Le cheveu : un efficace marqueur biologique d’exposition aux xénobiotiques

ARTICLE

La première application analytique en matière d'analyse des cheveux est ancienne puisque, dès 1836, Marsh développe une méthode permettant de doser l'arsenic dans les cheveux. Dès cette époque, on constate que les phanères sont susceptibles de concentrer l'arsenic. Plus récemment, à partir des années soixante, différentes études ont été menées sur l'exposition aux métaux lourds et leur détermination dans les cheveux. L'analyse des substances organiques fixées dans le cheveu après exposition à des xénobiotiques apparaît au début des années 80 et est rendue possible par le développement de nouvelles méthodes analytiques très sensibles et très spécifiques comme la radio-immunologie (RIA) ou la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), et plus récemment la chromatographie en phase liquide couplée à la mesure par barrette de diodes (HPLC-DAD). Le promoteur de cette analyse organique est Baumgartner [1] qui, en 1979, décrit une technique radio-immunologique pour la détection des opiacés dans les cheveux de toxicomanes. Depuis cette date, divers travaux montrent l'intérêt de la détermination de molécules très variées : stupéfiants et produits de substitution, médicaments, polluants et plus récemment anabolisants. La majorité des travaux publiés à ce jour concernent la médecine légale. Pour ce qui est des applications au domaine médical, bien que le champ d'investigation soit immense, les études sont moins nombreuses.

L'intérêt de l'analyse des cheveux réside dans le fait qu'elle permet de mesurer une exposition à des xénobiotiques sur une longue durée, au contraire des mesures dans des milieux classiques : sang et urines. Cette fenêtre de détection est d'autant plus importante que les cheveux sont longs. En effet, la croissance au niveau du bulbe étant voisine de 0,3 à 0,4 mm par jour, chaque segment de 1,0 cm représente sensiblement la mémoire mensuelle d'une exposition. Cette particularité présente un intérêt majeur en pratique médicale car le cheveu peut constituer la seule mémoire biologique à notre disposition permettant de dater une exposition à une ou plusieurs substances. Par ailleurs, le prélèvement n'est pas traumatique et sa conservation est illimitée comme le montre l'analyse d'échantillons provenant de momies précolombiennes dans lesquels on retrouve encore la cocaïne et son métabolite, la benzoylecgonine. Quelles méthodes analytiques peut-on recommander pour procéder à ces déterminations ? Comment peut-on interpréter les résultats obtenus et quelles sont les indications de ce type d'analyse ? Les auteurs tentent de répondre à ces deux questions à l'aide d'une revue de la littérature et à la lumière de leur expérience personnelle.

Mode d'incorporation des médicaments et des stupéfiants dans les cheveux

Ce phanère comporte une trame protéique importante, fabriquée à partir des protéines puisées dans la microcirculation capillaire. Ces protéines assurent également une fonction de transport des médicaments, des stupéfiants ou des polluants, dont l'exposition régulière entraîne une accumulation dans la trame protéique des cheveux. Ceci est un peu comparable à l'hémoglobine glyquée qui reflète l'imprégnation glycémique d'un individu au cours des dernières semaines. En fait, l'incorporation des xénobiotiques dans les phanères est beaucoup plus complexe puisqu'elle fait intervenir d'autres mécanismes parmi lesquels il faut citer l'incorporation de nombreuses substances à partir de la sueur et du sébum.

L'incorporation des médicaments et des stupéfiants dans les cheveux a fait l'objet de divers travaux qui montrent que l'affinité des différentes molécules pour la mélanine, leur lipophilie, ainsi que leur perméabilité membranaire jouent un rôle important. Ainsi la cocaïne s'incorpore cent fois plus que la benzoylecgonine, métabolite polaire peu lipophile. Cela explique que, malgré une demi-vie beaucoup plus courte, la concentration en cocaïne dans les cheveux soit toujours supérieure à celle de la benzoylecgonine, contrairement au sang ou aux urines. La même constatation peut être faite dans les cheveux d'héroïnomanes dont la concentration en 6-monoacétylmorphine est très largement supérieure à la teneur en morphine. Le rapport est inversé dans le sang et les urines conformément à la demi-vie de la 6-monoacétylmorphine extrêmement brève comparée à celle de la morphine. Là aussi, la grande lipophilie de la 6-monoacétylmorphine en regard de celle de la morphine semble déterminante.

