ARTICLE
La concentration plasmatique
en homocystéine dépend de l'équilibre entre synthèse
cellulaire hépatique, métabolisme, reméthylation
(figure 1) et libération
dans le compartiment extracellulaire. La synthèse est de 20 mmoles
par jour et seulement 10 µmoles par litre circulent dans le plasma.
Dans le plasma, 70 % de l'homocystéine est lié à
l'albumine, la fraction non liée minoritaire se compose d'homocystéine
libre pour une très faible partie et essentiellement de dimères
homocystéine-homocystéine (homocystine) et homocystéine-cystéine.
La concentration très faible d'homocystéine libre, la redistribution
des fonctions thiols entre dimères et protéines, imposent
de doser l'homocystéine totale plasmatique après réduction
des fonctions thiols [3].
Diverses anomalies du métabolisme de l'homocystéine, héréditaires
ou acquises, impliquant enzymes ou cofacteurs (tableau
1), conduisent à l'accumulation d'homocystéine,
responsable de lésions vasculaires artérielles ou veineuses
[1, 2]. Dans le cas de certains déficits enzymatiques partiels,
un test de charge en méthionine par voie orale (0,1 mg/kg) est
nécessaire, le pic de méthionine est atteint en une heure
suivi d'une augmentation de l'homocystéine totale dont le maximum
se situe entre 4 et 6 h.
Le dépistage des hyperhomocystéinémies modérées,
facteur de risque cardiovasculaire, nécessite des méthodes
d'analyse sensibles. Plusieurs techniques chromatographiques ont été
décrites, associées à différents types de
détection : radioenzymatique, fluorimétrique et électrochimique.
La technique utilisée [4] est une chromatographie liquide avec
détection fluorimétrique après marquage des fonctions
thiols par un composé fluorescent : le SBD-F (ammonium-7-fluoro-2-benzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfonate).
Méthode
Réduction des ponts disulfures
La réduction des ponts disulfures entre dimères et protéines
est effectuée par le tributyl phosphine (Fluka) à 10 % dans
du diméthyl formamide, préparé extemporanément,
pendant 30 min à 4 °C. Cette étape est suivie immédiatement
par la précipitation des protéines par l'acide trichloracétique
à 10 % en présence d'EDTA, 15 secondes au vortex, puis centrifugation
10 min à 4 000 tours par minute.
À partir de l'étape de réduction, tous les réactifs
contiennent de l'EDTA afin d'éviter la réoxydation de l'homocystéine
catalysée par de nombreux métaux, avant dérivatisation
et détection.
Dérivatisation de l'homocystéine
Cette étape consiste à marquer la fonction thiol réduite
par un composé fluorescent, le SBD-F (Sigma), spécifique
des fonctions thiols. Sa réactivité vis-à-vis des
fonctions thiols implique un temps de contact d'une heure dans des conditions
de température et de pH extrêmes (60 °C, pH 9,5) et
il permet d'obtenir un marquage très spécifique, des produits
dérivés très stables et un réactif non fixé
non fluorescent. À 100 µl du surnageant de précipitation,
on ajoute 20 µl de NaOH 1,55 mmol/l, 250 µl de tampon borate
0,125 µmol/l contenant 4 mmol/l d'EDTA, pH 9,5 puis 100 µl de
SBD-F à 1 mg/ml en tampon borate. Après une heure à
60 °C, l'échantillon est centrifugé, le surnageant
peut être gardé 24 h avant d'être chromatographié,
ce qui permet de préparer des séries d'échantillons
et d'automatiser l'étape de chromatographie si l'on utilise un
auto-injecteur.
Chromatographie
Les échantillons sont séparés sur une colonne Sphérisorb
C18, 5 µ, 25 cm (Touzart et Matignon) à pH 2,1, en tampon
phosphate/acétonitrile au débit de 1,8 ml/min (pompe HPLC
9001, détecteur fluorimétrique 9070, Autosampler Marathon,
Intégrateur 4400, Varian). La détection fluorimétrique
est réalisée avec une excitation à 384 nm et une
émission à 516 nm. Les injections sont réalisées
toutes les 7 minutes.
Quatre dérivés fluorescent sont séparés
: la cystéine, la cystéinyl-glycine, l'homocystéine
(temps de rétention : 4 min 20 s) et le glutathion (figure
2).
Calibration
La gamme de calibration, constituée de six points de 0 à
40 µmol/l, est réalisée par dilution d'une solution
mère d'homocystéine (Sigma) à un pool sérique
: les conditions du marquage par le SBD-F et de la chromatographie sont
identiques pour les points de gamme et les échantillons. Le pool
sérique est issu d'un donneur unique du centre de transfusion sanguine,
il est utilisé aussi comme témoin de reproductibilité
interséries.
Conditions de prélèvement
Les conditions de prélèvement et de conservation des échantillons
doivent être rigoureusement standardisées pour l'interprétation
d'études épidémiologiques [5].
