Exploration de la réponse immune dans un modèle de toxoplasmose congénitale murin

ARTICLE

La toxoplasmose congénitale est due à la transmission transplacentaire d'un protozoaire intracellulaire, Toxoplasma gondii. En France où la séroprévalence est d'environ 50 %, le risque de primo-infection chez la femme enceinte est estimé à 0,5 % d'après les séroconversions [1]. Au cours d'une infection primaire contractée durant la grossesse, l'immunité maternelle est capable de protéger la mère mais pas le fœtus. Cela explique la gravité potentielle des infections congénitales malgré une infection inapparente chez la femme enceinte.

Deux sous-populations lymphocytaires T (CD4⁺ ou CD8⁺) sont distinguées en fonction de leur production de cytokines. Ces lymphocytes sécrètent des cytokines impliquées dans l'activation et/ou la régulation des défenses cellulaires (cytokines de type 1 : IL2, IFNgamma, TNFbeta) ou des cytokines intervenant dans l'immunité humorale (IL4, IL5, IL6 et IL10) [2]. Au cours de la grossesse, la réponse immune maternelle serait une orientation de type 2 à l'interface mère-enfant [3]. Cette orientation privilégierait la réponse immune humorale par rapport à la réponse immune cellulaire augmentant la susceptibilité aux agents pathogènes intracellulaires qui nécessitent une réponse immune cellulaire pour être éliminés. En effet, au cours de la toxoplasmose, une réponse immune de type 1 (IFNgamma, NO et IL2) est nécessaire à l'élimination du parasite alors qu'une réponse de type 2 (IL4 et IL10) est défavorable pour l'hôte [4].

Nous avons étudié ces réponses immunitaires maternelles chez la souris au cours d'une infection aiguë à T. gondii.

Matériels et méthodes

Souris

Quatre lots de souris BALB/c ont été étudiés : souris gestantes G-I (gestantes infectées), G-NI (gestantes non infectées), NG-I (non gestantes infectées) et NG-NI (non gestantes non infectées). Cinq expériences ont été effectuées avec des souris BALB/c standard (IL4^+/+), deux avec des souris BALB/c transgéniques déficientes en IL4 (IL4^-/-) (M. Kopf, Institut d'immunologie, Bâle). Les souris ont été infectées oralement par 20 kystes de T. gondii souche PRU. L'infection des souris gestantes a eu lieu à J11,5 de gestation.

Production de cytokines par les splénocytes

À J7 post-infection (p.i.), les rates ont été prélevées, puis broyées entre deux lames frittées. Après trois lavages dans du milieu RPMI-Hepes-10 % sérum de veau fœtal (SVFi), les splénocytes vivants ont été comptés en utilisant un colorant vital (bleu de trypan) et 100 µl de la suspension cellulaire ajustée à 4.10⁶ cellules/ml ont été mis en culture en présence ou non d'un activateur non spécifique des lymphocytes T, la concanavaline A (Con A) à une concentration de 1 µg/ml, ou spécifique, l'antigène soluble de T. gondii (AST) à une concentration de 1 µg/ml dans des plaques de culture cellulaire de 96 puits dans un volume final de 200 µl par puits. Toutes les étapes se sont déroulées à + 4 °C.

Après 48 heures de culture à 37 °C sous 5 % de CO₂, les surnageants de culture ont été recueillis après centrifugation des plaques. L'IFNgamma, l'IL4, l'IL6, l'IL10, le TNFalpha et le NO ont été dosés dans les surnageants par une méthode Elisa (deuxième anticorps biotinylé, révélation par le système d'amplification avidine-peroxydase) pour les cytokines et par la méthode colorimétrique de Griess pour le NO (sulfanilamide-naphtyléthylènediamine) [5].

Charge parasitaire

La charge parasitaire a été déterminée par subinoculation pour les fœtus et les placentas (inoculation intrapéritonéale des broyats d'organe, recherche d'anticorps anti-toxoplasmes trois semaines plus tard par immunofluorescence indirecte), pour les mères par culture tissulaire pour les poumons à J7 p.i. (révélation par immunofluorescence) et par comptage des kystes cérébraux à J30 p.i.

Résultats

Par rapport aux souris non gestantes IL4^+/+, les souris gestantes IL4^+/+ montraient un taux plus élevé de parasites dans les poumons à J7 p.i. (seuls les poumons des souris gestantes ont montré une culture positive) et un nombre plus important de kystes dans le cerveau à J30 p.i. (tableau). L'infection n'a pas modifié significativement le nombre de petits par portée (6,3 ± 1,2 nouveau-nés chez les femelles infectées contre 5,7 ± 2,3 chez les femelles non infectées).