Pour les cannabinoïdes, molécules pourtant très lipophiles, il a été montré que l'incorporation était médiocre. Cela peut s'expliquer par un faible passage de ces substances à travers les membranes biologiques en raison de leurs propriétés physicochimiques. En ce qui concerne les médicaments, l'incorporation des principes actifs est variable en fonction des caractéristiques physicochimiques des molécules (lipophilie, pH), mais les cheveux montrent en règle générale des concentrations supérieures à celles rencontrées dans le sang.

Le prélèvement

Les cheveux sont généralement prélevés au sommet et à l'arrière du crâne, au niveau du vertex postérieur. Une mèche de 60 cheveux (diamètre d'un crayon) est largement suffisante. Après orientation racine-extrémité par une cordelette (fixée à 1 cm de la racine avant la coupe, ce qui facilite cette opération), la mèche est prélevée le plus près du cuir chevelu et coupée avec des ciseaux. Les bulbes n'étant pas nécessaires, il n'y a pas lieu d'arracher les cheveux. La conservation s'effectue en tube sec ou dans une enveloppe, à température ambiante. Les poils pubiens, axillaires ou des membres peuvent également être utilisés.

Analyse des stupéfiants

Les premières publications dévolues à l'analyse des substances organiques dans les cheveux ont toutes été orientées vers des applications médico-légales. Dans ces conditions, il n'est pas étonnant de voir que les travaux initiaux soient consacrés à l'identification des stupéfiants. C'est en 1979, que Baumgartner et al. [1] publient l'important article qui allait révolutionner la toxicologie analytique de cette fin de siècle. À cette époque, la mise en évidence des analytes est exclusivement basée sur la RIA, seule technique suffisamment sensible. Plus tard, quelques tentatives seront effectuées par polarisation de fluorescence [2], sans grande conviction, néanmoins. Compte tenu des implications médico-légales, l'analyse des stupéfiants dans les cheveux se fait essentiellement de nos jours par GC-MS, seule méthode reconnue comme méthode de référence. Ainsi, dans les lignes qui vont suivre, ne seront présentées que des procédures faisant appel à ce type de couplage, même si on ne peut pas exclure la chromatographie liquide couplée à la fluorimétrie [3] ou l'électro- phorèse capillaire [4].

L'héroïne

Sujet majeur de l'identification de stupéfiants dans les cheveux, l'absorption de l'héroïne a pu être caractérisée selon quatre périodes successives : analyse des opiacés totaux par RIA [1], rapport morphine sur codéine après analyse par GC-MS [5], identification de la 6-monoacétylmorphine [6] et, enfin, identification de l'héroïne elle-même [6, 7].

Trois méthodes de préparation des cheveux sont généralement utilisées : hydrolyse acide [8], hydrolyse enzymatique [9] et incubation méthanolique [10]. L'hydrolyse alcaline, qui est la seule à conduire à une solubilisation complète de la matrice kératinisée, est à proscrire. En effet, le pH alcalin induit la transformation de la 6-monoacétylmorphine, marqueur exclusif de l'héroïne, en morphine, avec les difficultés inhérentes d'identification des toxicomanes.

Les principales étapes analytiques de ces trois méthodes sont présentées dans le tableau 1. Toutes font appel à une décontamination préalable.

