ARTICLE
Le diagnostic biologique des hémoglobinopathies
repose sur deux principes :
- d'une part la mise en évidence et la quantification de variants
dont la charge ou l'affinité pour un support permettent de les
séparer des fractions normales : hémoglobines A ou Ao (HbAo),
A2 (HbA2) et fœtale (HbF), les variants les plus fréquents
étant les hémoglobines S (HbS), C (HbC), et E (HbE) ;
- d'autre part les dosages de fractions mineures. Le taux d'HbA2 est
particulièrement important pour le diagnostic des syndromes thalassémiques.
Le taux d'HbF est un critère essentiel du diagnostic des persistances
héréditaires de l'HbF ; c'est aussi un critère pronostisque
dans les syndromes drépanocytaires majeurs ; de plus, dans certaines
formes graves de drépanocytose, un traitement par hydroxyurée
visant à augmenter l'HbF est prescrit.
En pratique, on utilise en général une technique électrophorétique
de première intention, en milieu alcalin, les variants mis en évidence
étant confirmés par une seconde technique électrophorétique,
en milieu acide. On peut également recourir au test d'Itano (test
de solubilité) et au test de falciformation pour l'hémoglobine
S.
Le dosage des fractions mineures est en général réalisé
à l'aide de microcolonnes de chromatographie ou par élution
de la bande électrophorétique pour l'HbA2, et par étude
de la résistance à la dénaturation alcaline pour
l'HbF [1].
Les techniques de chromatographie liquide haute performance (CLHP) sont
utilisées pour les dosages d'HbA2, d'HbA1c et d'HbF, avec la possibilité
de mise en évidence de variants [2-6]. Des automates de CLHP proposant
plusieurs programmes spécifiques d'étude de l'hémoglobine
sont également disponibles [5, 7-9]. L'inconvénient majeur
est le coût du matériel nécessaire et le prix de revient
élevé du test.
Il nous a paru intéressant d'adapter un équipement de
CLHP modulaire couramment utilisé pour les dosages d'HbA1c à
l'étude des hémoglobinopathies en installant en parallèle
une deuxième colonne destinée au dosage de l'HbA2, et d'évaluer
cette technique de CLHP comme technique de première intention dans
l'étude des hémoglobines. Notre but était d'apprécier
l'intérêt de disposer, à partir d'une seule technique,
des taux d'HbA2 et d'HbF pour tous les échantillons, et de la mise
en évidence et de la quantification des variants les plus courants,
dans les circonstances diagnostiques que nous rencontrons habituellement.
Matériel et méthodes
Patients
Les prélèvements de sang veineux, réalisés
sur tubes EDTA-K3, ont été conservés à + 4
°C et analysés dans un délai de moins de 7 jours. Ils
ont été réalisés sur des nouveau-nés
âgés de trois jours. Sur un total de 372 échantillons,
9 nous étaient adressés pour détermination du taux
d'HbS après transfusion chez des drépanocytaires homozygotes
connus, 132 pour dépistage néonatal.
Paramètres hématologiques
Le volume globulaire moyen (VGM) a été établi sur
automate STKS® (Coultronics) pour tous les profils «
adultes », et les dosages de ferritine ou de fer sérique ont
été relevés chaque fois qu'ils étaient disponibles,
en cas de microcytose. Pour les nouveau-nés, le VGM n'a été
relevé qu'en cas de présence d'hémoglobine Bart's.
Méthodes électrophorétiques
Les électrophorèses à pH alcalin ont été
réalisées en gel d'agarose Hydragel® (Sebia),
selon les modalités préconisées par le fabricant,
avec coloration à l'amidoschwarz. Toutefois, le sang n'était
lavé qu'en cas de tracé électrophorétique
montrant des bandes évoquant des fractions de dégradation
et l'électrophorèse était recontrôlée.
Les pourcentages des variants ont été établis par
intégration des tracés sur un densitomètre Appraise®
(Beckman).
L'identification des variants S, C et E a été confirmée
par électrophorèse sur agarose à pH acide Paragon®
(Beckman). Les variants autres que les hémoglobines S, C, E, et
Bart's ont été adressés au laboratoire du Pr Galacteros,
à l'hôpital Henri-Mondor (Créteil) pour identification.