À J7 p.i., les titres de NO et d'IFNgamma dans le surnageant de culture des splénocytes (figure 1, a et b) étaient significativement augmentés chez les souris G-I par rapport aux souris NG-I sans ou après stimulation. La réponse de type 2 était faible, l'IL4 n'a pas pu être détectée et les titres d'IL10 sont restés bas. Néanmoins, une augmentation significative de la production d'IL10 plus marquée chez les souris gestantes infectées était observée après stimulation (figure 1, c). La production d'IL6 était augmentée chez les souris infectées uniquement en présence d'antigène soluble toxoplasmique (AST) sans différence entre souris gestantes et non gestantes (figure 1, d). Le profil de production du TNFalpha, autre cytokine pro-inflammatoire, était identique (résultats non communiqués).

La susceptibilité des souris gestantes déficientes en IL4 à T. gondii était plus faible que celle des souris gestantes IL4^+/+, caractérisée par un nombre de kystes cérébraux moins important (tableau) et un passage placentaire significativement abaissé puisque 24 % des fœtus des souris IL4^-/- étaient parasités contre 53 % des fœtus des souris IL4^+/+ (p < 0,05, test du khi2). Le nombre de fœtus des souris IL4^-/- était plus important que celui des souris IL4^+/+ sans différence significative induite par l'infection (8,1 ± 2,3 nouveau-nés chez les femelles infectées contre 8,0 ± 1,8 chez les femelles non infectées).

Chez les souris IL4^-/- les titres d'IFNgamma n'ont pas montré de différences notables. En revanche, la production de l'IL6 induite par l'AST n'a pas été retrouvée chez les souris IL4^-/- (figure 2, a) et la production d'IL10 a été plus importante que celle observée chez les souris IL4^+/+ (environ deux à quatre fois plus), néanmoins sans différence significative entre les souris gestantes et non gestantes IL4^-/- (figure 2, b).

Discussion

Ces résultats démontrent que les souris gestantes BALB/c ont une plus grande permissivité à l'infection. La réponse de type 1 (production d'IFNgamma et de NO augmentée) est toujours bien développée et même prédominante chez les souris gestantes IL4^+/+ infectées et la réponse de type 2 est néanmoins présente par le biais d'une production d'IL10 faible mais significativement augmentée par rapport aux souris non gestantes infectées IL4^+/+. L'influence de la réponse de type 2 est illustrée par le modèle de souris IL4^-/-. En effet, les souris gestantes IL4^-/- ont montré une moindre susceptibilité au toxoplasme que les souris gestantes IL4^+/+. La susceptibilité à la toxoplasmose durant la gestation et le passage placentaire dépendraient de l'IL4 et d'un ou plusieurs facteurs sécrétés durant la gestation car l'absence d'IL4 n'annule pas complètement le passage placentaire.

Le mécanisme permettant d'expliquer cette susceptibilité durant la gestation est cependant complexe car, si la qualité de la réponse de type 2 intervient, il n'a pas été observé de diminution de celle de type 1 comme cela a été montré chez des souris gestantes infectées par Leishmania [6]. De plus, nous ne confirmons pas les résultats obtenus dans un modèle murin d'infection toxoplasmique durant la gestation (et non un modèle d'infection congénitale car le passage placentaire n'a pas été étudié dans ce travail) [7], où les auteurs ont montré une susceptibilité augmentée des souris gestantes caractérisée par une baisse de la réponse de type 1. Ces différences majeures sont dues à l'emploi d'une race de souris différente et à l'utilisation de tachyzoïtes d'une souche de toxoplasme semi-virulente (S 273) inoculés par voie intrapéritonéale. En effet, des études effectuées dans notre laboratoire semblent indiquer que la souche de toxoplasme ainsi que le stade parasitaire influencent fortement le profil de cytokines produites par les splénocytes [8].