Les hématies peuvent synthétiser et relarguer l'homocystéine
dans le plasma, conduisant à des augmentations des taux, significatifs
pour les valeurs normales (< 14 µmol/l). Cela impose le choix
de l'anticoagulant, l'EDTA, et la séparation rapide des hématies
du plasma, dans un délai inférieur à une heure à
température ambiante ou dans un délai inférieur à
4 heures si le prélèvement est conservé dans la glace,
ce qui bloque le métabolisme érythrocytaire.
Le plasma peut être conservé quelques jours à 4
°C ou congelé à - 20 °C pour des délais
plus longs.
Critères de validation
de la technique
La spécificité du dosage a été prouvée
par ajout d'homocystéine à concentration croissante et observation
de l'augmentation du pic concerné. La linéarité a
été calculée de 0 à 100 µmol/l, le coefficient
de corrélation de la droite aire des pics en fonction de la concentration
d'homocystéine est de 0,997 (y = 4,6372 x- 14,18). Répétabilité
(7,5 %) et reproductibilité (4,4 %) ont été calculées
sur le pool sérique. La technique a été corrélée
à une méthode radioenzymatique (Laboratoire de biochimie,
Professeur Kamoun, hôpital Necker, Paris) (figure
3).
Les valeurs de référence de cette technique ont été
calculées sur une population témoin de 16 personnes, âgées
de 30 à 50 ans, à jeun et après épreuve de
charge en méthionine, le délai de prélèvement
choisi est de 5 heures. Elles sont de 11,85 µmol/l à jeun
et de 37,05 µmol/l à T5 et correspondent à la moyenne
plus 2 écarts-types de notre série témoin.
CONCLUSION
Parmi les techniques décrites de dosage de l'homocystéine,
la technique choisie est simple, reproductible, sensible pour la détection
des hyperhomocystéinémies modérées et partiellement
automatisable pour l'adaptation aux grandes séries. Elle permet
de proposer le dépistage systématique de ce facteur de risque
et ce paramètre fait partie du bilan d'investigation des maladies
vasculaires précoces, inexpliquées [6-8] et des thromboses
veineuses ou artérielles du sujet jeune [9, 10]. Il semble également
important de pouvoir dépister ce facteur dans des populations à
haut risque vasculaire.
Une étude de la prévalence de ce facteur de risque est
en cours dans deux groupes de patients : les diabétiques non insulinodépendants
et les insuffisants rénaux. En effet, les hyperhomocystéinémies
modérées peuvent être facilement corrigées
par des mesures diététiques simples ; la supplémentation
vitaminique en acide folique et vitamine B6 normalise les taux d'homocystéine.
REFERENCES
1. Quere I, Tobelem G. Homocystéine, athérosclérose
et thrombose artérielle. Sang Thrombose, Vaisseaux 1993
; 5 : 599-606.
2. Cacoub P, Gatel A, Sbai A, Piette JC, Godeau P. Hyperhomocystéinémies,
athérosclérose et thromboses artérielles et veineuses.
Ann Med Int 1996 ; 147 : 352-60.
3. Ueland PM, Refsum O, Stabler SP, Malinow MR, Anderson A, Allen
A. Total homocysteine in plasma or serum : methods and clinical applications.
Clin Chem 1993 ; 3919 : 1764-79.
4. Ubbink JB, Vermaak WJH, Bissbort S. Rapid high performance
liquid chromatography assay for total homocysteine levels in human serum.
J Chromatogr 1991 ; 565 : 441-6.
5. Ubbink JB, Wermaak WJH, Van der Merwe A, Becker PJ. The effect
of blood sampleaging and food consumption on plasma total homocysteine
levels. Clin Chim Acta 1992 ; 207 : 119-28.
6. Malinow MR, Nieto FJ, Szklo M, Chamless LE, Bond G. Carotid
artery intimal-medial wall thickening and plasma homocysteine in asymptomatic
adults. Circulation 1993 ; 87 : 1107-13.
7. Stampfer MJ, Malinow MR, Willett WC. A prospective study of
plasma homocysteine and risk of myocardial infarction in US phycicians.
JAMA 1992 ; 7 : 877-81.
8. Boushey CJ, Beresford SAA, Omenn GS, Motulsky AG. A quantitative
assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease.
JAMA 1995 ; 274 : 1049-57.
9. D'Angelo SV, Fermo I, D'Angelo A. Investigation of congenital
thrombophilia : a critical evaluation. J Intern Fed Clin Chem 1996
; 8 : 102-8.
10. Fermo A, D'Angelo SV, Paroni R, Mazzola G, Calvi G, D'Angelo
A. Prevalence of moderate hyperhomocysteinemia in patients with early-onset
venous and arterial occlusive disease. Ann Intern Med 1995 ; 123
: 747-53.
|
Version imprimable