CLHP
Le système de CLHP utilisé est une chaîne modulaire
MDMS® (BioRad).
La colonne analytique (« CLHP A2 ») est une colonne échangeuse
de cations (150 x 4 mm), initialement destinée au dosage de l'HbA2
sur Diamat®, automate de CLHP BioRad. Cette colonne est
placée dans une enceinte thermostatée maintenue à
34 °C, et montée en parallèle de la colonne destinée
au dosage de l'HbA1c équipant initialement l'installation («
CLHP A1c »).
La détection est réalisée à deux longueurs
d'onde, 415 et 690 nm, un système micro-informatique d'analyse
des chromatogrammes sur logiciel « HBSCR » calcule les pourcentages
des différentes fractions d'hémoglobine de chaque échantillon
à partir des surfaces des pics, le taux d'HbA2 étant corrigé
par un facteur de réponse établi à partir du chromatogramme
de l'étalon passé en début de série.
Les réactifs utilisés (réactif hémolysant,
tampons d'élution phosphates de force ionique croissante et de
pH différents 1, 2 et 3, solution de lavage, étalon) sont
contenus dans le kit BioRad A2.
Le débit a été ajusté à 1,20 ml/min.
Les temps de passage des tampons 1, 2 et 3 ont été fixés
respectivement à 1,5, 8,6 et 12,7 min. La pression était
de 80 kg/cm2.
Préparation des échantillons
Les hémolysats ont été préparés avec
5 µl de sang total pour 1 ml de réactif hémolysant
et incubés 30 min à température ambiante. Les échantillons
ont été ensuite placés dans un injecteur automatique
réfrigéré à + 8 °C, d'une capacité
de 100 cupules. Le temps de passage d'un échantillon était
de 17,5 min. Pour le calibrant et les contrôles Lyphocheck 1 et
2 (BioRad), 10 µl ont été ajoutés à 1
ml de réactif hémolysant. Il faut noter que ce système
est calibré sur l'hémoglobine A2, mais les contrôles
comportent également de l'HbF à deux taux différents,
et, pour l'un d'entre eux, de l'hémoglobine S. Les différents
composants de cette chaîne sont coordonnés par un microprocesseur,
rendant son fonctionnement pratiquement automatique.
Étude de reproductibilité
Les études de reproductibilité en CLHP ont été
réalisées de la façon suivante :
- Pour les dosages d'HbA2 et HbF, la reproductibilité intrasérie
a été étudiée sur 2 échantillons passés
12 fois, l'un ayant un taux normal d'HbA2 et une HbF à 12,8 %,
l'autre une HbA2 élevée (5,5 %) et une HbF normale. La reproductibilité
intersérie a été étudiée sur les contrôles
Lyphochek 1 et 2 (aliquotés et congelés à - 80 °C
après reconstitution) passés 17 fois.
- Pour la quantification de l'hémoglobine S, des prélèvements
de patients drépanocytaires hétérozygotes ont été
passés 10 fois : en électrophorèse de l'hémoglobine
à pH alcalin avec intégration densitométrique, en
CLHP A2 et CLHP A1c. La comparaison intersérie de chaque technique
a été évaluée par le passage d'un même
échantillon dans 11 à 14 séries différentes.
Les calculs statistiques ont été effectués sur
les logiciels Statview® et Excel 7.
Résultats
Les temps de rétention (TR) des différentes sous-fractions
sont respectivement de 1,10 min pour HbA1a, 1,88 min pour HbA1b, 4,00
min pour l'HbF, 4,79 min pour HbA1c, 7,50 min pour HbA0, 11,10 min pour
HbA2, 12,50 min pour l'HbS qui donne un pic très fin, et 13,10
min pour l'HbC. L'HbE a un temps de rétention de 9,50 min, et se
situe donc entre la A0 et la A2, avec un certain chevauchement de pics.
L'hémoglobine O Arab se situe entre l'HbS et l'HbC, et l'hémoglobine
G Philadelphie entre l'HbA2 et l'HbS. Les figures
1 et 2 présentent quelques
exemples de chromatogrammes obtenus chez des adultes et des nouveau-nés.
