ARTICLE
Les staphylocoques constituent un problème préoccupant
en épidémiologie hospitalière. Staphylococcus
aureus est responsable de septicémies et d'infections nosocomiales
graves, notamment dans les unités de soins intensifs et dans les
services de moyens et longs séjours. Ces infections sont associées
à une morbidité élevée [1]. De plus, le nombre
croissant de souches multirésistantes aux différentes classes
d'antibiotiques réduit significativement les possibilités
de traitement. C'est pourquoi une différenciation rapide et spécifique
de S. aureus des autres espèces de staphylocoques s'avère
indispensable au diagnostic microbiologique, et aux choix thérapeutiques
souvent décidés en urgence.
La staphylocoagulase, ou coagulase libre, est une protéine
extracellulaire caractéristique de S. aureus, à l'exception
de certaines souches d'origine animale telles que S. intermedius,
S. hyicus, S. delphini qui possèdent également
cette coagulase. En présence de prothrombine humaine, la staphylocoagulase
forme un complexe stœchiométrique appelé « staphylothrombine
» [2]. Ce complexe est capable de cliver son substrat naturel, le
fibrinogène, et différents substrats ayant une affinité
de type thrombine-like.
La méthode de référence pour identifier
S. aureus est la recherche de la coagulase libre par coagulation
du plasma citraté de lapin [3]. Cette méthode, comme la
plupart des galeries d'identification biochimique nécessite 18
à 24 h d'incubation. Le but de notre travail a été
le développement d'une méthode d'identification simple et
rapide de S. aureus, basée sur la détection du complexe
« staphylothrombine » à l'aide d'un substrat chromogène
[4]. Cette méthode est comparée à la recherche de
la coagulase en plasma citraté de lapin.
Matériel
et méthodes
Souches bactériennes
Deux cent quarante-deux souches de staphylocoques ont été
collectées (tableau 1)
dans quatre hôpitaux : hôpital Louis-Mourier (Colombes), centre
hospitalier de Versailles André-Mignot (Le Chesnay), hôpital
du Bocage (Dijon), hôpitaux universitaires de Strasbourg. Ces souches
provenaient d'infections superficielles ou profondes. Elles ont été
conservées congelées à 80 °C en bouillon
cœur-cervelle additionné de 10 % de glygérol. Une souche
de S. intermedius fournie par la collection de l'Institut Pasteur
de Paris (CIP 8160) a été incluse dans l'étude pour
vérifier la spécificité du test vis-à-vis
de souche possédant une coagulase et n'appartenant pas à
l'espèce S. aureus.
Identification des souches hospitalières
La coagulase libre a été recherchée
sur l'ensemble des souches par la méthode de coagulation du plasma
citraté de lapin. Cette méthode, considérée
comme la méthode de référence, a été
interprétée après 2 h, 4 h et 18 h d'incubation à
37 °C [3]. L'identification a été complétée
par la réalisation de deux galeries biochimiques (Rapidec®
Staph [5] et Api® Staph [6] ou ID 32® Staph
[7]), et d'un test d'agglutination sur lame (Pastorex Staph®
ou Pastorex® Staph-plus [8]).
Identification chromogénique
Deux millilitres de suspension bactérienne sont
préparés dans un milieu de culture de type peptone-glucose
enrichi, à partir de colonies fraîchement isolées
sur gélose trypticase-soja, additionnée ou non de 5 % de
sang de mouton (Becton-Dickinson). La turbidité de cette suspension
est ajustée à 2 unités Mac Farland (soit 6 x 108
ufc/ml) à l'aide d'un turbidimètre. Le milieu de culture
est supplémenté par des inhibiteurs de protéases,
héparine (Calciparine®, Sanofi) et aprotinine (Pentapharm),
pour neutraliser l'activité d'éventuelles pseudocoagulases.
La réaction est réalisée en double
dans les puits d'une microplaque (Maxisorp Immuno-module, Nunc) comme
suit : 70 ml de la suspension bactérienne sont incubés avec
70 ml de prothrombine humaine, et 70 ml de substrat chromogène
en solution. Après 1 à 2 h d'incubation à 37 °C,
l'intensité de la coloration jaune de chaque puits est comparée
à l'œil nu à une gamme de couleurs, et mesurée
à 405 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Les puits
témoins négatifs sont incubés avec 70 ml de milieu
de culture stérile.
Substrats
chromogènes
L'affinité du complexe staphylothrombine pour 15
substrats synthétiques chromogènes a été comparée
avec la méthode décrite ci-dessus. Ces substrats, développés
par le département de chimie de Serbio, sont commercialisés
comme produits de recherche par Diagnostica Stago (Asnières, France).
Ils sont synthétisés sur la base de la séquence d'acides
aminés (AA) située au niveau du site de clivage du substrat
naturel de la thrombine [9]. Ces substrats tripeptidiques ont une séquence
proche de celle du Chromozym TH [4]. Elle est de type : R-AA1-AA2-AA3-pNA,
R étant un groupement protecteur, et la paranitroaniline (pNA)
le groupement révélateur. La libération du groupement
paranitroaniline provoque l'apparition d'une coloration jaune dans le
milieu réactionnel. Ces substrats ont tous une affinité
thrombine-like.
