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Moelle osseuse : réservoir de cellules souches réparatrices de différents tissus ?


Annales de Biologie Clinique. Volume 62, Numéro 2, 131-8, Mars-Avril 2004, Revue générale


Résumé   Summary  

Auteur(s) : M. Cavazzana‐Calvo, C. Lagresle, I. André‐Schmutz, S. Hacein‐Bey‐Abina , Département de biothérapie cavazzannecker.fr Unité Inserm U 429, Hôpital Necker enfants malades, 149, rue de Sèvres, 75743 Paris cedex 15 .

Résumé : La greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est utilisée depuis des décennies principalement dans le traitement des hémopathies malignes. Malgré l‘utilisation extensive des CSH en clinique, on sait encore peu de choses quant à leur migration, leur survie et les mécanismes régissant leur auto‐renouvellement et leur différenciation. La technique permettant leur tri chez l‘homme repose sur l‘expression à la membrane de la molécule CD34 +. Pourtant, des expériences suggèrent l‘existence d‘un pool de CSH n‘exprimant pas CD34 et qui pourrait représenter des précurseurs des CSH CD34 +. Enfin, alors que l‘on pensait les cellules souches de la moelle osseuse capables de ne se différencier qu‘en cellules hématopoïétiques, des expériences récentes de transplantation ont montré la formation de tissus non hématopoïétiques, comme des cellules musculaires, neurales et des hépatocytes, ce qui conférait aux CSH une capacité à la transdifférenciation. En fait, les preuves d‘une telle capacité de la part des CSH manquent encore, et les résultats observés pourraient résulter de la présence dans la moelle osseuse d‘autres cellules souches multipotentes, comme la cellule souche mésenchymateuse, et, plus primitives, les multipotent adult progenitor cells (MAPC) et les cellules de la side population (SP).

Mots-clés : cellule souche, différenciation, transdifférenciation, plasticité

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : M. Cavazzana-Calvo1,2, C. Lagresle2, I. André-Schmutz1,2, S. Hacein-Bey-Abina1,2

1 Département de biothérapie cavazzan@necker.fr
2 Unité Inserm U 429, Hôpital Necker enfants malades, 149, rue de Sèvres, 75743 Paris cedex 15

Article reçu le 5 mai 2003, accepté le 8 juillet 2003

Depuis une quarantaine d'années, la moelle osseuse fait l'objet d'études extensives tant sur le plan biologique que clinique. L'ensemble de ces travaux a permis à la greffe de moelle osseuse allogénique de devenir le traitement de choix de nombreuses pathologies. Parallèlement à ces améliorations thérapeutiques notables, des découvertes récentes sont à l'origine d'un débat scientifique animé sur le potentiel thérapeutique des cellules souches isolées des tissus différenciés, soutenant ainsi le développement d'une nouvelle spécialité médicale : la médecine réparatrice. Il semble aujourd'hui acquis que la moelle osseuse contient différents types de cellules progénitrices et de cellules souches. Dans cette revue, nous essayons de faire le point sur ce domaine en constante évolution et sujet à controverses, en essayant d'aborder scientifiquement les problèmes soulevés.

