Électrophorèse des protéines sériques : comparaison de la technique en capillaire de zone Capillarys ^® (Sebia) et de l’électrophorèse en gel d’agarose Hydrasys ^® (Sebia)

ARTICLE

Auteur(s) : B. Lissoir, P. Wallemacq, D. Maisin

Laboratoire de biologie clinique, service de biochimie médicale, cliniques universitaires Saint-Luc, 10, Avenue Hippocrate, 1200 Bruxelles

Article reçu le 30 décembre 2002, accepté le 4 avril 2003

L’électrophorèse des protéines sériques est une analyse de routine dans la pratique quotidienne d’un laboratoire de biochimie médicale. Les cliniciens requièrent cette analyse principalement pour la recherche de gammapathies responsables de profils polyclonaux, oligoclonaux et monoclonaux de la zone des gammaglobulines, ainsi que pour mettre en évidence un éventuel déficit en α1-antitrypsine. Aujourd’hui, le laboratoire devrait idéalement disposer d’une technique automatisée, apte à détecter ces dysprotéinémies, et possédant une bonne résolution et une limite de détection la plus basse possible (pour les petits pics monoclonaux). Parmi les techniques disponibles sur le marché, celle la plus couramment employée est l’électrophorèse en gel d’agarose. C’est une des techniques de choix pour la détection de gammapathies, bien qu’il ait déjà été décrit [1] que cette technique présentait des lacunes quant à la détection de composés monoclonaux migrant au même niveau que d’autres fractions électrophorétiques notamment au niveau des fractions β-globulines et α-1 ou 2-globulines. Au sein de notre hôpital, le nombre d’électrophorèses des protéines ne diminuant pas, nous sommes amenés à rechercher un outil fiable et davantage automatisé. C’est ainsi que depuis quelques années, une technique alternative d’électrophorèse capillaire automatisée (Paragon^®, Beckman^TM) a fait son apparition, dont les performances ont déjà été décrites [2-4].
Le but de cette étude est de comparer un nouvel appareil d’électrophorèse capillaire Capillarys^® (Sebia) à l’électrophorèse en gel d’agarose Hydrasys^® (Sebia) d’un point de vue analytique (reproductibilité, sensibilité, spécificité) et pratique (facilité d’utilisation, durée et coût d’un test).