Les valeurs de référence obtenues en CLHP A2 établies
sur 114 échantillons (échantillons d'adultes, VGM normal,
HbF < 1,5 %) sont respectivement de 2,75 ± 0,29 % (intervalle
de confiance 95 % : 2,18 % -3,32 %) pour l'HbA2 et de 0,31% ± 0,29
% (intervalle de confiance 95 % : 0 % - 0,88 %) pour l'HbF.
Performances analytiques
Les résultats des tests de reproductibilité intra et intersérie
des dosages d'HbA2 et F sur CLHP A2 sont présentés dans
le tableau 1.
La comparaison des dosages d'HbA2 par CLHP et microcolonnes Sickle-thal®
(Helena) a été réalisée sur 30 échantillons
de patients microcytaires ayant des taux d'HbA2 allant de 1,7 à
6,1 %. Le coefficient de corrélation est de 0,928.
Pour l'HbF, les taux obtenus sur deux types de colonnes de CLHP (A2
et A1c) ont été comparés sur 29 échantillons
(HbF allant de 0,15 à 17 %) : le coefficient de corrélation
est de 0,981.
Les tests de reproductibilité intra et intersérie des
quantifications d'HbS par CLHP A2, CLHP A1c et électrophorèse
à pH alcalin sont regroupés dans le tableau
2. La comparaison des techniques de quantification de l'HbS donne
des coefficients de corrélation de 0,983 pour électrophorèse
versus CLHP A2, 0,983 pour CLHP A2 versus CLHP A1c et 0,978
pour électrophorèse versus CLHP A1c (p < 0,0001).
Mise en évidence des variants
Parmi les 132 nouveau-nés, 17 (soit 13 %) présentaient
un profil anormal, avec une bonne concordance entre CLHP et électrophorèse
dans tous les cas. Les anomalies mises en évidence sont les suivantes
: 1 drépanocytose homozygote (ou S-beta0 thalassémie),
1 hétérozygote composite SC, 4 drépanocytoses hétérozygotes
dont 1 associée à la présence d'Hb Bart's, 5 Hb Bart's
isolées, 3 hémoglobinoses C, 1 HbE et 1 HbD hétérozygotes,
1 variant gamma probable. L'HbF étant très prédominante,
l'interprétation des pics de CLHP est ici surtout qualitative,
et en présence d'un variant, le but essentiel est de bien distinguer
les profils hétérozygotes des homozygotes qui nécessiteront
une prise en charge précoce. L'Hb Bart's est bien visualisée
en tout début de chromatogramme ; sa quantification est possible
par calcul à partir des surfaces des pics. Les hémoglobines
A et S sont bien séparées, ce qui est important pour une
bonne différenciation entre drépanocytose hétérozygote
et homozygote, alors qu'en électrophorèse à pH alcalin
les hémoglobines A et S sont mal séparées de l'HbF,
ce qui peut gêner l'interprétation.
Parmi les sujets plus âgés (tableau
3), seule l'hémoglobine Henri-Mondor pouvait passer inaperçue,
car son temps de rétention relativement proche de celui de l'HbA0
donnait simplement un élargissement de ce pic sans dédoublement,
avec en conséquence un TR légèrement supérieur
à celui de l'HbA0 (7,97), sans que le logiciel d'analyse ne signale
une fraction anormale chez un patient hétérozygote.
Discussion
Parmi les échantillons correspondant à des profils «
adultes », nous avons observé une bonne corrélation
entre les techniques électrophorétiques classiques et la
CLHP pour la mise en évidence des variants cliniquement significatifs
les plus courants. Seule l'hémoglobinose Henri-Mondor hétérozygote,
extrêmement rare [10], aurait pu passer inaperçue car elle
ne donnait qu'un élargissement du pic identifié « HbA0
», sans alarme. Comme pour toute technique de première intention,
en cas de profil normal avec un contexte clinique ou biologique fortement
évocateur d'hémoglobinopathie, il est souhaitable d'associer
d'autres tests : électrophorèse à pH alcalin, à
pH acide, test de solubilité, recherche d'hémoglobine instable...
