudre ce problème. La réalisation de la réaction de RT et de la réaction de PCR dans le même tube élimine l’ouverture des tubes entre ces deux étapes et réduit de ce fait le risque de contamination, le nombre de manipulations et le temps nécessaire à leur exécution par rapport aux techniques précédemment décrites. Un autre avantage théorique de la RT-PCR One-Step est le fait que tout l’ADN complémentaire synthétisé lors de la RT est utilisé pour l’amplification, sensibilisant ainsi la technique. De manière générale notre technique One-step est plus rapide, 2 h 45 comparé à une moyenne de 4 heures pour les autres techniques. La révélation des amplicons faite par électrophorèse en gel d’agarose est parfois suivie d’une hybridation. Les premières sondes utilisées étaient radiomarquées et permettaient d’augmenter la sensibilité [2, 7]. Plus récemment, Dinolfo rapporte l’utilisation d’une sonde biotinylée comme dans notre étude qui augmente peu la sensibilité mais vérifie la spécificité du produit d’amplification [6]. Certains auteurs s’affranchissent de l’utilisation d’une sonde, notamment en RT-PCR nichée [8].
La sensibilité des techniques publiées est très difficile à comparer du fait de l’absence d’un standard. La sensibilité de notre technique a été estimée sur des dilutions séquentielles d’un extrait d’ARN delta provenant du foie d’une marmotte infectée. La concentration en ARN delta de cet échantillon a elle-même été estimée. C’est ainsi que nous arrivons à un seuil de détection de 420 copies/tube. En extrapolant au sérum extrait par la technique QIAgen, elle serait de 30 000 copies/mL. La sensibilité n’a pas été améliorée par l’addition de DMSO, agent dénaturant, ni par l’augmentation de la température. Une RT-PCR ciblée sur des régions conservées du génome, mais moins structurées que les sites autocatalytiques, pourrait augmenter la sensibilité de notre technique. Comme dans toutes les techniques publiées, il nous a manqué un contrôle interne de réaction susceptible d’apporter la preuve d’absence d’inhibiteurs de PCR.
La RT-PCR One-step a permis de détecter l’ARN VHD chez 15 des 17 patients anti-VHD positifs, suivis au centre hépatobiliaire. La présence d’ARN VHD est associée à l’absence d’ADN VHB chez 14 patients sur 15 montrant l’inhibition habituelle de la réplication du VHB par le VHD. Cette inhibition est levée en cas d’immunodépression profonde comme montré pour le patient n° 3, co-infecté par le VIH avec un taux de CD4 < 20/mm³ [7, 9]. Par ailleurs, moins de la moitié des patients virémiques (7/15) avaient des IgM anti-VHD, confirmant la faible sensibilité des IgM anti-VHD pour détecter l’infection active [10]. La présence d’ARN VHD détectable chez les quatre patients transplantés hépatiques montre la limite de la prophylaxie de la récidive virale B par injection d’immunoglobulines anti-HBs. Cette prophylaxie a réduit l’incidence des récidives de 80 % à 20 %, toutes étiologies confondues. Selon la littérature, la majorité des sujets ARN VHD positif ont des taux d’ALAT élevés comparés à des sujets ARN VHD négatif [1, 8]. Dans notre étude, le taux d’ALAT est élevé chez 16 des 17 patients, y compris chez un patient non répliquant. La négativité de la RT-PCR associée à des transaminases élevées incite à rechercher une autre étiologie que le VHD expliquant la cytolyse. En effet, une suspicion de carcinome hépato-cellulaire est évoquée chez ce patient mais l’hypothèse d’une réplication à bas niveau du VHD ne peut être écartée [11].
Le but de notre étude était de mettre au point une méthode simple et rapide de détection de l’ARN VHD. La RT-PCR One-step, par sa simplicité, sa rapidité, la réduction du nombre de manipulations peut être proposée en routine pour le diagnostic et le suivi des patients infectés. Sa sensibilité pourrait être améliorée en amplifiant une zone moins structurée du génome viral.

Références

1. Bean P. Latest discoveries on the infection and coinfection with hepatitis D virus. Am Clin Lab 2002 ; 21 : 25-7.

2. Madejon A, Castillo I, Bartolomé J, et al. Detection of HDV-RNA by PCR in serum of patients with chronic HDV infection. J Hepatol 1990 ; 11 : 381-4.

3. Negro F, Korba BE, Forzani IB, et al. Hepatitis delta virus (HDV) and woodchuck hepatitis virus (WHV) nucleic acids in tissues of HDV infected chronic WHV carrier woodchucks. J Virol 1989 ; 63 : 1612-8.

4. Makino S, Chang MF, Shieh CK, et al. Molecular cloning and sequencing of a human hepatitis delta virus RNA. Nature 1987 ; 329 : 343-6.

5. Taoufik Y, Froger D, Benoliel S, et al. Quantitative Elisa-polymerase chain reaction at saturation using homologous internal DNA standards and chemiluminescence revelation. Eur Cytokine Netw 1998 ; 9 : 197-204.

6. Dinolfo L, Abate ML, Bertolo P, et al. Detection of hepatitis D virus RNA in serum by a reverse transcription, polymerase chain reaction based assay. Int J Clin Lab Res 1995 ; 25 : 35-9.

7. Dény P, Lecot C, Jeantils V, Ovaguimian L, Krivitzky A, Bréchot C. Polymerase chain reaction-based detection of hepatitis D virus genome in patients infected with human immunodeficiency virus. J Med Virol 1993 ; 39 : 214-8.

8. Sakugawa H, Nakasone H, Kawakami Y, et al. Determination of hepatitis delta virus (HDV)-RNA in asymptomatic cases of HDV infection. Am J Gastroenterol 1997 ; 92 : 2232-6.

9. Cassidy WM, Govindarajan S, Gupta S, Valinluck B, Redeker AG. Influence of HIV on chronic hepatitis B and D infection (abstract). Hepatology 1989 ; 10 : 690.

10. Huang YH, Wu JC, Sheng WY, Huo TI, Chang FY, Lee SD. Diagnostic value of anti-hepatitis D virus (HDV) antibodies revisited : a study of total and IgM anti-HDV compared with detection of HDV-RNA by polymerase chain reaction. J Gastroenterol Hepatol 1998 ; 13 : 57-61.

11. Sakugawa H, Nakasone H, Nakayoshi T, et al. Hepatitis B virus concentrations in serum determined by sensitive quantitative assays in patients with established chronic hepatitis delta virus infection. J Med Virol 2001 ; 65 : 478-84.