Détermination des constantes
enzymatiques
du substrat sélectionné
Une gamme de 12 concentrations de 0,04 mM à 0,4
mM de substrat a été préparée dans un tampon
Hepes pH 8,0. Deux solutions de staphylocoagulase purifiée (Diagnostica
Stago) à 6 et 12 unités CNTS/ml ont été réalisées
dans le même tampon. La « staphylothrombine » est générée
dans les puits d'une microplaque (Maxisorp Immuno-module) en mélangeant
70 ml de solution de staphylocoagulase purifiée à 6 ou 12
unités CNTS/ml et 70 ml de prothrombine humaine purifiée
(Diagnostica Stago) à 90 mg/ml. Un volume de 70 ml de chacune des
12 solutions de substrat est immédiatement ajouté. L'absorbance
à 405 nm est mesurée toutes les 2 min pendant 20 min, puis
toutes les 15 min pendant 1 h, et toutes les 30 min pendant 2 h. Les constantes
Km et Vm sont déduites des représentations
de Lineweaver-Burk-Dixon pour chacune des deux concentrations de staphylocoagulase.
Résultats
Choix du substrat chromogène
Nous avons comparé les 15 tripeptides en appliquant
la méthode d'identification chromogénique à 4 souches
de S. aureus : 2 souches sensibles à la méticilline
(SASM), 2 souches résistantes (SARM) et 1 souche de S. epidermidis.
Les courbes d'absorbance des deux souches les plus représentatives
(1 SASM, 1 SARM) sont présentées sur la figure
1. Parmi les 15 substrats étudiés, l'intensité
d'hydrolyse, l'affinité enzymatique et la vitesse maximale sont
les plus élevées pour le substrat SQ 149. Ce résultat
est indépendant de la sensibilité à la méticilline
des souches de S. aureus. En revanche, la cinétique d'hydrolyse
de ce substrat est différente entre les souches sensibles et les
souches résistantes. L'hydrolyse du SQ 149 est maximale dès
1 h pour la souche sensible, à l'inverse de la souche résistante
pour laquelle 2 h d'incubation sont nécessaires. Aucune coloration
jaune n'apparaît pour la souche de S. epidermidis.
Les constantes enzymatiques du complexe « staphylothrombine
» généré à partir de la staphylocoagulase
purifiée, pour le substrat SQ 149, sont indiquées dans le
tableau 2.
Évaluation de la méthode
chromogénique
La sensibilité et la spécificité du
substrat SQ 149 ont été déterminées sur 160
souches de S. aureus, 82 souches de staphylocoques à coagulase
négative et 1 souche de S. intermedius.
Il apparaît (tableau
3) que l'ensemble des 160 souches de S. aureus, identifiées
par la méthode de référence et par les méthodes
disponibles sur le marché, donne une réponse positive avec
le test chromogénique. La souche pour laquelle la recherche de
la coagulase par la méthode de référence est négative,
et qui a été identifiée comme un S. aureus
par deux galeries biochimiques (Rapidec® Staph et Api®
Staph) et un test d'agglutination (Pastorex Staph-plus®),
est détectée par notre méthode. De plus, le test
chromogénique permet d'identifier une souche de S. aureus
qui n'a montré aucune agglutination par le test Pastorex Staph-plus®.
Après 2 h d'incubation, 100 % des souches de S. aureus sont
identifiées par notre test ou par la galerie Rapidec®
Staph et 71 % par la méthode de coagulation du plasma citraté
de lapin.
Aucune des 82 souches de staphylocoques à coagulase
négative ne montre de coloration jaune, même après
4 h d'incubation. La souche de S. intermedius incluse dans l'étude
donne une positivité retardée (4 h).
Temps d'incubation
Les temps d'incubation nécessaires à l'apparition
d'une coloration jaune pour les souches de S. aureus (tableau
4) montrent que 94,7 % des SASM sont détectés après
1 h d'incubation pour seulement 52,3 % des SARM. Parmi les SARM, 98,4
% des souches sont identifiés après 2 h d'incubation, et
1 souche est révélée après 4 h.
Performances de la méthode
Les performances du test en 2 h sont définies en
termes de sensibilité, spécificité, valeurs prédictives
négative et positive dans le tableau
5. La répétabilité et la reproductibilité
de la méthode, effectuées sur 6 et 2 souches de S. aureus
respectivement, sont excellentes (tableaux
6 et 7).
Discussion
Nous avons choisi une méthode chromogénique
pour la simplicité de la lecture qui ne nécessite aucun
appareillage supplémentaire. Le groupement chromophore paranitroaniline
des substrats testés présente une bonne solubilité
et une absorbance importante à 405 nm, parfaitement adaptées
à une méthode en phase liquide. Nous avons sélectionné,
parmi 15 tripeptides thrombine-like dont la séquence varie au niveau
de chaque acide aminé, celui qui avait la meilleure affinité
pour le complexe « staphylothrombine », et permet l'identification
de S. aureus en 2 h. L'affinité du substrat sélectionné
(SQ 149) semble être corrélée avec son affinité
pour la thrombine humaine. En effet, ce peptide présente également
l'affinité la plus élevée pour la thrombine humaine.
