ARTICLE
Aoyagi et al. [2] ont montré la présence d'un variant
fucosylé de l'AFP dans le sérum des patients porteurs d'un
carcinome hépatocellulaire, ce variant étant absent ou faiblement
présent chez les patients atteints de cirrhose ou d'hépatite
chronique. La détermination de ce variant fucosylé permet
d'améliorer ses performances diagnostiques, en particulier en cas
d'augmentation modérée de l'AFP totale.
L'AFP est une glycoprotéine, de masse molaire de 69 000 g.mol-
1 qui se caractérise par une grande hétérogénéité
moléculaire liée à sa taille, à sa charge
électrique et à sa structure glycanique. La microhétérogénéité
de l'AFP humaine a été observée chez l'homme en présence
de différentes lectines, en particulier la lectine de lentille
(Lens culinaris agglutinin A ou LCA) [3]. L'électrophorèse
d'affinité en gel d'agarose traité par la LCA couplée
à la technique d'immunoblotting sur membrane de nitrocellulose
permet d'isoler spécifiquement l'AFP fucosylée (AFP-F) avec
une bonne sensibilité [4-6]. Cette technique met en évidence
trois isoformes d'AFP dénommées L1, L2 et L3 d'après
la classification de Taketa et Hirai [4] et différents profils
électrophorétiques sont obtenus selon les situations physiopathologiques.
Les sérums de nouveau-nés se caractérisent par la
présence de L1 (isoforme sécrétée par le foie
fœtal), de même que les sérums provenant de patients
atteints de cirrhose. Les sérums provenant de patients atteints
de carcinome hépatocellulaire se caractérisent par la présence
des isoformes L1 et L3 (seule forme fucosylée) et les sérums
provenant de patients atteints de tumeurs germinales par la présence
des isoformes L2 (sécrétées par la vésicule
vitelline) et L3 [7].
Le but de ce travail était de mettre au point une méthode
de dosage de l'AFP-F performante, facile à mettre en œuvre
et peu onéreuse. La méthode présentée dérive
de celle décrite par Taketa et al. [5], mais diffère
principalement par le mode de fixation des anticorps sur la membrane de
nitrocellulose (adsorption par simple séchage) et par le système
de révélation (anticorps biotinylé, streptavidine
marquée à la phosphatase alcaline et solution de NBT/BCIP).
Par ailleurs, l'AFP-F a été dosée chez des patients
atteints de carcinome hépatocellulaire (sous forme d'un index de
fucosylation) et comparée à celle des patients atteints
de pathologies hépatiques non malignes.
Matériel et méthodes
Échantillons testés
Les sérums de 39 patients provenant du service d'hépato-gastro-entérologie
de l'Hôtel-Dieu de Lyon ont été analysés. Les
prélèvements ont été réalisés
sur tube sec avec gel séparateur. Les patients ont été
répartis en deux groupes :
- Le premier groupe incluait 16 malades (âge moyen 73 ± 6
ans, extrêmes 62-83 ans) porteurs de carcinome hépatocellulaire
à différents stades de la maladie, ayant évolué
sur une cirrhose (d'origine virale B ou C, éthylique ou secondaire
à une hémochromatose). Parmi les 16 patients, 10 n'avaient
pas de traitement au moment des dosages.
- Le deuxième groupe ou groupe témoin (âge moyen
58 ± 13 ans, extrêmes 34-75 ans) incluait 23 malades atteints
de pathologies hépatiques non malignes dont 21 cirrhoses (d'origine
virale B ou C ou auto-immune) et 2 hépatites chroniques.
La différence d'âge entre les deux groupes est significative
(p < 0,05).
Méthodes de dosage
Le dosage de l'AFP a été réalisé sur sérums
frais par la technique de immunochimiluminescente automatisée (ACS
180®, Bayer Diagnostics). Avec cette méthode de
dosage, la valeur de référence chez les individus en bonne
santé est inférieure à 6 µg/l.