Matériel et méthode

Matériel

Deux techniques d’électrophorèse ont été comparées : l’électrophorèse sur gel d’agarose Hydrasys^® (Sebia, Issy-les-Moulineaux, France) (méthode habituellement utilisée au laboratoire de biochimie médicale des Cliniques universitaires Saint-Luc de Bruxelles) et l’électrophorèse capillaire Capillarys^® (Sebia, Issy-les-Moulineaux, France), récemment introduite sur le marché.
L’électrophorèse capillaire est une technique analytique qui permet la séparation et la quantification de nombreux paramètres biologiques dont les protéines sériques. Cette méthode de séparation est considérée comme très performante (en particulier sur le plan de la résolution), rapide et reproductible, offrant en outre l’avantage d’une automatisation complète de l’analyse. Le principe utilisé est celui de l’électrophorèse capillaire en solution libre permettant la séparation de molécules chargées en fonction de leur mobilité électrophorétique propre dans un tampon de pH constant et de flux électro-osmotique plus ou moins important. Le système Capillarys^® comprend huit capillaires en parallèle, permettant huit analyses simultanées. Le software utilisé est de version 4.14. Sur ce système, l’injection des échantillons (dilués au 1/10 dans le tampon) dans les capillaires, est effectuée à l’anode par aspiration. La séparation est ensuite réalisée en appliquant une différence de potentiel constante de 9 000 V aux extrémités de chaque capillaire (thermostaté à 35 °C). La détection directe des protéines est effectuée à 200 nm côté cathode. Les capillaires sont ensuite lavés par une solution de lavage, puis par le tampon d’analyse. Avec le tampon basique utilisé, six fractions sont séparées dans l’ordre suivant : γ-globulines, β1- et β2-globulines, α1- et α2-globulines et albumine. La composition du kit de réactif Capillarys^® comprend un tampon d’analyse à pH = 10, une solution de lavage concentrée contenant de la soude caustique, des barrettes de dilution à usage unique pour la dilution des échantillons de sérum par l’automate et des filtres à usage unique pour les flacons de réactifs.
L’électrophorèse sur gel d’agarose (Hydrasys^®) est une technique semi-automatisée permettant la migration et la séparation des protéines sériques en tampon alcalin (pH = 9,2) sur un gel d’agarose (Hydragel^® protéine 15/30 ou Hydragel^® protéine 54). Les protéines sont séparées en cinq fractions : albumine, α1- et α2-globulines, β-globulines et γ-globulines. Ces protéines séparées sont colorées par une solution d’amidoschwarz et l’excès de colorant est éliminé en milieu acide. La densitométrie (à 570 nm) donne une quantification relative précise de chaque zone individualisée. Le système Hydrasys^® (software 6.02.85) comporte les étapes suivantes : application des échantillons non dilués, migration électrophorétique à 20 W constants, séchage, coloration, décoloration, séchage final et lecture sur un densitomètre/scanner (Hyrys^®, Sebia, version 4.16) à 570 nm. La composition du kit de réactif Hydragel^® protéine comprend des mèches tamponnées (jouant un rôle de réservoir de tampon pour l’électrophorèse et assurant le contact entre le gel et les électrodes), du colorant amidoschwarz (solution acide à pH = 2 ; à 4 g/L), de l’éthylène glycol (6,7 %), des applicateurs, des papiers filtres et 10 gels d’agarose prêts à l’emploi. Chaque gel contient 8 g/L d’agarose et du tampon Tris-barbital à pH = 9,2. Les autres réactifs nécessaires sont une solution de décolorant contenant 0,5 g/L d’acide citrique (à diluer au 1/1 000 avec de l’eau distillée), une solution de lavage Hydrasys^® (tampon alcalin pH = 8,8 ± 0,3 et azoture de sodium 0,625 %) et du Fluidil^® (Sebia, France, réactif de composition protégée, à acquérir séparément) pour le traitement d’échantillons visqueux ou troubles.
Les immunofixations sont réalisées sur des gels Hydragel 4 IF^® Sebia. Chaque gel contient : 8 g/L d’agarose et du tampon Tris-barbital, pH = 8,8 ± 0,1. La composition du kit de réactif Hydragel 4 IF^® comprend : 10 gels d’agarose, des mèches tamponnées, du colorant amidoschwarz, du colorant violet acide (2 g/L de violet acide, 10 % d’acide acétique), du diluant (tampon alcalin pH = 8,0 ± 0,3, bleu de bromophénol), un coffret de fixateur et d’antisérums (contenant des immunoglobulines totales de mammifère anti-humaines), des papiers-filtres. Les autres réactifs nécessaires sont un décolorant (acide citrique : 0,5 g/L à diluer 1/1 000 avec de l’eau distillée), une solution de lavage (tampon alcalin à pH = 8,8 et azoture de sodium : 0,625 %) et du Fluidil^®.
L’immunofixation avec des anticorps pentavalents (mélange contenant des anti-IgA, anti-IgM, anti-IgG, anti-kappa et anti-lambda) sont réalisés sur des gels Hydragel 12 IF^®, Sebia. La composition des gels est identique aux deux techniques pré-décrites.

Collecte des échantillons

Les échantillons analysés proviennent de la routine du laboratoire de chimie spéciale des Cliniques universitaires Saint-Luc à Bruxelles. Pendant 3 semaines, 1 091 échantillons de cette routine sont passés simultanément en électrophorèse sur gel d’agarose (Hydrasys^®) et en électrophorèse capillaire (Capillarys^®). Les prélèvements ont été effectués sur des tubes de sérum, S-Monovette ^® (4,9 mL, Sarstedt).