Dans tous les cas, les différentes procédures font appel à des standards internes ajoutés au début de la phase de préparation ; les deux premières utilisent des standards deutérés, la dernière la méthaqualone. La 6-monoacétylmorphine est retrouvée majoritairement par les trois techniques. Du fait d'une étape complémentaire de purification, les deux premières méthodes conduisent à des extraits plus propres et donc des chromatogrammes moins chargés. Les concentrations mesurées après hydrolyse acide ou enzymatique sont légèrement supérieures à celles obtenues après incubation méthanolique [11]. Néanmoins, cette dernière méthode apparaît comme universelle pour tous les xénobiotiques incorporés dans les cheveux. Il semble se dégager un consensus international pour considérer un seuil de positivité de 0,5 ng/mg de 6-monoacétylmorphine [12]. Selon Pépin et Gaillard [13], il y aurait concordance entre quantité de produit utilisé et concentration dans les cheveux. D'autres auteurs sont plus nuancés [7]. La technique d'hydrolyse acide a fait l'objet d'un consensus national en France, sous l'égide de la Société française de toxicologie analytique [14].

La cocaïne

La consommation simultanée d'héroïne et de cocaïne a rapidement conduit les analystes à développer des procédures communes d'identification des analytes. Ainsi, les trois méthodes proposées précédemment s'appliquent également à la cocaïne (tableau 1). Seule, la mise en évidence de l'anhydroecgonine méthyl ester, composé obtenu par pyrolyse de la cocaïne base ou crack, permet de différencier le consommateur de chlorhydrate de cocaïne, surtout sniffé, de l'individu fumant du crack [15]. Les concentrations sont généralement faibles pour l'anhydroecgonine méthyl ester. Le risque principal de ce type d'analyse est la contamination externe par l'environnement [16]. C'est pourquoi, plutôt que des seuils de positivité, les analystes préfèrent des ratios de métabolites spécifiques (benzoylecgonine/cocaïne > 0,05) ou l'identification de métabolites spécifiques (cocaéthylène ou norcocaïne) [17]. L'hydrolyse alcaline est à proscrire, car elle conduit à une dégradation totale de la cocaïne et de la benzoylecgonine.

Les amphétamines

La plupart des travaux consacrés aux amphétamines ont été publiés par des auteurs japonais, confrontés historiquement à ce type de toxicomanie. Même si les résultats obtenus après hydrolyse acide ou enzymatique ou après incubation méthanolique sont à considérer [18], il apparaît que l'hydrolyse alcaline est la mieux adaptée pour la préparation de l'échantillon, d'autant que le pH est alors optimal pour une étape complémentaire de purification en phase liquide-liquide. Les principales étapes de l'analyse sont résumées dans le tableau 1. Cette procédure permet l'analyse simultanée de l'amphétamine, la méthamphétamine, la 3,4-méthylènedioxyamphétamine, la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine, la MDEA et la MBDB. Le seuil de positivité est fixé à 0,5 ng/mg pour chaque composé.

Le cannabis

Parmi tous les stupéfiants caractérisés dans les cheveux, les dérivés du cannabis sont les plus difficiles à analyser. Leurs concentrations mesurées sont faibles et ils sont difficiles à extraire de la matrice kératinisée. En pratique, seule l'hydrolyse alcaline est à retenir. Jurado et al. [20] ont proposé une procédure originale qui associe d'abord hydrolyse acide pour analyser les opiacés et les dérivés de la cocaïne, puis alcalinisation du résidu pour extraire les cannabinoïdes. Mais la méthode la plus élégante reste celle publiée par Cirimele et al. [21] qui rapportent l'identification et la quantification directe, sans dérivation du DELTA9-tétrahydrocannabinol (THC), du cannabinol et du cannabidiol. Les concentrations mesurées sont généralement faibles, n'excédant que rarement 2 ng/mg. Le risque de contamination externe par les fumées est éliminé par l'identification du métabolite carboxylé, l'acide 11 nor-DELTA9-tétrahydrocannabinol-9-carboxylique (THC-COOH). Cette procédure [22] requiert l'utilisation de l'ionisation chimique négative (GC-MS-NCI) tant les concentrations sont basses, de l'ordre de quelques pg/mg. Les principales étapes de ces deux méthodes sont rapportées dans le tableau 1. Une décontamination préalable par dichlorométhane-eau-dichlorométhane est indispensable. Le THC-d₃ et le THC-COOH-d₃ sont respectivement utilisés comme standards internes. À ce jour, peu de laboratoires recherchent en routine les cannabinoïdes. Il n'existe donc pas, pour le moment, de consensus sur un seuil de positivité.