Le dosage de l'AFP-F a été effectué sur sérum
congelé à - 20 °C avec la méthode mise au point
au laboratoire, méthode dont les différentes étapes
sont schématisées sur la figure
1. L'électrophorèse est réalisée en
gel d'agarose (Indubiose®, IBF) à 1 % (p/v) de 1
mm d'épaisseur contenant 0,20 mg/ml de LCA-A (Lens culinaris
agglutinine A, ICN). On dépose 4 µl de sérum (5 dépôts
par plaque) avec un temps de contact de 5 min pour la pénétration
de l'échantillon dans le gel. L'électrophorèse, réalisée
tout de suite après, est effectuée dans un tampon véronal
(0,05 M pH 8,6) à 200 volts (10-20 mA/plaque) entre 10-15 °C
pendant 1 h 15 à 1 h 30. Après, les protéines sont
transférées sur une membrane de nitrocellulose (membrane
NC, Sartorius Amilabo) imprégnée d'anticorps de mouton anti-AFP
humaine (Immunotech) à 100 µg/ml en tampon TBS (tampon tris
0,02 M pH 7,5 et NaCl 0,5 M) et séchée à l'air libre
pendant au moins une nuit. Le transfert se fait par simple contact entre
le gel d'agarose et la membrane pendant 30 min. La membrane est ensuite
lavée 2 fois 10 min avec du tampon de lavage (NaCl 0,5 M et tween
20 à 0,05 %) pour éliminer les protéines non fixées
spécifiquement. La membrane est ensuite saturée avec un
tampon TBS contenant 30 % de lait écrémé en poudre
(agitation pendant 30 min à température ambiante). Les deux
étapes immunologiques comprennent une première incubation
de 30 min à 37 °C avec l'anticorps de lapin anti-AFP humaine
(Dako), dilué au 1/1 000e dans du tampon TBS contenant
1 % de lait écrémé ; après lavage, la deuxième
réaction immunologique avec l'anticorps anti-lapin biotinylé
(Spéci) dilué au 1/10e dans le tampon TBS est
réalisée pendant 30 min à 37 °C. Après
lavage, la membrane est mise en contact avec une solution de streptavidine
couplée à la phosphatase alcaline (Spéci) pendant
15 min à 37 °C. Trois lavages sont ensuite réalisés
: deux avec le tampon de lavage et le dernier avec un tampon TBS pH 9,5
(pH permettant d'amplifier l'intensité de la coloration). L'activité
enzymatique est révélée avec un chromogène
au NBT/BCIP (kit de révélation Spéci prêt à
l'emploi) pendant 5 à 10 min à l'obscurité et à
température ambiante sous agitation constante. Après rinçage
de la membrane à l'eau distillée et séchage, l'intensité
des bandes est mesurée avec un densitomètre CS-9000 Shimadzu
à 580 nm en mode réflexion (sur bandes non transparisées).
La surface relative de chaque pic est exprimée en unités
arbitraires et les résultats sont exprimés par rapport à
l'AFP totale : soit en valeur absolue (µg/l), soit sous forme d'un
index de fucosylation : index fucosylation % = AFP retenue (µg/l)
x 100/AFP totale (µg/l). On détermine le pourcentage qui correspond
à la fraction L3 de la classification de Taketa et Hirai [4].
Étude statistique
Étant donné le faible nombre d'échantillons analysés,
la comparaison des moyennes entre les patients atteints de carcinome hépatocellulaire
(ne recevant aucun traitement) et les patients ayant une hépatopathie
non maligne a été effectuée avec le test non paramétrique
de Wilcoxon. Les valeurs moyennes des paramètres ont été
calculées avec une déviation standard. Le seuil de signification
retenu est de 0,05.
Les performances diagnostiques de l'AFP-F dans le diagnostic biologique
du carcinome hépatocellulaire ont été évaluées
par le calcul de la sensibilité, de la spécificité
et des valeurs prédictives positive et négative. Le seuil
de positivité de l'index de fucosylation a été choisi
à 24 % (moyenne + 2 déviations standard par rapport à
la moyenne du groupe témoin).
Résultats
Performance de la technique
Les limites de linéarité ont été déterminées
à l'aide d'un gel sans lectine (à partir d'une seule bande),
par dilutions successives d'un sérum ayant une concentration d'AFP
de 300 µg/l. La relation entre la surface des pics et la concentration
d'AFP est linéaire entre 0 et 200 µg/l. En ce qui concerne
le domaine d'analyse de l'AFP-F, les dilutions successives de 2 sérums
de patients ayant respectivement 28 et 48 % d'AFP-F ont montré
une bonne concordance de résultats jusqu'à 20 µg/l
; pour les valeurs inférieures à 20 µg/l, la mesure
est possible en effectuant 2 dépôts successifs de l'échantillon.
L'imprécision a été déterminée pour
la reproductibilité intra-essai, à partir de 10 mesures
consécutives (sur 2 gels différents) avec deux sérums
(sérums nos 1 et 2) présentant un pourcentage
d'AFP fucosylée différent (fractions L3 respectivement à
44,6 et 32,0 %), et pour la reproductibilité inter-essai, à
partir d'un seul sérum (sérum n° 3 avec fraction L3
à 24,0 %) dosé dans 9 séries différentes.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau
1. Les coefficients de variations (CV) calculés sur les
fractions L1 et L3 sont inférieurs à 7 % en intra-essai
et à 11 % en inter-essai.
La plus petite quantité d'AFP donnant une bande visible (correspondant
au seuil de détection) est de 5 µg/l (soit 20 pg par bande).
