ARTICLE
L'utilisation de la technique faisant appel au bleu de Coomassie, décrite
par Bradford en 1976, est restreinte à un nombre limité
de laboratoires de biologie médicale [4]. Ce colorant présente
l'avantage de réagir avec l'ensemble des protéines présentes
dans les urines, même si l'intensité de la réaction
varie en fonction de la nature même de la protéine. Le bleu
de Coomassie sous-estime les protéines de faible masse moléculaire,
ce qui pose problème lors de l'exploration des protéinuries
tubulaires ou chez les patients présentant une excrétion
urinaire de chaînes légères monoclonales. Par ailleurs,
cette technique n'est pas utilisable par les laboratoires qui souhaitent
automatiser ces dosages (adsorption du colorant sur les parois des cuves
de mesure et des tubulures, réactif corrosif). En outre, le domaine
de mesure reste limité, souvent inférieur à 1 g/l
et les dispersions interlaboratoires observées lors du contrôle
national de qualité de 1997 sont importantes (CV tronqué
à 12,3 % pour les valeurs basses, à 18,8 % pour les valeurs
élevées). Enfin, il a été rapporté
que le fait d'ajouter du SDS (sodium-dodecyl-sulfate) au bleu de Coomassie
permettait d'améliorer la sensibilité du dosage des protéines
urinaires, notamment chez les patients présentant une excrétion
de chaînes légères monoclonales [5].
La technique reposant sur l'utilisation du rouge de pyrogallol, décrite
par Fujita en 1983 et adaptée aux protéines urinaires par
Watanabe en 1986 [6], est la plus utilisée (60 % des laboratoires
lors du contrôle national de qualité de 1993 et plus de 75
% des laboratoires lors du contrôle national de qualité de
1997). Son principe est simple : le colorant combiné avec le molybdate
forme un complexe qui absorbe à 460 nm. En milieu acide, la fixation
du colorant sur les groupements aminés des protéines déplace
le pic d'absorption à 598 nm [6]. Cette technique a l'avantage
d'être facile à automatiser : elle se caractérise,
de ce fait, par une reproductibilité satisfaisante. Son domaine
de mesure est étendu (0,05 à 2 g/l) [7]. Elle présente
néanmoins des problèmes de fiabilité, notamment en
ce qui concerne les urines colorées (présence de pigments
ou d'hémoglobine) et les dispersions inter-laboratoires observées
lors du contrôle national de qualité de 1997 restent importantes
(CV tronqué à 13,5 % pour les valeurs basses, à 12,2
% pour les valeurs élevées). Enfin, certains auteurs font
état d'un risque important de sous-estimation de la protéinurie
par le rouge de pyrogallol pour les échantillons urinaires contenant
de grandes quantités de chaînes légères monoclonales
[2, 7].
Notre laboratoire avait jusqu'alors choisi de doser les protéines
urinaires par la technique manuelle au bleu de Coomassie, cela en raison
d'un recrutement composé d'échantillons urinaires provenant
à la fois des services de néphrologie de l'hôpital
d'adultes et de l'hôpital d'enfants. Lorsqu'il a été
décidé d'évaluer une technique susceptible de permettre
le passage à un dosage automatisé, notre choix s'est porté
sur un colorant qui présentait l'avantage d'être doublement
concentré. Le but de notre étude était d'évaluer
les performances de cette technique de dosage des protéinuries
au rouge de pyrogallol installée sur un Hitachi 911, et de comparer
ces résultats avec ceux obtenus par la méthode manuelle
de dosage des protéinuries au bleu de Coomassie, à la fois
en ce qui concerne les échantillons urinaires non sélectionnés
et des spécimens contenant des chaînes légères
ou lourdes monoclonales.
Matériels et méthodes
Échantillons urinaires testés
Notre étude a été réalisée sur des
urines de 24 heures recueillies en flacon stérile, sans adjonction
d'antiseptique. La majorité des échantillons provenait de
patients hospitalisés ou vus en consultation au CHU de Nancy, le
plus souvent au service de néphrologie. À leur arrivée
au laboratoire, les urines étaient centrifugées à
430 g pendant 10 min à température ambiante dans une centrifugeuse
GT422 (Jouan, Saint-Herblain, France).
