Etude clinico-biologique et moléculaire des mucopolysaccharidoses en Tunisie du centre et du sud

ARTICLE

Patients et méthodes

Patients

Nous avons reçu, dans notre laboratoire, 430 demandes de dépistage des mucopolysaccharidoses à partir d'échantillons urinaires. La suspicion de mucopolysaccharidose était basée sur des arguments cliniques [5], radiologiques et cytologiques évocateurs.

Méthodes

Le dépistage urinaire est réalisé par la méthode de Humbel [6]. Après précipitation des GAG acides, l'échantillon concentré final permet la mesure quantitative des GAG [7] et leur identification par électrophorèse monodimensionnelle sur bande d'acétate de cellulose, préalablement saturée en acétate de baryum 0,05 M, séparant ainsi les différents types de GAG urinaires. Les GAG sont alors révélés par coloration au bleu de 1-9 diméthyl-méthylène [8]. En parallèle, une chromatographie en couche mince des oligosaccharides urinaires est réalisée pour reconnaître des profils pathognomoniques de pathologies voisines (oligosaccharidoses) ainsi que celui de la maladie de Morquio de type B (présence de bandes de galactosides) [9].

Le diagnostic enzymatique de certitude est assuré à partir de leucocytes ou de lymphocytes isolés à partir de 10 ml de sang prélevés sur EDTA. Des leucocytes sont également isolés à partir du sang d'un sujet témoin non apparenté et prélevé en même temps afin de valider l'ensemble du processus préanalytique et analytique. Les mesures d'activités enzymatiques mettent en œuvre des méthodes spectrofluorimétriques utilisant un substrat artificiel, libérant un composé fluorescent : la 4-méthylombelliférone (Sigma Aldrich) [9], des méthodes spectrophotométriques [10] et une méthode utilisant des radio-isotopes [11].

La mise en évidence de l'anomalie moléculaire à l'origine du déficit enzymatique a été réalisée chez un malade atteint de MPS I et deux malades atteints de MPS II. L'ADN génomique a été extrait à partir de 5 ml de sang prélevé sur EDTA. Ces études ont été réalisées au laboratoire de biochimie de l'hôpital Debrousse à Lyon. Pour la MPS I, seules les trois mutations les plus fréquentes dans la population française, Q70X, W402X et P533R, ont été testées selon la méthodologie recommandée par Scott et al. [12]. Les lésions W402X et Q70X ont été détectées après digestion enzymatique et la mutation P533R par technique d'hybridation spécifique d'allèles (ASO). Pour la MPS II, l'analyse moléculaire a été réalisée selon la technique de Froissart et al. [13] (techniques Southern-blot, séquençage, transcription inverse-PCR).

Diagnostic prénatal [14]

Une ponction de trophoblaste a été effectuée chez deux femmes à 10 semaines d'aménorrhée, de deux familles présentant un cas index respectivement de MPS IIIA et de MPS IVA. Ce prélèvement a permis la mesure de l'activité enzymatique avant et après culture.

Une amniocentèse a été effectuée chez deux femmes à 16 semaines d'aménorrhée, de deux familles présentant un cas index respectivement de MPS I et de MPS IIIA. Ce prélèvement a permis d'une part, d'étudier les GAG ainsi que de déterminer l'activité enzymatique de l'iduronate sulfatase et de la bêta-D-glucuronidase dans le surnageant du liquide amniotique et, d'autre part, d'étudier l'ensemble des activités enzymatiques dans les cellules amniotiques cultivées. Pour la MPS II, la détermination du sexe est indispensable.

Résultats et discussion

Sujets diagnostiqués

Les 47 enfants diagnostiqués au cours de cette étude proviennent des régions du centre et du sud tunisien ; 20 sont originaires de la localité de Sousse. Une prévalence des différents types de mucopolysaccharidoses a pu être ainsi évaluée (tableau 1), mais elle est sans doute sous-estimée, car il est probable que nous n'avons pas étudié tous les malades de ces régions par méconnaissance de certains tableaux cliniques peu dysmorphiques. Néanmoins, ces maladies, rares de par le monde, semblent fréquentes dans notre pays [2]. En effet, la prévalence des mucopolysaccharidoses variait de 0,013 pour la MPS VI à 0,100 ‰ pour la MPS III.