La cellule souche hématopoïétique

Quelques données biologiques

La cellule souche hématopoïétique (CSH) représente l'exemple probablement le mieux connu d'une cellule souche multipotente physiologique identifiée avec certitude in vivo et in vitro chez l'animal et chez l'homme [1, 2]. La multipotentialité de cette cellule définit une de ses caractéristiques biologiques, la seconde étant représentée par sa capacité à assurer l'homéostasie des cellules sanguines et ce pendant toute la durée de vie de l'individu. Le rôle de l'environnement médullaire dans l'expression de ces deux programmes génétiques, l'autorenouvellement et la différenciation n'est plus à prouver. Cette cellule a été bien caractérisée phénotypiquement et fonctionnellement chez la souris et chez l'homme. Chez la souris, les CSH n'expriment à la surface aucun antigène spécifique d'une lignée cellulaire (lineage négative : Lin), mais elles expriment c-Kit, récepteur du facteur de cellules souches Sca-1 (KTLS) et sont faiblement positives pour l'antigène Thy1 [3]. L'injection intraveineuse d'une seule de ces cellules est capable d'assurer la reconstitution hématologique à long terme d'une souris létalement irradiée. Le profil d'expression génique de cette population cellulaire homogène est de mieux en mieux connu [4], et son profil moléculaire précis viendra bientôt compléter sa description fonctionnelle. Chez l'homme, la grande majorité des CSH exprime l'antigène CD34, une molécule d'adhésion de la famille des sialomucines. Ces cellules, qui constituent 1 à 3 % des cellules de la moelle osseuse, sont négatives pour les antigènes spécifiques de lignée (Lin), n'expriment par le CD38 et d'une façon analogue à la CSH murine, expriment c-kit et Thy1. Selon la source cellulaire utilisée (moelle osseuse ou sang de cordon), la fréquence des CSH varie entre 1 : 200 et 1 : 500 parmi la population CD34+. Contrairement à la souris, l'incapacité à purifier une population homogène de CSH selon ses marqueurs membranaires chez l'homme, oblige pour la définir, à avoir recours à des tests fonctionnels [5-7] : culture à long terme sur stroma médullaire qui permet de quantifier les long term culture initiating cell (LTC-IC) et repopulation hématopoïétique de la souris immunodéficiente NOD/SCID pour la détermination des SCID repopulating cells (SRC).
Des précurseurs plus engagés que les CSH dans la différenciation hématopoïétique ont été caractérisés chez l'homme comme chez la souris : un précurseur myéloïde commun (CMP) et un précurseur lymphoïde commun (CLP), le premier capable de donner naissance aux lignées érythrocytaire, mégacaryocytaire et granulomonocytaire [8], le deuxième à toutes les cellules lymphoïdes (B, T et natural killer) [9] (figure 1). Un réseau complexe et partiellement élucidé de facteurs de transcription et de cytokines intervient dans la maturation finale de ces précurseurs, permettant ou bloquant l'accès à des programmes génétiques, stimulant la prolifération et la différenciation et/ou prévenant l'apoptose de ces cellules [10]. Des niveaux d'expression différents du même facteur de transcription peuvent induire des programmes de différenciation complètement divergents et les facteurs de transcription peuvent exercer des actions spécifiques de lignée ou d'étape de maturation. La caractérisation précise de ce réseau peut avoir des retombées thérapeutiques importantes. À titre d'exemple, l'identification phénotypique et la caractérisation du CLP humain permettraient de sélectionner ce dernier, de l'amplifier in vitro avant sa réinfusion au patient, avec pour conséquence thérapeutique une accélération de la reconstitution immunologique après greffe de moelle osseuse HLA partiellement incompatible. En effet, le déficit immunitaire profond et persistant qui caractérise ce type de greffe est le frein le plus important à leur utilisation à plus grande échelle.

Cellules souches hématopoïétiques : les avancées thérapeutiques

La transplantation des CSH allogéniques ou autologues, manipulées ex vivo ou non, représente le premier succès de la médecine régénératrice. Aujourd'hui, trois sources différentes de CSH sont utilisées dans la pratique clinique : la moelle osseuse, les cellules souches mobilisées dans la circulation par facteurs de croissance et le sang de cordon ombilical [11-13]. La principale indication de cette thérapeutique est représentée par les hémopathies malignes (85 %), mais un nombre croissant de maladies héréditaires bénéficie de ce traitement au fur et à mesure que la toxicité précoce liée au traitement myélosuppressif diminue. La grande majorité des transplantations de CSH a recours à des donneurs familiaux HLA géno-identiques (62 % en 2000). Dans les autres cas, les CSH proviennent de donneurs phéno-identiques non apparentés (31 %) ou de donneurs familiaux partiellement compatibles (7 %). Le développement de registres de volontaires sains est à l'origine du doublement du nombre de greffes allogéniques phéno-identiques réalisées ces dernières années.