Les échantillons urinaires pour lesquels une recherche de chaînes
légères monoclonales était prescrite ont été
concentrés dans des cellules d'ultrafiltration Amicon de 200 ml
(Beverly, États-Unis) sous une pression d'azote de 4 bars, à
travers des membranes Filtron-Disc Membrane OM (Filtron France, Coignières,
France) de 62 mm de diamètre et dont le seuil de coupure est de
10 000 Da. Nous avons ainsi sélectionné 27 urines : 12 patients
présentaient des chaînes légères et/ou lourdes
monoclonales en quantité peu importante dans leurs urines (traces
: n = 2, quantité faible : n = 3, quantité peu importante
: n = 7), 8 en quantité assez importante et 7 en quantité
importante (n = 2) ou très importante (n = 5).
Technique manuelle au bleu de Coomassie
La solution de bleu de Coomassie était préparée
toutes les semaines, par dilution du bleu de Coomassie Brillant (Fluka,
Sigma Aldrich Chimie, Saint-Quentin-Fallavier, France) en milieu éthanol
et acide orthophosphorique (Prolabo, Fontenay-sous-Bois, France) de manière
à obtenir une concentration finale en bleu de 0,1 g/l. La calibration
était effectuée en cinq points et faisait appel à
un calibrant composé d'albumine et de gammaglobulines humaines
(N Protein-Standard SL, Dade Behring, Marburg, Allemagne).
Pour chaque urine, une première estimation de la quantité
de protéines présentes était réalisée
à l'aide d'une bandelette Multistix 8 SG (Bayer Diagnostics, Puteaux,
France). Selon le résultat obtenu, l'urine à tester était
diluée, si nécessaire, dans du NaCl 0,9 % de manière
à se situer dans le domaine de linéarité de la technique
(0,05-0,60 g/l).
Cinq microlitres de l'échantillon urinaire étaient alors
ajoutés à 300 µl de la solution de bleu de Coomassie.
S'ensuivaient une agitation et une incubation à température
ambiante pendant 10 min au minimum. La lecture des microplaques était
effectuée au spectrophotomètre à 620 nm (A-5082 Grädig,
SLT-Labinstruments, Autriche).
Le contrôle de qualité quotidien était réalisé
en testant les contrôles Liquicheck® urine chemistry
controls levels 1 et 2, contenant un mélange d'albumine et de gammaglobulines
humaines (BioMed, Irvine, États-Unis). Notre laboratoire était
également inscrit à un programme de contrôle de qualité
externe (programme Human Urine RIQAS, Randox Laboratories, Crumlin, Royaume
Uni).
Dosage au rouge de pyrogallol
Les dosages au rouge de pyrogallol étaient réalisés
sur un automate Hitachi 911 (Boehringer-Mannheim, Roche, Meylan, France)
avec un réactif concentré deux fois et dépourvu de
SDS (rouge de pyrogallol, J2L Elitech, Labarthe Inard, France).
La calibration était effectuée en deux points : le premier
point correspondait à un blanc réactif (NaCl à 0,9
%) et le deuxième à un calibrant composé d'albumine
et de gammaglobulines bovines et dont la concentration en protéines
était de 1 g/l (J2L Elitech, Labarthe Inard, France).
Le suivi au quotidien de la qualité de l'analyse était
réalisé en testant les réactifs Liquichek®
urine chemistry controls levels 1 et 2, et permettait d'observer des CV
de 3,7 % (level 1) et de 1,4 % (level 2) (n = 28).