Par rapport à d'autres systèmes de CLHP destinés
à l'étude des hémoglobinopathies, cette technique
permet de bien visualiser les hémoglobines E dont le temps de rétention
est situé entre celui de l'HbA0 et celui de l'HbA2. Toutefois,
sa quantification précise n'est pas possible car il y a un chevauchement
de pics avec l'HbA0 et l'HbA2. Il est alors intéressant d'associer
une électrophorèse à pH alcalin qui confirmera le
type de variant (bande en « A2 ») et permettra sa quantification
par intégration densitométrique.
Les taux d'hémoglobine S mesurés chez des drépanocytaires
hétérozygotes ou chez des homozygotes transfusés
ont donné une bonne corrélation entre les deux méthodes
de CLHP (colonnes A1c et A2) et l'intégration du tracé électrophorétique
à pH alcalin. Cela autorise à utiliser l'une quelconque
de ces méthodes lorsqu'un taux d'HbS est demandé en urgence.
Toutefois, les techniques de CLHP sont préférables chez
un patient ayant un taux élevé d'HbF du fait de la meilleure
séparation de cette fraction.
Les taux d'HbA2 donnent une bonne corrélation avec les résultats
obtenus en microchromatographie. Les reproductibilités intra et
intersérie sont satisfaisantes. Les beta-thalassémies hétérozygotes
ont des valeurs moyennes de 4,72 % ; 8 patients présentaient une
carence en fer associée, situation qui peut entraîner une
diminution de l'HbA2, mais leur taux restait élevé (4,52
% en moyenne), ce qui est signalé par certains auteurs [11].
Pour l'HbF, la séparation avec les fractions labiles (HbA1a et
HbA1b) et avec l'HbA1c est bonne (figures
1 et 2) du fait de la longueur
du chromatogramme (17 min), ce qui limite les interférences décrites
avec d'autres systèmes [9]. Les valeurs obtenues pour les échantillons
de contrôle sont bonnes, même si le système n'est pas
calibré sur l'HbF. La reproductibilité intra et interséries
est satisfaisante. La corrélation entre les taux obtenus avec les
deux types de colonnes de CLHP (A1c et A2) est bonne.
Les taux d'HbA1c obtenus sur ce type de colonne ne sont pas assez précis
pour le suivi de patients diabétiques [3].
Le dépistage néonatal a pour but essentiel le diagnostic
précoce des hémoglobinopathies majeures : syndromes drépanocytaires
majeurs (SS, SC et S-beta0 thalassémie) et les beta0
thalassémies homozygotes. La technique de référence
est l'isoélectrofocalisation, très discriminante, mais surtout
adaptée aux grandes séries. Dans ce travail d'évaluation,
la CLHP s'est révélée satisfaisante puisqu'en cas
de présence d'un variant (S et C en particulier), la présence
ou l'absence d'HbA0 est bien visualisée. Par ailleurs, la période
néonatale permet le diagnostic des alpha-thalassémies avec
la présence d'Hb Bart's, bien mise en évidence en CLHP,
fraction disparaissant ensuite lorsque l'HbF diminue. L'interprétation
est ici surtout qualitative, le pourcentage très élevé
d'HbF perturbant l'intégration du début du chromatogramme.
La longueur du chromatogramme permet la visualisation de l'hémoglobine
Hope qui est confondue avec l'HbF sur le système Variant®
(BioRad), évitant le risque de diagnostic erroné d'homozygotie
S chez les porteurs de la double hétérozygotie S/Hope [12].
Depuis ce travail d'évaluation, 2 720 échantillons ont
été analysés sur ce système de CLHP, et plusieurs
autres types d'hémoglobinopathies ont été mis en
évidence : HbD Punjab (TR : 11,33), Hb Hope (TR : 5,52), Hb D Ouled
Rabah (TR : 9,5), Hb H (pic en tout début de chromatogramme comme
pour l'Hb Bart's, un contrôle sur sang lavé étant
nécessaire dans ce cas).
CONCLUSION
Cette technique de CLHP s'est révélée très
satisfaisante en première intention pour la recherche d'hémoglobinopathies
aussi bien chez l'adulte que chez le nouveau-né. Par rapport à
l'utilisation d'une technique électrophorétique en première
intention, il faut souligner l'intérêt de disposer de taux
fiables d'HbA2 et HbF pour tous les échantillons : les beta-thalassémies
et les persistances d'HbF sont facilement mises en évidence, et
on pourra suspecter une alpha-thalassémie devant une HbA2 basse
ou bien normale, mais associée à une microcytose inexpliquée,
diagnostic à confirmer par biologie moléculaire.