Procédure

De ces 1 091 échantillons analysés en parallèle, trois sous-groupes sont distingués. Le premier consiste en 170 profils électrophorétiques présentant dans l’une des différentes fractions une quelconque irrégularité, susceptible de révéler un composé mono- ou oligoclonal. Le deuxième sous-groupe de 921 échantillons correspond aux profils dénués de toute irrégularité quelle que soit sa localisation. Nous émettons le postulat que ces échantillons sont négatifs en composés mono- ou oligoclonaux. Enfin un groupe de 529 profils pour lesquels nous disposions du dosage des protéines totales a été retenu au sein des 1 091 échantillons. Ceux-ci ont été utilisés dans la comparaison des pourcentages de fractions (agarose versus capillaire). Lors de la sélection des 170 profils irréguliers, le Capillarys^® a été utilisé avec un réglage de sensibilité maximal (graduation 1 sur une échelle allant de 1-4). Dans un second temps, les tracés ont été modifiés en diminuant leur résolution (profils plus arrondis) avec le software 4.14 du Capillarys^® programmé avec un niveau de sensibilité de 2. Cette modulation de résolution est possible grâce à un algorithme propre à la firme Sebia. En effet, le Capillarys^® possède par défaut une résolution maximale élevée (lecture sur 300 points). La sensibilité du tracé est ainsi accrue, augmentant par conséquent la détection de fins composés monoclonaux mais aussi d’irrégularités au détriment parfois de la spécificité. Nous avons souhaité tester cette seconde étape afin de tenter d’optimaliser la balance entre sensibilité et spécificité.
Ces 170 profils ont été comparés à ceux obtenus en électrophorèse sur gel d’agarose avec pour but la détection de composés monoclonaux. Le diagnostic final (vrai positif, vrai négatif) a été établi par immunofixation pour chacun des 170 cas (Hydragel 4 IF^®/Pentavalent 12 IF^®). Sur la base de ces données, nous avons calculé la sensibilité et la spécificité des deux techniques : Hydrasys^® et Capillarys^® (avec une résolution maximale et avec une résolution moindre) en se basant sur les définitions suivantes. Nous avons considéré comme négatifs les profils sans particularités et les profils polyclonaux. Nous avons considéré comme positifs tous les profils oligoclonaux et monoclonaux. Un profil oligoclonal est défini par la présence d’au moins trois pics distincts étroits, fins et homogènes sur le tracé protéique. Un profil monoclonal est défini par la présence nette d’un ou deux pics étroits et homogènes. Notons que l’on utilisera le terme de petit pic monoclonal lorsque ce pic est peu visualisé.
Lors de la comparaison des fractions, le programme statistique utilisé est MedCalc^® pour Windows (statistical software, version 6.16.000, Mariakerke, Belgique). La méthode de comparaison inclura une analyse de Bland et Altman et une régression de Passing et Bablok. En outre, nous avons également testé sur les deux techniques cinq échantillons au profil protéique particulier : déficit en α1 anti-trypsine, présence de fibrinogène (plasma), réaction inflammatoire, bisalbuminémie et syndrome néphrotique. Afin de mieux définir les valeurs de références des fractions protéiques avec le système Capillarys^®, une série de 120 sérums provenant d’individus sains a été analysée : 60 hommes et 60 femmes âgés de 18 à 70 ans.
Enfin, les performances des deux appareils ont été étudiées. La reproductibilité intra-essai a été testée en répétant 15 fois l’analyse de trois échantillons le même jour à l’intérieur d’une même série, et la reproductibilité inter-essai en répétant 15 fois l’analyse des trois échantillons au sein de séries différentes étalées sur 48 heures. La sensibilité et la spécificité des deux méthodes ont été déterminées à partir de l’ensemble des 1 091 échantillons. La durée d’un test, son coût global ainsi que la facilité d’utilisation du système ont également été analysés.