La réaction est rendue spécifique de la staphylocoagulase
par ajout d'inhibiteurs de protéases au milieu de culture, comme
l'a montré l'équipe de Wegrzynowicz et al. [10].
S. aureus est l'espèce pathogène dans
le genre Staphylococcus, bien qu'il ait été décrit
certaines espèces responsables de syndromes infectieux parmi les
staphylocoques à coagulase négative (ostéomyélite
à S. lugdunensis [11]). Il est donc nécessaire de
l'identifier rapidement afin d'instaurer une antibiothérapie précoce.
La méthode chromogénique que nous proposons est simple et
ne nécessite aucun test complémentaire. Les résultats
observés permettent de constater que cette méthode est :
rapide (résultats obtenus en 2 h), sensible (99,4 % des souches
de S. aureus sont détectées), spécifique (aucune
des souches de staphylocoques à coagulase négative ne présente
de fausse positivité). De plus, la souche de S. intermedius,
possédant une coagulase libre, n'est pas confondue avec un S.
aureus dans les conditions du test. Les performances de cette méthode
sont similaires à celles de la galerie Rapidec®
Staph [12]. Le test chromogénique offre un gain de temps de 24
h comparativement à la méthode de référence.
En effet, cette dernière nécessite plus de 2 h d'incubation
pour identifier 30 % des souches de S. aureus, et plus de 4 h pour
10 % d'entre elles.
La sensibilité de notre méthode, contrairement
à celles des tests d'agglutination, n'est pas influencée
par les souches de SARM. Cependant, la moitié de ces souches résistantes
nécessite 2 h d'incubation, à l'inverse des SASM dont la
majorité (94,7 %) est positive après seulement 1 h. Ce phénomène
pourrait s'expliquer par une excrétion plus lente, ou une synthèse
plus faible de la staphylocoagulase chez les SARM, ou encore par un encombrement
stérique plus important lié au polysaccharide.
Nous proposons donc une méthode rapide et simple
permettant l'identification de S. aureus en 2 h. Elle est bien
corrélée à la recherche de la coagulase en plasma
citraté de lapin, aux méthodes biochimiques et aux tests
d'agglutination. Le coût de cette méthode, réalisable
de façon unitaire, est faible car elle ne nécessite aucun
test complémentaire.
Article reçu le 24 juin 1998, accepté le 10
novembre 1998.
REFERENCES
1. Fleurette J. Staphylocoque. La Lettre de l'Infectiologue
1995 ; 10 : 359-60.
2. Kawabata S, Morita T, Iwanaga S, Igarashi H.
Enzymatic properties of staphylothrombin, an active molecular complex
formed between staphylocoagulase and human prothrombin. J Biochem
1985 ; 98 : 1603-14.
3. Sperber WH, Tatini SR. Interpretation of the
tube coagulase test for identification of Staphylococcus aureus.
Appl Microbiol 1975 ; 9 : 502-5.
4. Engels W, Kamps MA, van Boven CP. Rapid and direct
staphylocoagulase assay that uses a chromogenic substrate for identification
of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1981 ; 14 : 496-500.
5. Geary C, Stevens M. A rapid test to detect the
most clinically significant Staphylococcus species. Med Lab
Sci 1991 ; 48 : 99-105.
6. Gemmell CG, Dawson JE. Identification of coagulase-negative
staphylococci with the API Staph system. J Clin Microbiol 1982
; 16 : 874-7.
7. Renneberg J, Rieneck K, Gutschik E. Evaluation
of Staph ID 32 system and Staph-Zym system for identification of coagulase-negative
staphylococci. J Clin Microbiol 1995 ; 33 : 1150-3.
8. Fournier JM, Bouvet A, Mathieu F, et al.
New latex reagent using monoclonal antibodies to capsular polysaccharide
for reliable identification of both oxacillin-susceptible and oxacillin-resistant
Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1993 ; 31 : 1342-4.
9. Martinoli JL, Contant G. New advances in synthetic
substrate design. In : Triplett DA. Advances in coagulation testing
: interpretation and application. Skokie, College of American Pathologists,
1986 : 449-55.
10. Wegrzynowicz Z, Heczko PB, Jeljaszewicz J, Neugebauer
M, Pulverer G. Pseudocoagulase activity of staphylococci. J Clin Microbiol
1979 ; 9 : 15-9.
11. Murdoch DR, Everts RJ, Chambers ST, Cowan IA.
Vertebral osteomyelitis due to Staphylococcus lugdunensis. J
Clin Microbiol 1996 ; 34 : 993-4.
12. Janda WM, Ristow K, Novak D. Evaluation of Rapidec
Staph for identification of Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, and Staphylococcus saprophyticus. J Clin Microbiol
1994 ; 32 : 2056-9.
|
Version imprimable