Le greffon des CSH est soumis dans certains cas à des manipulations de plus en plus complexes ex vivo qui ont essentiellement deux buts différents : la réduction des conséquences de l'incompatibilité tissulaire donneur/receveur, et la réduction de la durée de l'aplasie chimio et/ou radio-induite [14].
Depuis la réalisation, à la fin des années 1960, des premières greffes allogéniques, les résultats cliniques ont continué à s'améliorer grâce aux progrès effectués en termes de soins, en particulier au niveau de la gestion des complications infectieuses. On peut aujourd'hui établir selon le diagnostic et le degré de disparité HLA entre donneur/receveur, la probabilité de succès de cette approche thérapeutique [15].
Enfin, les progrès réalisés en termes de manipulations de CSH ex vivo ont permis le transfert des gènes à l'aide de vecteurs rétroviraux dans ces cellules permettant ainsi de traiter deux maladies génétiques du système immunitaire [16]. La compréhension détaillée des deux événements indésirables graves survenus chez deux enfants traités par thérapie génique permettra dans un futur proche de modifier les vecteurs disponibles pour diminuer et/ou abolir ces types de complications [17] et élargir les applications thérapeutiques du transfert de gènes [18].

Cellules souches hématopoïétiques : les problèmes non résolus

Malgré 50 ans de recherche extensive et l'amélioration significative au cours du temps des résultats cliniques des greffes de CSH, quelques questions cruciales restent sans réponse ou avec des réponses incomplètes. Le nombre de cellules à greffer pour s'assurer d'une hématopoïèse à long terme, les critères qui définissent la qualité hématopoïétique du produit cellulaire, les facteurs impliqués dans l'autorenouvellement et dans la migration de CSH en sont des exemples significatifs.

Dose minimale de cellules CD34+ dans un greffon et potentiel hématopoïétique des cellules CD34

Chez l'homme, la quantification des CSH repose sur des techniques indirectes de quantification des LTC-IC et SRC. À défaut de pouvoir répondre avec précision à la question de la quantification des CSH, les cliniciens s'entourent de précautions et introduisent le concept de seuil minimal de cellules à réinjecter basé sur des données statistiques. Cette dose minimale est de 3 × 106 CD34+/kg du poids du receveur en cas d'autogreffe et augmente en situation allogénique pour atteindre le seuil recommandé de 10 × 106 CD34+/kg en situation d'incompatibilité HLA partielle. Le but de cette dose minimale reste mal défini. S'agit-il de la reconstitution du compartiment périphérique ou de celle du compartiment de cellules souches ? Actuellement, l'objectif premier ne prend en compte que la reconstitution à long terme du compartiment périphérique, tout en sachant que la restauration du pool de CSH est très faible (évaluée autour de 10 % du niveau normal) et que la restauration d'un compartiment immature des cellules CD34 négatives n'est pas effective [19].
Ce compartiment CD34 pourrait jouer un rôle important dans la reconstitution à long terme du système hématopoïétique, car une sous-population de CSH a été identifiée dans la fraction CD34 négative. En 1998, deux groupes ont identifié une population de CSH dans la fraction CD34 de la moelle osseuse humaine : le groupe de Dick par les techniques classiques de détection de LTC-IC et SRC [20] et le groupe de Zanjani par une technique de greffes primaires et secondaires in utero chez le mouton [21]. Dans les deux cas, les cellules CD34 donnent naissance à des cellules CD34+, ce qui suggère qu'elles seraient plus immatures. Ainsi, si la vraie CSH est la cellule CD34- lin, les patients greffés avec des populations sélectionnées en cellules CD34+ risquent au cours du temps, de voir leur activité hématopoïétique décliner. Il est cependant à noter que dix ans après la réalisation de ce type de greffes, aucune donnée en ce sens n'a été rapportée. Cependant, les causes d'une restauration hématopoïétique incomplète du compartiment de CSH sont inconnues, même si on sait que l'utilisation de cellules ontogéniquement plus immatures comme les cellules du foie fœtal permettrait une meilleure reconstitution du pool des cellules souches [22].