Résultats

Les valeurs de référence obtenues sur le Capillarys^® à partir de la population d’individus sains sont les suivantes : albumine : 50,5-62,7 % ; α1-globulines : 4,8-8,3 % ; α2-globulines : 7,1-12,2 % ; β-globulines : 10,2-14,9 % ; γ-globulines : 10,2-18,5 %. Nous n’avons observé aucune différence significative entre les hommes et les femmes. En ce qui concerne les corrélations entre le Capillarys^® et l’Hydrasys^® pour les différentes fractions, la pente (a) et l’ordonnée à l’origine (b) étaient respectivement de 0,97 et 6,39 pour l’albumine (R² : 0,90) ; 2,28 et 0,80 pour les α1-globulines (R² : 0,62) ; 1,19 et – 2,53 pour les α2-globulines (R² : 0,82) ; 1,02 et 1,43 pour les β-globulines (R² : 0,64) ; 1,01 et 1,74 pour les γ-globulines (R² : 0,94). Les figures 1 et 2 représentent les corrélations (MedCalc^®, Bland Altman et régression Passing et Bablok) entre l’Hydrasys^® et le Capillarys^® concernant les valeurs des fractions α1-globulines et γ-globulines.
La sensibilité et la spécificité de l’électrophorèse sur gel d’agarose (Hydrasys^®) sont respectivement de 93,5 et de 98,9 %. La sensibilité et la spécificité de l’électrophorèse capillaire avec la résolution maximale sont respectivement de 97,2 et de 93,7 %. La sensibilité et la spécificité de l’électrophorèse capillaire avec résolution réduite sont respectivement de 80,7 et de 98,9 %.
Les performances des deux techniques en terme de reproductibilité sont comparables. En effet, la reproductibilité inter- et intra-essai, toute fraction confondue, de l’électrophorèse capillaire donne un coefficient de variation < 4 %, contre < 5 % pour l’électrophorèse en gel d’agarose. Les coefficients de variation concernant le Capillarys^® étaient de 2,2 % pour l’albumine ; 3,9 % pour les α1-globulines ; 3,2 % pour les α2-globulines ; 2,9 % pour les β-globulines et 1,8 % pour les γ-globulines.

Discussion

Corrélation des fractions protéiques entre les deux techniques Capillarys^® et Hydrasys^®

Sur le plan quantitatif, il faut souligner que comparativement à l’agarose, l’électrophorèse capillaire donne des résultats en moyenne 2,2 fois supérieurs pour les α1-globulines. Cela peut s’expliquer en partie par la haute concentration en acide sialique de l’α1-glycoprotéine acide, qui interfèrerait avec la liaison aux colorants utilisés dans les électrophorèses sur gel d’agarose. L’électrophorèse capillaire ne présente pas ce problème de détection. Notons que ce phénomène a déjà été décrit pour le Paragon^®, Beckman [5]. Une autre explication possible serait l’absence d’un parfait retour à la ligne de base avec la version du software utilisé pour le Capillarys^®. Notons qu’entre-temps, une nouvelle version de software a été proposée avec une possible correction de ce phénomène. Par ailleurs, soulignons que la corrélation avec les β-globulines est également pauvre (R² : 0,64). Une explication pourrait être que les β-lipoprotéines migreraient différemment selon les deux techniques (entre α2 et β pour le Capillarys^®, et β pour l’Hydrasys^®). La corrélation des autres fractions protéiques (albumine, α2-globulines, et γ-globulines) est plus acceptable.

Choix de la sensibilité du Capillarys^®

Nous constatons qu’avec la résolution maximale du Capillarys^®, le nombre de profils faux-positifs est plus élevé (N = 61) qu’avec la technique en gel d’agarose (N = 10). En diminuant la résolution, on diminue le nombre de faux positifs par le Capillarys^® (N = 10) en améliorant la spécificité. En revanche, cette réduction de résolution entraînerait également une diminution des vrais positifs (N = 106 à N = 88), et donc de la sensibilité. Par conséquent, il apparaît préférable d’utiliser la plus haute résolution du software du Capillarys^®, afin de favoriser la sensibilité à la spécificité.

Profils particuliers

Les profils électrophorétiques obtenus sur le Capillarys^® et sur l’Hydrasys^® sont comparables pour les cinq échantillons sélectionnés : bisalbuminémie, déficit en α1-anti-trypsine, réaction inflammatoire, présence de fibrinogène (plasma) et syndrome néphrotique. Le fibrinogène migre au niveau de la zone des β-globulines avec les deux techniques (tandis qu’il n’apparaît pas dans le Paragon^® [6]).

Détection de pics mono- ou oligoclonaux

La présence de composés monoclonaux nets est détectée de manière identique par les deux techniques. Néanmoins il convient de noter que même en haute résolution, trois petits composés monoclonaux n’ont pas été détectés par la technique Capillarys^®. Ceux-ci se situaient en début de zone γ. Par ailleurs, en Hydrasys^®, sept composés oligoclonaux n’ont pas été détectés.