Caractérisation des chaînes légères
monoclonales
La mise en évidence de chaînes légères monoclonales
dans les urines faisait appel, après concentration préalable
des urines, à une séparation électrophorètique
des protéines présentes dans les échantillons au
moyen d'un support Hydragel-Protein 15/30 (automate Hydrasis, Sebia, Issy-les-Moulineaux,
France). L'identification des chaînes légères monoclonales
se faisait par immunofixation (Gel Hydragel 4 IF, Sebia, Issy-les-Moulineaux,
France). Notre laboratoire ne rendait pas de quantification de chaînes
légères monoclonales, mais l'analyse visuelle du support
Hydragel permettait une estimation semi-quantitative des chaînes
lourdes et/ou légères monoclonales excrétées
dans les urines.
Protocole d'évaluation
L'évaluation de la technique de dosage des protéinuries
au rouge de pyrogallol installée sur l'automate Hitachi 911 a été
réalisée selon les recommandations publiées par la
Société française de biologie clinique [8].
La détermination de la limite de détection s'est faite
en réalisant trente-cinq mesures successives du blanc réactif.
La limite de détection était alors considérée
comme étant égale à 3 fois l'écart-type calculé.
L'étude du domaine d'analyse et des limites de linéarité
de la technique a fait l'objet de deux séries de mesures. Un pool
d'urine d'une concentration finale de 0,76 g/l était dilué
dans une solution de NaCl 0,9 % dans les proportions suivantes 1, 1/2,
1/4, 3/20, 1/10 et 1/16. Chaque dilution faisait alors l'objet d'un dosage
en double. D'autre part, afin d'étudier la linéarité
pour les protéinuries importantes, deux urines, l'une de concentration
évaluée à 0,20 g/l et l'autre à 2,10 g/l,
étaient mélangées dans des proportions variables
allant de 0 et 100 %, par paliers de 10 %. Le dosage était réalisé
en double.
L'étude de la répétabilité a été
réalisée sur 4 échantillons dont la concentration
protéique variait de 0,128 à 0,74 g/l. La reproductibilité
a été évaluée en analysant les résultats
obtenus avec deux échantillons de concentrations égales
à 0,24 et 0,74 g/l au cours de 28 essais indépendants.
L'évaluation de la justesse de la technique a pour but de mettre
en évidence des erreurs systématiques d'ordre proportionnel
ou constant et doit normalement faire appel à des spécimens
de contrôle titrés ou à des matériaux de référence
choisis à trois niveaux de concentrations différents [8].
En l'absence de contrôles commercialisés fournissant les
valeurs attendues pour le réactif rouge de pyrogallol de J2L,
un standard à 0,2 g/l fourni par ce fabricant a été
utilisé à la dilution 1/2 dans du NaCl 0,9 %, pour tester
l'exactitude de la technique dans les valeurs basses.
L'étude de l'interférence de l'hémoglobine a été
réalisée en utilisant une solution mère d'hémoglobine
à 2,5 mg/ml à partir d'hémoglobine humaine purifiée
(Serva, Heidelberg, Allemagne) reprise dans de l'eau distillée.
Trois urines, avec des concentrations en protéines totales de 0,04
g/l, 0,23 g/l et 1,32 g/l, ont été surchargées par
des concentrations croissantes d'hémoglobine humaine allant de
0 à 100 mg/l. Les dosages ont été réalisés
en double.
Comparaison des techniques au rouge de pyrogallol
et au bleu de Coomassie
La comparaison des résultats obtenus par la technique au rouge
de pyrogallol et par celle au bleu de Coomassie a porté sur des
échantillons urinaires non sélectionnés (n = 105)
ainsi que sur des urines contenant des chaînes légères
monoclonales (n = 27). Les régressions linéaires ont été
obtenues par la méthode des moindres carrés (logiciel Statview,
SAS Institute, États-Unis).
De plus, deux échantillons urinaires contenant essentiellement
des immunoglobulines monoclonales (> 90 %) et provenant de deux patients
différents ont été, après concentration, dilués
avec une solution de NaCl à 0,9 %, afin de comparer la linéarité
des deux techniques sur ce type d'échantillons. Sept dilutions
différentes ont été testées en double pour
chaque échantillon.
Résultats
La valeur moyenne des 35 mesures successives du blanc réactif
était de 0,010 g/l pour un écart-type de 0,015 g/l, ce qui
correspondait à une limite de détection de 0,045 g/l.