Le tableau 1 regroupe les âges extrêmes des enfants malades (1-19 ans) lors de la première consultation ainsi que le degré ou la notion de consanguinité parentale qui a pu être précisée dans 20 cas ; elle est le plus souvent du deuxième degré. Dans 5 cas, le diagnostic a été porté du fait de l'existence d'un cas index dans la fratrie. À part la MPS II (transmission liée à l'X), il existe une prédominance féminine ; le sex ratio est de 0,62 (tableau 2).

À la naissance, aucun des enfants ne présentait d'anomalie à l'examen clinique. Certaines formes (rares) atténuées ont été révélées tardivement (un malade MPS II à 19 ans). Nous n'avons pas retrouvé de formes tardives de MPS III. Nos malades se répartissent en 8 MPS I, 8 MPS II (dont une fille), 21 MPS III dont 7 de type A, 4 de type B, 4 de type C et 1 de type D, 6 MPS IV dont 4 de type A et 4 MPS VI.

Les 8 enfants atteints de MPS I (17 %) présentaient tous un syndrome classique de maladie de Hürler. L'examen ophtalmologique a montré des opacités cornéennes dans 4 cas.

Pour nos 8 patients présentant une maladie de Hunter (MPS II) (17 %), le tableau clinique était très proche de celui de la MPS I, à l'exception de deux formes modérées dans une même fratrie. L'examen ophtalmologique a toujours montré des cornées claires. Nous avons observé un cas, tout à fait exceptionnel, de fille atteinte de forme sévère et chez qui les diagnostics de MPS I et de déficit multiple en sulfatases ont été exclus par l'absence d'opacités cornéennes et de déficit en alpha-L-iduronidase et en plusieurs autres sulfatases. Dix cas ont été rapportés jusqu'à aujourd'hui [15].

Chez les 21 enfants atteints de MPS III (appartenant aux 4 sous-types), les premiers signes sont apparus entre 1 et 7 ans, sous la forme de troubles du comportement avec hyperkinésie et agressivité, puis une dégradation intellectuelle progressive et très sévère. Quatre de nos patients ne présentaient pas ou très peu de dysmorphie faciale, en revanche 5 cas présentaient une hypertrichose importante. La fréquence du type III est particulièrement élevée (21 cas, soit 44,5 % de l'ensemble des mucopolysaccharidoses).

La maladie de Morquio (MPS IV) a été identifiée chez 6 enfants (13 %) parmi lesquels 2 présentaient un retard mental inhabituel.

Quatre enfants étaient atteints de la maladie de Maroteaux-Lamy (MPS VI) (8,5 % de nos patients). La symptomatologie était similaire à celle de la maladie de Hürler, mais le développement intellectuel était normal.

Des cellules de surcharge au niveau du sang périphérique n'ont été retrouvées que chez 4 de nos patients (3 MPS II, 1 MPS IIIA) ; il s'agissait de lymphocytes vacuolés de Gasser. Aucune anomalie métachromatique d'Alder n'a été mise en évidence dans le type VI.

Diagnostic biologique

Le dosage quantitatif des GAG dans les urines (résultats exprimés en mg/g de créatinine et en fonction de l'âge) était pathologique, à l'exception de 5 cas (3 MPS IV et 2 MPS VI) (figure). En revanche, l'étude électrophorétique a toujours montré un profil anormal caractéristique.

Le diagnostic de certitude est basé sur la mise en évidence du déficit enzymatique. Ce déficit a varié de 0 à 21 % par rapport aux valeurs usuelles (tableau 2). Nous nous sommes toujours assurés qu'un déficit en sulfatase était isolé (et non multiple) par le dosage simultané d'une autre sulfatase, cela dans le cas d'un profil électrophorétique des GAG évoquant une MPS I, II, VII [chondroïtine sulfate (CS) + dermatane sulfate (DS) + héparane sulfate (HS)] ou MPS III (HS).