Prolifération des CSH

Des mécanismes complexes de régulation, intrinsèques et extrinsèques, sont responsables du comportement prolifératif des CSH. Les différences de capacité proliférative des cellules souches fœtales par rapport aux cellules adultes suggèrent fortement sa régulation par un programme génétique intrinsèque. Une capacité proliférative limitée évoque ainsi l'existence d'une « montre » mitotique intrinsèque, mais dont nous ne savons toujours pas « changer l'heure » [23, 24]. L'induction de la prolifération des CSH par des combinaisons variables de cytokines hématopoïétiques est responsable d'une perte du potentiel de prolifération en faveur de la différenciation, ce qui aujourd'hui limite l'utilisation de cette approche à la seule expansion de certains progéniteurs lignée-spécifiques [10, 25]. L'importance du microenvironnement médullaire dans le maintien du programme d'autorenouvellement est incontestable, et quelques mécanismes moléculaires permettent d'éclaircir aujourd'hui ce champ d'investigation qui aurait de nombreuses applications thérapeutiques.
Une augmentation de l'autorenouvellement a été associée récemment à une activité augmentée de Bcl-2 [26], une hyperexpression de HOXB4 [27], une inhibition de GATA-2 [28] et une expression du FGFR de type I [29]. De plus, une activation de la voie Notch semble également participer à l'inhibition de la différenciation. Toutefois, des résultats divergents sont publiés sur le rôle de la voie Notch dans l'amplification du compartiment de cellules souches, différences reposant probablement sur les différences intrinsèques de la CSH utilisée [30]. L'ensemble de ces études laisse toutefois espérer qu'un protocole de grade clinique puisse être mis au point dans un futur proche.

Migration des CSH dans la moelle osseuse

La migration transendothéliale des CSH pour repeupler les sites médullaires du receveur, la production des cellules matures et leur réintroduction dans la circulation représentent d'autres facteurs importants dans la mise en place d'un compartiment hématopoïétique fonctionnel. Cependant, les mécanismes qui induisent et régulent ce processus migratoire ne sont pas complètement élucidés. Un seul couple ligand/récepteur SDF1/CXCR4 a été décrit comme jouant un rôle clé dans la régulation du trafic leucocytaire, de la migration et de la rétention des cellules souches dans le microenvironnement médullaire permettant ainsi de redéfinir une sous-population de CSH à l'aide de ce marqueur : CD34+CD38-/low/CXCR4+ [31]. À nouveau, si on pouvait à l'aide d'une brève culture ex vivo augmenter l'expression membranaire de ce récepteur sans diminuer le potentiel d'autorenouvellement des CSH, on pourrait améliorer la prise et la restauration du compartiment souche médullaire et probablement les résultats des greffes de ces cellules.
La compréhension des mécanismes liés à la migration ciblée de la cellule réparatrice est l'enjeu majeur de cette discipline dans les années futures, non seulement pour la moelle osseuse mais également pour les autres organes.

Réparation de tissus non hématopoïétiques à partir des cellules de la moelle osseuse

Cellules de la moelle osseuse et réparation de tissus non hématopoïétiques : résultats cliniques

Jusqu'à récemment, l'utilisation de cellules souches de la moelle osseuse pour traiter des maladies autres que celles du système lymphohématopoïétique était inconcevable. Deux essais cliniques ont modifié ce point de vue. Ainsi, l'équipe de Shapiro [32] a récemment amené la preuve qu'une maladie neurodégénérative rapidement progressive qui affecte la myéline du SNC et les glandes surrénales (adrénoleucodystrophie liée à l'X) peut bénéficier d'une greffe allogénique de moelle osseuse. Le rationnel de cette stratégie thérapeutique repose sur l'hypothèse que des cellules fonctionnelles du donneur, dérivées de la moelle osseuse, peuvent traverser la barrière hématoencéphalique et exercer un effet bénéfique sur les mécanismes de la démyélinisation. Les résultats rapportés en 2000 prouvent que l'hypothèse faite était correcte, le mécanisme le plus probable reposant sur la différenciation de cellules hématopoïétiques en microglie. Le deuxième essai clinique a été rapporté par Horwitz, qui a montré que la greffe de moelle osseuse allogénique chez cinq enfants atteints d'ostéogenèse imparfaite améliorait de manière significative les symptômes associés à cette maladie. Cet essai repose sur l'éventuelle possibilité d'induction de différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuses présentes dans la moelle osseuse [33]. Dans ces deux essais cliniques, ce ne sont donc probablement pas des CSH qui se différencient, mais des macrophages et des cellules souches mésenchymateuses présents dans la moelle osseuse.