L'étude du domaine d'analyse et des limites de linéarité
de la technique a fait l'objet de deux séries de mesures. En ce
qui concernait l'étude des dilutions du pool d'urines dans une
solution de NaCl à 0,9 %, le coefficient de corrélation
r2 de la droite de régression était de 1,00.
Il en était de même lors de l'étude du mélange
des deux urines dans des proportions variables. Ces résultats permettent
de conclure à l'existence d'une relation linéaire pour des
concentrations protéiques urinaires allant de 0,045 g/l à
2,10 g/l.
Les résultats de l'étude de la répétabilité
et de la reproductibilité sont présentés dans les
tableaux 1 et
2. Les CV observés lors des essais de répétabilité
variaient de 1,2 % à 6,2 %, et ceux des essais de reproductibilité
de 1,3 % à 3,7 %.
L'exactitude de la technique dans les valeurs basses a été
appréciée en dosant un standard à 0,2 g/l dilué
au 1/2 en NaCl 0,9 %. La moyenne des 13 mesures réalisées
était de 0,109 g/l pour une valeur théorique attendue de
0,100 g/l, ce qui représentait un écart de 9 % par rapport
à la valeur attendue, avec un CV de 2,7 %.
Les résultats de l'étude de l'interférence de l'hémoglobine
figurent dans le tableau 3.
Pour toutes les urines testées, la plus faible surcharge en hémoglobine
provoque une estimation de l'hémoglobinurie à +++ sur bandelette
Multistix®, tandis que la valeur de la protéinurie
n'est notablement modifiée que pour la plus forte concentration
en hémoglobine.
La comparaison des résultats observés avec la technique
au rouge de pyrogallol et avec celle au bleu de Coomassie sur 105 échantillons
permettait d'obtenir un coefficient de corrélation r2
égal à 0,97 (figure
1) avec une équation de la droite : y = 1,07 x + 0,04,
montrant que les valeurs trouvées avec le rouge de pyrogallol étaient
de 10 % supérieures à celles obtenues avec la technique
de dosage au bleu de Coomassie. Avec des urines contenant des chaînes
légères et/ou des chaînes lourdes d'immunoglobulines
monoclonales, la droite de régression était comparable (Y
= 1,18 X + 0,07, r2 = 0,96).
Le test de dilution réalisé avec les deux échantillons
urinaires contenant essentiellement des immunoglobulines monoclonales
(> 90 %, essentiellement des chaînes légères de
type kappa) montre une linéarité parfaite avec la technique
au rouge de pyrogallol (r2 = 1,00) dans les domaines testés
(0 à 1,5 g/l pour la première urine ; 0 à 2,5 g/l
pour la deuxième urine). Avec la technique au bleu de Coomassie,
les coefficients de corrélation étaient comparables mais
la droite de régression présentait une ordonnée à
l'origine négative, responsable d'une sous-estimation de la protéinurie
par cette technique (figure 2).
Discussion
Parmi les techniques de dosage des protéines urinaires, la méthode
utilisant le rouge de pyrogallol est utilisée dans la majorité
des laboratoires d'analyses de biologie médicale et réalise
un compromis satisfaisant entre spécificité, sensibilité,
praticabilité et coût [2, 9].
Dans notre étude, nous avons confirmé que les limites
de linéarité et de détection de cette technique,
ainsi que la répétabilité et la reproductibilité
observées correspondaient aux données publiées dans
la littérature [2, 7] ainsi qu'au domaine de mesure affiché
par le fabricant. Ces données sont tout à fait acceptables,
au vu des normes récemment publiées [10]. L'étude
de corrélation comparant les résultats obtenus avec le bleu
de Coomassie à ceux obtenus avec le rouge de pyrogallol fait état
d'un coefficient de corrélation à 0,97 (n = 105). Il existe
une surestimation des résultats d'environ 10 %, si on les compare
à ceux obtenus avec le bleu de Coomassie, comme précédemment
décrit [11], ce qui reste tout à fait acceptable, compte
tenu des données publiées par Vassault et al. [10].