Reproductibilité et aspects fonctionnels

Les reproductibilités intra- et inter-essais du Capillarys^®, toutes fractions protéiques confondues, sont comparables à celles du Paragon^® 2000 (CZE) (CV < 5,3 %) [5, 7]. Concernant l’aspect pratique de la technique Capillarys^®, la convivialité et la facilité d’utilisation du software constituent des atouts non négligeables pour cette technique. De plus, cette méthode automatisée d’électrophorèse permet un gain de temps majeur : 80 échantillons/h contre 54 échantillons/1 h 1/2 (incluant la lecture des échantillons par l’Hyrys) pour l’Hydrasys^® (cadences mesurées par le laboratoire). L’utilisation de codes-barres pour les échantillons sur le Capillarys^® assure une diminution du risque d’erreur d’identification des tubes, et un nouveau gain de temps en faveur de cette technique. Une validation rapide des résultats peut être réalisée. La gestion d’une base de données pour chaque patient analysé est également possible avec le software du Capillarys^®.

Le coût d’un test, en terme de réactif, avec le Capillarys^® est sensiblement identique à celui observé avec l’Hydrasys^® (environ 0,6 €/test). Cependant, le coût global incluant le temps de personnel devrait, quant à lui, être inférieur d’un facteur proche de 20 % (sur base des calculs établis par le laboratoire).

Conclusion

L’électrophorèse capillaire des protéines spécifiques par le Capillarys^® (Sebia) présente une fiabilité proche de l’électrophorèse en gel d’agarose Hydrasys^® (Sebia). En effet, en résolution maximale, la méthode Capillarys^® présente une sensibilité et une spécificité de 97,2, et 93,7 %, respectivement, alors que la méthode Hydrasys^® affiche des performances de sensibilité et de spécificité de 93,5 et 98,9 %, respectivement. La diminution de la résolution des tracés est possible mais au détriment de la sensibilité, ainsi que le démontre notre étude. Notons que la seule façon de ne perdre aucun profil positif (oligoclonal, fin monoclonal et monoclonal) serait de réaliser une immunofixation pour tous les échantillons [1], ce qui est techniquement possible mais difficilement applicable en routine clinique. Les renseignements cliniques permettant de suspecter une anomalie hématologique, ainsi que la présence d’une hypogammaglobulinémie amènent le biologiste le plus souvent à réaliser des examens complémentaires (immunofixation).

Remerciements. Les auteurs souhaitent remercier la firme Sebia Belgique pour l’aide qu’elle leur a apportée dans la réalisation de ce travail.

Références

1. Meunier C. La détection et la caractérisation des composés monoclonaux difficiles dans le sérum : techniques sur gel ou électrophorèse capillaire. Ann Biol Clin 1999 ; 57 : 605-10.

2. Blessum C, Jeppsson O, Aguzzi F, Bernon H, Bienvenu J. L’électrophorèse capillaire : principe et applications au laboratoire de biologie clinique. Ann Biol Clin 1999 ; 57 : 643-57.

3. Keren DF. Capillary zone electrophoresis in the evaluation of serum protein abnormalities. Am J Clin Pathol 1998 ; 110 : 248-52.

4. Thormann W, Wey A, Lurie IZ, Berber H, Byland C, Malik N. Capillary electrophoresis in clinical and forensic analysis. Recent advances and breakthrough to routine applications. Electrophoresis 1999 ; 20 : 3203-36.

5. Bossuyt X, Schiettekatte G, Bogaerts A, Blanckaert N. Serum protein electrophoresis by CZE 2000 clinical capillary electrophoresis system. Clin Chem 1998 ; 44 : 749-59.

6. Bossuyt X, Mariën G. False-negative results in detection of monoclonal proteins by capillary zone electrophoresis: a prospective study. Clin Chem 2001 ; 47 : 1477-9.

7. Jolliff CR, Blessum C. Comparison of serum protein electrophoresis by agarose gel and capillary zone electrophoresis in a clinical setting, Electrophoresis 1997 ; 18 : 1781-4.