Résultats obtenus chez les patients
Les résultats d'AFP totale, d'AFP-F en µg/l et d'AFP-F sous
forme d'index de fucosylation, obtenus dans le groupe carcinomes hépatocellulaires
(10 patients ne recevant aucun traitement) et dans le groupe témoin
(23 patients), sont rassemblés dans le tableau
2. Les valeurs des index de fucosylation d'une part chez les patients
atteints de carcinome hépatocellulaire (6 patients traités
et 10 non traités) et d'autre part chez les patients atteints de
pathologies non tumorales sont représentées sur la figure
2.
Les moyennes d'AFP totale et d'AFP-F exprimées en µg/l sont
significativement plus élevées dans le groupe des carcinomes
hépatocellulaires non traités que dans le groupe témoin
(p = 0,03 et 0,01 respectivement). Mais les valeurs sont très dispersées
aussi bien dans le groupe carcinomes hépatocellulaires que dans
le groupe témoin. Dans le cas des patients traités (résultats
ne figurant pas dans le tableau), les concentrations d'AFP totale et d'AFP-F
peuvent atteindre respectivement 40 160 µg/l et 26 505 µg/l.
Lorsque l'AFP-F est exprimée sous forme d'index, la différence
significative entre les deux groupes est plus importante (36 % ±
18 % pour les carcinomes hépatocellulaires versus 12 % ±
6 % pour le groupe témoin, p < 0,001). L'expression des résultats
sous forme d'index est donc préférable.
Dans le tableau 3, sont
rassemblées les valeurs diagnostiques comparées de l'AFP
totale, de l'index de fucosylation et de l'association AFP totale et index
de fucosylation. L'association AFP (seuil de 100 µg/l) et index de
fucosylation (24 %) permet d'obtenir la meilleure spécificité
(100 %) et les meilleures valeurs prédictives positive (100 %)
et négative (88 %).
Discussion
Le carcinome hépatocellulaire est le plus fréquent des
cancers primitifs du foie (90 %) et l'un des cancers les plus répandus
dans le monde. Il est responsable d'au moins un million de décès
par an dans le monde et pose dans certains pays d'Afrique et d'Asie un
vrai problème de santé publique. En France, l'incidence
annuelle est faible, de l'ordre de 10 pour 100 000 habitants, mais l'épidémie
croissante d'hépatites virales C fait craindre une augmentation
importante des cas de carcinomes hépatocellulaires dans les prochaines
années. Dans 90 % des cas, il se développe sur un foie cirrhotique.
La précocité du diagnostic du carcinome hépatocellulaire
dans les populations à risque (hépatites chroniques et cirrhoses)
constitue l'élément pronostique majeur. L'AFP est actuellement
le marqueur biologique le plus utilisé, mais la détermination
de sa concentration sérique reste décevante en raison de
son manque de sensibilité et de spécificité chez
les sujets à risque.
Afin d'améliorer la performance diagnostique de ce marqueur,
plusieurs équipes se sont intéressées à la
microhétérogénéité de la molécule
d'AFP et ont proposé la détermination de l'AFP-F dont la
synthèse est accrue dans les carcinomes hépatocellulaires.
La méthode de dosage de l'AFP-F présentée ici,
inspirée de celle de Taketa et al. [5] présente une
bonne sensibilité (dosage de l'AFP-F à partir d'une concentration
en AFP totale de 5 µg/l) et une précision satisfaisante malgré
les différentes étapes manuelles (CV intra-essai et inter-essai
inférieurs respectivement à 7 et 11 %). Par ailleurs, la
méthode décrite couvre une large gamme de concentrations
d'AFP-F, de 20 à 200 µg/l. Les modifications, par rapport
à la méthode de Taketa et al. [5], portent essentiellement
sur deux points, la préparation des membranes et le système
de révélation du complexe antigène-anticorps. La
préparation des membranes de nitrocellulose « coatée
» est simplifiée ; l'adsorption des anticorps sur les membranes
par séchage à l'air pendant une nuit remplace la procédure
de fixation proposée par ces auteurs (fixation par des vapeurs
de glutaraldéhyde suivie d'une neutralisation par du borohydrure
de sodium). Par ailleurs, le système anticorps marqué à
la peroxydase-diaminobenzidine utilisé par Taketa et al.
[5] est remplacé par un système anticorps biotinylé-streptavidine
marquée à la phosphatase alcaline et chromogène au
NBT/BCIP. Ce système permet une amplification du signal par fixation
d'un grand nombre de molécules de streptavidine sur l'anticorps
biotinylé.