Études moléculaires

Nous avons effectué cette étude moléculaire dans deux familles de MPS I. La mutation P533R a été recherchée en première intention et nous avons retrouvé cette mutation (majoritaire dans la population maghrébine) à l'état homozygote dans une famille. Aucune des trois mutations fréquentes recherchées n'a pu être retrouvée dans la deuxième famille.

En effet, dans les maladies autosomiques récessives, l'étude moléculaire permet de retrouver, avec une meilleure fiabilité, les hétérozygotes de la famille du malade. Cette approche est facilitée quand il existe des mutations plus fréquentes dans une population. C'est en particulier le cas de certaines lésions moléculaires à l'origine de la maladie de Hürler : la mutation P533R est très souvent identifiée chez les patients d'origine tunisienne mais aussi marocaine [16] ; la mutation W402X, plus fréquente en France, n'est retrouvée que très rarement dans la population maghrébine [12, 16]. Cette approche reste limitée mais, dans le contexte tunisien, ces études génétiques sont intéressantes car les familles tunisiennes sont étendues et les mariages entre apparentés sont fréquents (on peut donc estimer une moindre hétérogénéité des lésions moléculaires dans cette population et une étude mutationnelle pourra être exploitée pour la mise en œuvre de plusieurs diagnostics prénatals).

Une famille tunisienne de MPS II a bénéficié d'une étude moléculaire : la mutation Q396X, due à une substitution C-T dans l'exon 9 en position 1310 de l'ADN complémentaire (ADNc), a été trouvée ; son identification permet une recherche systématique et rapide des conductrices de cette famille. En effet, les études moléculaires améliorent bien sûr le conseil génétique dans les maladies récessives liées à l'X (MPS II) pour la détection des conductrices, car l'inactivation du chromosome X peut favoriser l'expression de l'X normal rendant difficile leur diagnostic enzymatique. L'identification fiable des conductrices dans la famille permet de limiter le diagnostic prénatal aux seules conductrices reconnues [14]. Lors du diagnostic prénatal, l'inactivation de l'X peut être déséquilibrée et ainsi favoriser l'expression de l'X muté : le tissu fœtal d'une fille conductrice pourra présenter une activité aussi déficitaire que celle d'un garçon atteint ; un caryotype ou une sonde de l'Y, pour préciser le sexe du fœtus, sont donc indispensables pour l'interprétation des résultats enzymatiques.

L'obtention, dans un avenir proche, du spectre des mutations des mucopolysaccharidoses tunisiennes revêt un intérêt épidémiologique, et devrait permettre la mise en place d'une politique de prévention par le repérage des hétérozygotes.

Diagnostic prénatal

Quatre de nos familles ont bénéficié d'un diagnostic prénatal réalisé sur trophoblaste et sur liquide amniotique. Ce diagnostic a permis de conclure que les fœtus étaient indemnes de mucopolysaccharidose.

CONCLUSION

Les maladies héréditaires du métabolisme, et en particulier les mucopolysaccharidoses, constituent par leur fréquence, en Tunisie, un réel problème de santé publique. Notre étude a permis d'identifier 47 enfants originaires du centre et du sud tunisien atteints de mucopolysaccharidoses, d'évaluer les fréquences relatives et de préciser les formes cliniques de ces affections hétérogènes dans cette région.

Le dépistage urinaire est opérationnel au laboratoire de biochimie de Sousse et les autres techniques nécessaires à l'investigation biochimique et moléculaire des mucopolysaccharidoses sont en cours de transfert à partir du laboratoire de biochimie pédiatrique de l'hôpital Debrousse de Lyon. La mise en place d'un centre multidisciplinaire en Tunisie devrait permettre un diagnostic plus précoce, donc une meilleure prise en charge des malades, permettant d'améliorer leur qualité de vie et l'instauration d'une réelle politique de prévention des mucopolysaccharidoses.