Les narcotiques médicamenteux

À côté des stupéfiants dits classiques, les toxicologues ont également développé des procédures analytiques pour l'identification et la quantification de certains narcotiques, pour des applications tant cliniques que médico-légales. Le tableau 2 rapporte les principales publications à ce jour.

Analyse des médicaments

Contrairement aux stupéfiants, les travaux concernant l'analyse des médicaments dans les cheveux sont moins nombreux. Les premières méthodes décrites font appel à la GC-MS. Plus récemment l'HPLC-DAD a été appliquée à l'analyse des médicaments, en particulier pour les molécules thermolabiles comme la carbamazépine ou non volatiles comme l'acénocoumarol.

La préparation de l'échantillon est moins délicate que pour les stupéfiants, puisque le problème de la contamination externe des cheveux ne se pose pas. Dans la majorité des techniques, il est recommandé un dégraissage par un solvant (dichlorométhane par exemple), précédé d'un lavage à l'eau chaude pour les prélèvements réalisés au cours d'autopsies. Les cheveux sont ensuite soit broyés sous forme d'une poudre dans un broyeur à boulet, soit coupés en segments courts de 1 à 2 mm. Ils sont alors soumis à une hydrolyse alcaline, acide ou enzymatique ou à une simple incubation méthanolique. Outre le fait que l'hydrolyse acide ou alcaline est susceptible de dégrader certaines molécules (benzodiazépines par exemple), l'hydrolyse alcaline conduit à des chromatogrammes beaucoup plus chargés. L'extraction est réalisée en milieu acide ou alcalin en fonction de la nature de la molécule en utilisant soit une phase liquide (solvant organique ou mélange de solvants), soit une phase solide. L'extraction supercritique a également été proposée. Contrairement aux stupéfiants, la quantification s'effectue le plus souvent sans dérivation par GC-MS à l'aide d'un étalon deutéré ou d'un étalon interne autre. Elle peut également être réalisée par HPLC-DAD à l'aide d'un étalon interne.

Certains médicaments présents en très faible concentration sont difficiles à détecter dans les conditions décrites précédemment, on peut citer le flunitrazépam qui nécessite l'emploi d'un GC-MS équipé d'un dispositif d'ionisation chimique négative (GC-MS-NCI).

Les anticonvulsivants

Les études portent essentiellement sur la détermination de la carbamazépine et du phénobarbital par GC-MS. Les principales étapes analytiques sont présentées dans le tableau 3. En ce qui concerne la carbamazépine, un travail récent montre l'intérêt de l'HPLC-DAD [35] après extraction alcaline en phase solide.

Les anxiolytiques

Deux familles médicamenteuses ont fait l'objet de publications : les benzodiazépines et le méprobamate. En ce qui concerne les premières, les déterminations sont réalisées surtout par GC-MS bien que l'HPLC-DAD offre une alternative intéressante, y compris pour certaines molécules comme l'alprazolam ou l'estazolam [35]. L'analyse des benzodiazépines dans les cheveux pose des problèmes analytiques particuliers, l'hydrolyse acide ou alcaline conduisant à la formation de benzophénones ou de composés de dégradation. Par ailleurs, l'incubation méthanolique montre des rendements insuffisants pour de nombreuses molécules. Le tableau 3 reproduit les conditions opératoires. Pour le flunitrazépam, les concentrations mesurées étant extrêmement faibles, de l'ordre de 50 pg/mg, l'emploi d'un dispositif d'ionisation chimique négative couplé s'avère nécessaire (GC-MS-NCI). La RIA a été utilisée mais elle s'avère d'une sensibilité insuffisante.

Les antidépresseurs

Les travaux réalisés concernent surtout les antidépresseurs tricycliques (tableau 3). Pour certaines molécules, dérivés tricycliques et inhibiteurs de la mono-amine-oxydase, l'HPLC-DAD peut se substituer avantageusement à la GC-MS après extraction en phase solide à pH alcalin [35].