Les cellules souches hématopoïétiques sont-elles capables de se transdifférencier ?

Depuis 1998, quelques publications sont venues bouleverser le monde de l'hématologie suggérant l'existence d'une certaine plasticité des cellules souches adultes. Ces publications se voulaient démonstratives quant à la capacité des cellules souches isolées d'un tissu à migrer dans des tissus différents et à se transdifférencier dans les cellules propres de l'organe colonisé, myocarde, foie ou système nerveux central, transgressant ainsi les barrières embryologiques. Les techniques utilisées pour démontrer le concept de plasticité reposaient dans la plupart des cas sur des expériences de greffe de CSH purifiées ou non, la preuve de transdifférenciation étant apportée par l'étude de l'expression de marqueurs de surface et de morphologie. Plusieurs critiques peuvent être émises à l'encontre de ces études. De nombreuses greffes ont été faites à partir de moelle osseuse totale, contenant donc non seulement les CSH mais aussi des cellules souches mésenchymateuses capables de générer du cartilage, de l'os, des adipocytes, etc. Même dans les cas de greffe de très petits nombres de CSH triées, la pureté du tri, même élevée, n'est jamais suffisante pour exclure la présence de cellules contaminantes. Il est donc impossible à partir de ce type d'expérience de démontrer la « plasticité » des CSH. Par ailleurs, si elle existe, la plasticité constitue vraisemblablement un événement extrêmement rare, comme le suggèrent fortement les résultats du groupe d'Irving Weissman [34]. En effet, la greffe de CSH purifiées de souris dans des receveurs irradiés à raison d'une CSH par receveur, permet la reconstitution complète du système hématopoïétique. En revanche, aucun signe de transdifférenciation n'a été détecté dans le cerveau, le rein, l'estomac, le foie et le muscle des souris greffées.

Enfin, la preuve d'une transdifférenciation des CSH n'a pas encore été clairement apportée. En effet, le groupe de Grompe a publié en 2000 [35] ce qui a été considéré comme la seule démonstration de la capacité d'une CSH à traiter avec succès une maladie métabolique du foie due à la mutation du gène fumarylacétoacétate hydrolase. Trois ans après, la même équipe explique que cette correction ne provient pas d'un processus de différenciation cellulaire mais de la fusion des CSH de l'animal donneur avec celles hépatiques du receveur [36, 37]. Ces données concordent avec celles de Mallet [38] qui ont rapporté que la différenciation des cellules médullaires en hépatocytes est un événement rare difficilement utilisable dans la pratique clinique. De la même façon, les travaux de Blau [39] indiquent que la majorité des neurones de Purkinje contenant la sonde Y dans le cas d'un receveur de moelle osseuse de sexe féminin sont le résultat d'un processus de fusion et bien plus rarement de différenciation. Il faut cependant garder à l'esprit les risques liés au processus de fusion cellulaire, ainsi cette voie thérapeutique ne pourra être envisagée pour réparer un tissu qu'une fois l'assurance d'absence d'effets délétères obtenue.
On peut donc raisonnablement affirmer qu'il n'y a plus aucune preuve aujourd'hui que la CSH puisse donner naissance, d'une façon physiologiquement valable, à d'autres lignées cellulaires que les lignées sanguines.