Remerciements. Nous remercions la région Rhône-Alpes (France) dans le cadre des programmes Tempra (98016996) avec Monastir (Tunisie) ainsi que le ministère français de la Coopération et l'organisation du Comité mixte de coopération universitaire franco-tunisien (CMCU) d'avoir bien voulu contribuer au financement de ce projet. Nous sommes reconnaissants à l'équipe de M. Mathieu et de I. Maire du Centre d'étude des maladies métaboliques de l'hôpital Debrousse à Lyon pour leur aide et leur contribution active à la mise en place de la stratégie d'orientation et de dépistage des maladies métaboliques au service de biochimie du CHU F.-Hached (Sousse) et de la Faculté de pharmacie de Monastir. D'autre part, nous remercions la société Genzyme pour son aide à la mise en place de notre centre.

REFERENCES

1. Billette de Villemeur T. Le lysosome et les maladies lysosomales. Atlas de l'association Vaincre les maladies lysosomales, Évry, 1998 : 1-3.

2. Neufeld EF, Muenzer J. The mucopolysaccharidosis. In : The metabolic and molecular bases of inherited disease. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, eds. McGraw-Hill, New York, 1995, 7^e ed. : 2465-94.

3. Moussaoui L. Les mucopolysaccharidoses dans le centre et le sud tunisien : étude épidémiologique, clinique et biochimique (à propos de 57 cas). Thèse de doctorat, Faculté de médecine, Sousse, Tunisie, 1999.

4. Salem N. Étude de la croissance intra-utérine des nouveau-nés dans la région de Sousse. Thèse de doctorat, Faculté de médecine, Tunis, Tunisie, 1994.

5. Ponsot G, Rabier D. Démarche diagnostique dans les maladies lysosomales. Troisième école nationale sur les erreurs innées du métabolisme. Maghreb Médical 1999 ; hors série : 14-7.

6. Humbel R, Etringer S. A colorimetric method for the determination of sulphated glycosaminoglycans. Rev Roum Biochim 1974 ; 11 : 21-4.

7. Stone JE. Urine analysis in the diagnosis of mucopolysaccharide disorders. Ann Clin Biochem 1998 ; 35 : 207-25.

8. Taylor KB, Jeffree GM. A new basic metachromatic dye 1,9 dimethylmethylene blue. J Hist Chem 1969 ; 1 : 199-204.

9. Maire I. Diagnostic biologique et moléculaire des maladies de surcharge lysosomale. Rev Fr Lab 1998 ; 303 : 37-40.

10. Percy AK, Brady RO. Metachromatic leukodystrophy : diagnosis with samples of venous blood. Science 1968 ; 161 : 594-5.

11. Hopwood JJ. Alpha-L-iduronidase, beta-D-glucuronidase, and 2-sulfo-L-iduronate 2-sulfatase : preparation and characterization of radioactive substrates from heparin. Carbohydr Res 1976 ; 69 : 203-16.

12. Scott HS, Litjens T, Nelson PV, et al. Mucopolysaccharidosis type I : identification of mutations in the alpha-L-iduronidase gene (IDUA) that cause Hurler and Scheie syndromes. Am J Hum Genet 1993 ; 53 : 973-86.

13. Froissart R, Maire I, Millat G, et al. Identification of iduronate sulfatase gene alterations in 70 unrelated Hunter patients. Clin Genet 1998 ; 53 : 362-8.

14. Maire I. Diagnostic prénatal des maladies de surcharge lysosomale. In : Diagnostics prénatals et biologie moléculaire. Forestier F, Schorderet DF, Tec et Doc Lavoisier. Éditions Médicales Internationales. Paris. 1997 ; 213-30.

15. Cudry S, Tibaud I, Froissart R, Bonnet V, Maire I, Bozon D. MPS II in females : molecular bases of two different cases. J Med Genet 2000 (sous presse).

16. Alif N, Hess K, Straczek J, et al. Mucopolysaccharidosis type I : characterization of a common mutation that causes Hurler syndrome in Maroccan subjects. Ann Hum Genet 1999 ; 63 : 9-16.