Les neuroleptiques

Les neuroleptiques ont été parmi les médicaments les plus étudiés. L'halopéridol et la chlorpromazine ont été mesurés par HPLC avec détection coulométrique pour le premier et ultra-violette pour le second (tableau 3). En ce qui concerne les autres molécules, il s'agit d'une procédure classique : réduction de l'échantillon, dissolution en milieu alcalin puis extraction en phase liquide ou solide. L'HPLC-DAD [35] constitue également une méthode de choix pour la mesure de cette classe thérapeutique.

Médicaments divers

D'autres médicaments ont été examinés, il s'agit d'antalgiques comme la morphine ; d'antibiotiques parmi lesquels il faut citer l'ofloxacine, la norfloxacine, la ciprofloxacine, la témafloxacine (tableau 3). Certains antibiotiques se sont révélés être des traceurs extrêmement intéressants de la pousse des cheveux, notamment les fluoroquinolones qui peuvent être mises en évidence après une prise unique. Il a été montré que la vitesse de pousse est de 1 cm par mois et qu'il n'y a pas de diffusion axiale significative du principe actif le long du cheveu au cours du temps. Enfin, diverses molécules ont été quantifiées, notamment la digoxine pour laquelle des méthodes immunologiques ont été décrites soit par RIA, soit par MEIA (microparticule enzyme immunoassay) (tableau 3).

Interprétation des résultats

Les indications de l'analyse des médicaments dans les cheveux relèvent de deux domaines : la médecine légale et la médecine traditionnelle.

Les premières applications médico-légales concernent la détection des stupéfiants : différenciation entre consommateur et revendeur, confirmation d'une conduite toxicophile, contrôle d'une cure de sevrage au cours de l'injonction thérapeutique (loi du 31 décembre 1970), circulation de drogue en milieu carcéral.

Pour ce qui est de la médecine légale, la mise en évidence des médicaments dans les cheveux peut être déterminante pour affirmer une exposition chronique chez un sujet non traité (emploi illicite de certaines molécules, administration médicamenteuse abusive à tiers). Elle peut révéler une tentative d'intoxication chronique à des fins criminelles, confirmer la thèse d'un suicide, enfin préciser le traitement permettant d'identifier une victime en l'absence d'autre milieu biologique disponible.

En ce qui concerne la pratique médicale, l'analyse des cheveux s'avère extrêmement intéressante pour contrôler la bonne observance thérapeutique au long cours. Cette approche est particulièrement utile chez les malades pour lesquels l'interrogatoire s'avère difficile, voire impossible. Dans la surveillance thérapeutique, elle apporte des informations pertinentes, par la confirmation d'une erreur de prescription ou de délivrance, lorsque des troubles cliniques sont constatés chez un malade traité, quand des dosages sanguins n'ont pas été réalisés. La majorité des études montre d'ailleurs qu'il existe une corrélation de groupe entre la posologie quotidienne et la concentration dans les cheveux [34, 40, 42-46]. L'analyse des cheveux peut également être un outil très utile au diagnostic clinique. En effet ce peut être la seule investigation biologique pertinente face à une symptomatologie clinique rare n'aboutissant que tardivement à un diagnostic (intoxication médicamenteuse non suspectée au départ, conduite toxicophile à un médicament, syndrome de sevrage). Enfin, elle a été mise à profit dans la mise en évidence d'une exposition médicamenteuse du nouveau-né pendant la grossesse ; en effet les études corrélatives montrent un transfert dose-dépendant des xénobiotiques de la mère vers l'enfant.

CONCLUSION

Aujourd'hui la mesure des xénobiotiques dans les cheveux est une méthode reconnue. Pour la première fois une technique initialement utilisée pour les stupéfiants à des fins médico-légales est étendue au domaine médical et à d'autres molécules. Cette analyse, qui apporte des informations qualitatives et quantitatives, s'avère le complément idéal des mesures dans le sang et les urines. En conclusion, le cheveu, milieu qui présente la propriété unique d'être un calendrier historique de la consommation de xénobiotiques, grâce il est vrai à des progrès analytiques considérables, contribue à la valorisation de l'acte biologique.

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