La moelle osseuse : réservoir d'autres cellules souches multipotentes

Il existe vraisemblablement dans la moelle osseuse d'autres cellules souches caractérisées par une grande capacité d'autorenouvellement et de différenciation, comme c'est le cas par exemple de la cellule décrite par Verfaillie et appelée cellule progénitrice adulte multipotente ou MAPC (multipotent adult progenitor cell). Cette cellule est capable de donner naissance à un niveau clonal in vitro et in vivo au mésoderme, à l'ectoderme et à l'endoderme, et contribue fonctionnellement après injection dans un blastocyste [40, 41] au développement de la majorité des tissus somatiques. Ses caractéristiques biologiques semblent davantage proches de celles d'une cellule embryonnaire que de celles d'une CSH. Cette cellule souche pourrait s'apparenter à la cellule décrite par Krause et Theise, qui démontrent à l'échelon clonal qu'une cellule souche de la moelle osseuse de la souris, ayant migré dans la moelle osseuse lors d'une greffe primaire, peut lors de transplantations secondaires se différencier en cellules épithéliales du foie, du poumon, de l'intestin et de la peau [42, 43].
Par ailleurs, sur la base de la capacité fonctionnelle de certaines cellules, à exclure le colorant vital, Hoechst 33342, Goodell a pu également identifier une population très homogène de cellules nommée SP (side population) très enrichie en cellules capables de repeupler à long terme la moelle osseuse d'une souris létalement irradiée. Cette population Hoechst négative a été décrite également chez d'autres espèces comme le porc, le singe et l'homme. Elle a été retrouvée non seulement dans la moelle osseuse, mais également dans d'autres tissus différenciés comme par exemple le muscle squelettique. Elle semble caractérisée par une grande plasticité, même si cette multipotentialité doit être considérée avec beaucoup de précaution car aucune preuve à l'échelon clonal n'a été apportée jusqu'à présent [44]. Dans la moelle osseuse, la population SP pourrait faire partie de la population CD34+ Lin décrite précédemment.
De plus, parallèlement à ces cellules souches différemment caractérisées par ces trois équipes, un progéniteur endothélial capable de s'intégrer dans des structures vasculaires a été décrit dans la moelle osseuse et dans la circulation [45]. La cellule médullaire à l'origine de ce progéniteur reste inconnue, il pourrait s'agir de l'hémangioblaste capable de donner naissance aux cellules hématopoïétiques et aux cellules endothéliales (figure 1), des cellules vasculaires capables de produire des cellules de type muscle lisse et des cellules endothéliales ou enfin des cellules souches multipotentes de type MAPC. Ces quelques exemples permettent de montrer la difficulté dans l'état actuel des connaissances, de définir avec précision les différents compartiments de cellules souches, qui ont été mis en évidence dans les différents tissus somatiques [46], d'en établir l'ontogénie ainsi que les capacités réparatrices.

Conclusion et perspectives

Les termes transdifférenciation et plasticité ont ainsi été utilisés de façon inappropriée, mais ils ont permis de bousculer les dogmes dans ce domaine et de faire d'importantes découvertes et quelques avancées encourageantes au niveau thérapeutique. Alors que la filiation du progéniteur endothélial est encore l'objet de controverses, l'utilisation des cellules mononucléées de la moelle osseuse dans l'ischémie des membres inférieurs a donné des résultats spectaculaires au moins en terme angiographique [47], et nous sommes surpris par le pourcentage élevé de cellules épithéliales humaines d'origine du donneur dans le tractus gastro-intestinal chez le receveur d'une greffe médullaire [48]. En parallèle, de nouvelles cellules souches dérivées des membranes fœtales (placenta ou villosités chorioniques) ont été décrites, et les cellules souches embryonnaires donnent des résultats intéressants dans de nombreux modèles animaux de pathologies humaines.
Nous avons la chance de participer à une vraie révolution biologique, mais un peu de patience est nécessaire pour monter des modèles animaux qui permettront d'évaluer de manière rationnelle les retombées thérapeutiques possibles de la transplantation de toutes ces cellules souches, encore mal connues pour l'instant.

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