La méthode présentée existe aussi sous forme de
trousse prête à l'emploi (trousse Wako) évaluée
par Shimizu et al. [6]. Dans la trousse Wako, l'anticorps est marqué
à la peroxydase et le substrat chromogène est composé
d'eau oxygénée, NBT, phénol et NAD réduit.
L'utilisation de cette trousse permet de réduire les étapes
de préparation (gel d'agarose, membranes de nitrocellulose «
coatées » et tampons prêts à l'emploi), mais
présente l'inconvénient d'être beaucoup plus onéreuse.
En ce qui concerne les résultats obtenus
chez les patients atteints de différentes pathologies hépatiques
cancéreuses et non cancéreuses, l'exploitation statistique
des résultats a montré que le pourcentage d'index de fucosylation
était significativement plus élevé dans le groupe
des carcinomes hépatocellulaires non traités que dans le
groupe avec pathologies non cancéreuses. Il faut noter que, pour
l'un des patients, deux dosages réalisés à trois
mois d'intervalle ont montré une discordance, avec un index de
fucosylation à 27 % lors du premier dosage et à 16 % lors
du deuxième dosage. Ce patient présentait des lésions
nodulaires à l'échographie et des concentrations décroissantes
d'AFP. La biopsie hépatique n'a pas affirmé le diagnostic
de malignité, mais a mis en évidence des modifications dysplasiques
à grandes cellules ; chez ce patient, l'index de fucosylation ne
permet pas de conclure quant au diagnostic.
Bien que réalisée sur un petit nombre de patients, cette
étude confirme les données de la littérature, à
savoir une bonne spécificité et une sensibilité moyenne
de l'index de fucosylation. En effet, selon les auteurs, les spécificité
et sensibilité varient respectivement entre 78 et 100 % et 36 et
80 % [7-10].
En ce qui concerne le seuil de positivité, la valeur de 24 %
est supérieure à celles établies dans les différentes
séries publiées où aucun seuil n'est supérieur
à 18 % en dehors de l'étude de Wang et al. [9]. Cela
peut s'expliquer par le choix de la population témoin dans les
différentes études (absence de carcinome hépatocellulaire
dans les six mois à deux ans après le dosage). Dans notre
étude, deux patients étaient particulièrement surveillés
avec des dosages répétés d'AFP, tous les deux à
trois mois en raison des fluctuations importantes de leur concentration
d'AFP. Ces patients présentaient les index de fucosylation les
plus élevés parmi les cirrhotiques (20 et 19 %). Par ailleurs,
les index de fucosylation ont été déterminés
chez deux patients atteints d'hépatite B aiguë (dont une hépatite
chronique réactivée) ; ils étaient élevés
(36 et 33 % respectivement). L'augmentation de la fucosylation de l'AFP
au cours de certaines hépatites aiguës, signalée par
plusieurs auteurs [10, 11], serait due à la dédifférenciation
des hépatocytes consécutive à la régénération
cellulaire très importante.
L'analyse d'un plus grand nombre de patients avec la méthode
présentée permettrait de compléter cette étude.
De plus, il serait intéressant, lors d'une étude prospective,
d'étudier la fucosylation de l'AFP chez des patients cirrhotiques,
qui présentent un risque accru de carcinome hépatocellulaire,
pour détecter une augmentation précoce de ce marqueur.
Enfin, la détermination de l'index de fucosylation pourrait présenter
un intérêt pronostique chez les patients atteints de carcinome
hépatocellulaire avant la mise en route d'un traitement. En effet,
récemment, Aoyagi et al. [12] ont montré que les
patients avec un index de fucosylation supérieur au seuil retenu
avaient une moyenne de survie significativement plus courte que ceux avec
un index inférieur à ce seuil.
CONCLUSION
La méthode de dosage de l'AFP-F présentée, associant
électrophorèse en gel d'agarose et immunoblotting, bien
que nécessitant plusieurs étapes, est facile à mettre
en œuvre, sensible et peu onéreuse. La détermination
de l'AFP-F sous forme d'index de fucosylation confirme les résultats
précédemment publiés (index plus élevés
chez les patients atteints de carcinome hépatocellulaire par rapport
aux patients atteints d'hépatopathies non cancéreuses).
De plus, l'association du dosage de l'AFP (100 µg/l) et de l'index
de fucosylation (24 %) permet d'améliorer la spécificité
et la valeur prédictive positive par rapport aux dosages isolés
d'AFP et d'index de fucosylation, mais la sensibilité n'est pas
améliorée.
L'application de la méthode présentée à
un plus grand nombre de patients permettrait de compléter cette
étude ; par ailleurs, l'étude prospective de la fucosylation
de l'AFP, chez des patients cirrhotiques qui présentent un risque
accru d'évolution vers le carcinome hépatocellulaire serait
intéressante.
Article reçu le 2 mars 1999, accepté le 1er septembre
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