Une des limites de la technique de dosage des protéines urinaires
par le rouge de pyrogallol concerne son application aux urines colorées,
notamment celles contenant de l'hémoglobine. Nous avons constaté
qu'il existait un risque d'interférence pour les urines surchargées
en hémoglobine, et ce d'autant plus que la protéinurie était
peu importante (0,04 g/l-0,23 g/l). Néanmoins, la surcharge la
plus faible en hémoglobine (25 mg/l) se traduisait déjà
par une estimation +++ par la bandelette Multistix, alors qu'à
cette concentration, la valeur de la protéinurie n'était
pas significativement modifiée.
Nous avons comparé les résultats obtenus par les techniques
au rouge de pyrogallol et au bleu de Coomassie pour des urines présentant
des chaînes légères et/ou lourdes d'immunoglobulines
monoclonales et avons constaté que la corrélation obtenue
entre ces deux méthodes était comparable à celle
observée lors de l'étude des échantillons urinaires
non sélectionnés. Il nous paraît intéressant
de noter que, dans les deux cas, la pente obtenue était supérieure
à 1. Enfin, l'épreuve de dilution réalisée
à partir des deux échantillons pour lesquels la protéinurie
était essentiellement constituée de chaînes légères
monoclonales nous a permis d'observer que la droite de régression
passait par l'origine uniquement avec la méthode au rouge de pyrogallol.
La « sous-estimation » relative de la protéinurie est,
dans notre étude, plus importante avec la méthode au bleu
de Coomassie.
Certains auteurs ont rapporté l'existence d'un risque important
de sous-estimation de la protéinurie par le rouge de pyrogallol
pour les échantillons urinaires contenant des chaînes légères
monoclonales en quantité importante [2, 6]. Cet inconvénient
est dû au fait que le rouge de pyrogallol réagit mal avec
les chaînes légères. Le Bricon et al. ont noté
qu'il existait, en ce qui concerne la méthode de dosage au rouge
de pyrogallol, une très grande variabilité des pourcentages
de récupération de chaînes légères selon
les échantillons (45 %-69 %) [2]. L'adjonction de SDS semblait
améliorer ces résultats [2, 7, 12], sans toutefois faire
complètement disparaître cet inconvénient, puisque
ces mêmes auteurs rapportaient la persistance d'une réactivité
non satisfaisante du rouge de pyrogallol vis-à-vis des chaînes
légères, et ce malgré l'addition de SDS [2].
Ainsi, les résultats que nous avons obtenus sur les urines présentant
des chaînes légères monoclonales pourraient être
dus au fait que les réactifs étaient tous deux dépourvus
de SDS et que, par ailleurs, les pourcentages de récupération
des chaînes légères monoclonales varient d'un échantillon
à l'autre, et ce, en fonction de la quantité de protéines
de chaînes légères monoclonales excrétée
[2].
CONCLUSION
Les performances de la technique de dosage des protéines urinaires
au rouge de pyrogallol (J2L Elitech, Labarthe Inard, France)
installée sur un automate Hitachi 911 sont tout à fait acceptables
au vu des critères récemment publiés. Les avantages
essentiels sont la reproductibilité et la répétabilité
de cette méthode automatisée, ainsi que son domaine de mesure,
plus étendu que celui de la méthode manuelle au bleu de
Coomassie. Les interférences avec l'hémoglobine sont le
fait de surcharges en hémoglobine assez importantes et aisément
détectables à la bandelette Multistix®. Par
ailleurs, les études menées sur les urines présentant
des chaînes légères monoclonales nous permettent de
penser que, si l'utilisation du rouge de pyrogallol peut s'accompagner
d'un risque de sous-estimation de la protéinurie, ce risque existe
également avec le bleu de Coomassie.
Remerciements. Les auteurs remercient vivement tous
les membres de l'équipe qui ont participé à cette
étude, qu'il s'agisse de la réalisation des dosages, de
la relecture de l'article, ou des tâches de secrétariat.
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