Ce type de système présente une certaine souplesse d'utilisation
puisqu'il permet d'ajuster la température, le gradient et le débit
de travail, paramètres conditionnant les temps de rétention
et la séparation des différents pics. Le volume de prélèvement
nécessaire est très faible (5 µl), l'étape de
préparation des hémolysats est très simple, et on
peut tirer profit des automatismes du système modulaire qui en
font une technique bien adaptée aux grandes séries. La souplesse
de programmation permet une bonne gestion des réactifs.
Étant moins fermé et standardisé que l'automate
Variant®, il ne donne pas une cartographie aussi précise
des fractions anormales [9], mais permet de reconnaître et de quantifier
aisément les variants les plus courants (S, C, E, Bart's) et d'orienter
pour les autres variants plus rares dont l'identification relève
de laboratoires spécialisés. Enfin, le coût au test
est inférieur à celui des automates, la mise en route de
cette application demandant juste une adaptation de l'équipement
pour les nombreux laboratoires possédant déjà un
système modulaire de CLHP pour d'autres applications (HbA1c par
exemple).
En dehors des beta-thalassémies hétérozygotes et
des Hb Bart's, une technique de confirmation validera les hémoglobinopathies
mises en évidence par CLHP.
REFERENCES
1. Maier-Redelsperger M, Girot R. Diagnostic biologique des maladies
de l'hémoglobine. Feuillets de biologie 1989 ; XXX : 29-38.
2. Bruegger BB, Keenan DH, Sivorinnovsky G. Quantification of
hemoglobin A2 and identification of haemoglobin variants using a fully
automated hemoglobin analyser. Clin Biochem 1988 ; 21 : 363-6.
3. Mosca A, Carpinelli A, Majavacca R, et al. An evaluation
of the Diamat HPLC analyser for simultaneous determination of haemoglobins
A2 and F. J Automat Chem 1989 ; 11 : 273-9.
4. Delahunty T. Convenient screening for hemoglobin variants
by using the Diamat HPLC system. Clin Chem 1990 ; 36/6 : 903-5.
5. Tan GB, Aw TC, Dunstan RA, Lee SH. Evaluation of high performance
liquid chromatography for routine estimation of haemoglobin A2 and F.
J Clin Pathol 1993 ; 46 : 852-6.
6. Pic P, Ducroq R, Girot R. Séparation des hémoglobines
F, Fac, S, C, A1c et dosage de l'hémoglobine F par chromatographie
liquide haute performance. Ann Biol Clin 1994 ; 52 : 129-32.
7. Godart C, Bardakdjian Michau J, Prehu C, Giroud C, Galacteros
F. Amélioration des procédures de CLHP appliquée
au diagnostic des hémoglobinopathies. Congrès de la Société
française d'hématologie 1994.
8. North ML, Piffaut MC, Duwig I. Hémoglobinopathies :
actualisation du diagnostic biologique. Rev Fr Lab 1995 ; 275 :
107-16.
9. Riou J, Godart C, Hurtrel D, et al. Cation-exchange
HPLC evaluated for presumtive identification of hemoglobin variants. Clin
Chem 1997 ; 43 : 1 : 334-9.
10. Bardakdjian J, Arous N, Kister J, et al. Further caracterisation
of hb Henri-Mondor or alpha2beta2 26(B8)GLU-->VAL. Hemoglobin
1987 ; 11 : 1-11.
11. Galanello R, Ruggeri R, Addis M, Paglietti E, Cao A. Hemoglobin
A2 in iron deficient beta-thalassemia heterozygotes. Hemoglobin
1981 ; 5 : 613-8.
12. Ducrocq R, Bévier A, Leneveu A, et al. L'hétérozygotie
composite HbS/HbHope : un piège dans le dépistage néo-natal
de la drépanocytose. Congrès de la Société
française d'hématologie 1998. Hématologie,
n° hors série, février 1998 ; 15.
|
Version imprimable