Le statut immunologique de la gestation étant préférentiellement orienté vers la réponse de type 2 [3], il semble que la production d'IL10 soit nécessaire, voire indispensable à la gestation. En effet, les souris IL10 déficientes sont stériles (M. Kopf, communication personnelle). En l'absence d'IL4, l'IL10 pourrait participer à un phénomène de « compensation » permettant à la gestation de s'installer et même d'arriver à son terme sans avortement, le nombre de fœtus a même été légèrement supérieur chez les souris IL4^-/-. Néanmoins, l'augmentation d'IL10 n'a pas accru la susceptibilité à l'infection chez les souris IL4^-/- ni le passage transplacentaire. De même, chez les souris IL4^+/+, la légère augmentation de production de l'IL10 chez les souris gestantes infectées ne saurait expliquer la sensibilité augmentée de ces souris. En effet, le principal mécanisme par lequel l'IL10 est défavorable à l'élimination de T. gondii est l'inhibition de la production du NO induit par l'IFNgamma [9]. Cette augmentation d'IL10 pourrait, en inhibant la réaction inflammatoire au cours de l'infection aiguë [10], diminuer le passage placentaire. La faible production de cytokines pro-inflammatoires observée chez les souris IL4^-/- pourrait expliquer la baisse du passage transplacentaire du toxoplasme. En effet, certains auteurs ont évoqué l'hypothèse qu'une destruction du tissu placentaire par l'inflammation autour des foyers d'infection toxoplasmique aboutirait à une facilitation du passage du parasite vers le fœtus [11].

Considérant l'augmentation des cytokines (IL10 et IFNgamma) et du NO chez les souris gestantes BALB/c IL4^+/+ durant l'infection au cours de la gestation, il est possible que le mécanisme augmentant la susceptibilité à l'infection intervienne avant la mise en place de l'immunité spécifique cellulaire. Il en résulterait une augmentation de la charge parasitaire et secondairement une élévation des cytokines. Ceci reste à démontrer, notamment en établissant la date du passage des parasites par rapport à l'infection.

Les cellules NK (natural killer) responsables de la protection dans la phase précoce de l'infection (moins de cinq jours p.i.) [4], ainsi que les macrophages et les lymphocytes CD8⁺, seraient intéressants à étudier car de nombreuses molécules sont capables d'inhiber leur activité, en particulier les hormones associées à la grossesse, l'IL4 mais aussi le PGE2 et le TGFbeta, présents dans le placenta [12].

Bien que les mécanismes mis en cause ne soient pas connus, ce travail est la première observation montrant que la gestation induirait par le biais d'une réponse de type 2 une susceptibilité maternelle accrue à T. gondii et un passage transplacentaire plus important.

REFERENCES

1. Bougnoux ME, Hubert B. Toxoplamose congénitale. Bilan de la prévention primaire en France. BEH 1990 ; 4 : 13-4.

2. Carter LL, Dutton RW. Type 1 and type 2 : a fundamental dichotomy for all T-cell subsets. Curr Opin Immunol 1996 ; 8 : 336-42.

3. Lin H, Mosmann TM, Guilbert L, Tuntipopipat S, Wegmann TG. Synthesis of T helper 2-type cytokines at the maternal-fetal interface. J Immunol 1993 ; 151 : 4562-73.

4. Hunter C, Suzuki Y, Subauste C, Remington J. Cells and cytokines in resistance to Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol 1996 ; 219 : 113-25.

5. Thouvenin M. Facteurs immunologiques cellulaires liés à la transmission fœto-maternelle de Toxoplasma gondii dans un modèle expérimental murin. Mémoire du DEA « Interaction hôtes parasites », Paris XII, 1995.

6. Krishnan L, Guilbert LJ, Russel AS, Wegmann TG, Mosmann TM, Belosevic M. Pregnancy impairs resistance of C57BL/6 mice to Leishmania major infection and causes decreased antigen-specific IFNgamma responses and increased production of T helper 2 cytokines. J Immunol 1996 ; 156 : 644-52.

7. Shirahata T, Muroya N, Ohta C, Goto H, Nakane A. Enhancement by recombinant human interleukin 2 of host to Toxoplasma gondii infection in pregnant mice. Microbiol Immunol 1993 ; 37 : 583-90.

8. Candolfi E, Villard O, Thouvenin M, Kien T. Role of nitric oxide-induced immune suppression in toxoplasmosis during pregnancy and in infection by virulent strain of Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol 1996 ; 219 : 141-54.

9. Gazzinelli RT, Oswald IP, James ST, Sher A. IL10 inhibits parasite killing and nitrogen oxide production by IFN-gamma-activated macrophages. J Immunol 1992 ; 148 : 1792-6.

10. Gazzinelli RT, Wysocka M, Hieny S, et al. In the absence of endogeneous IL10 mice acutely infected by Toxoplasma gondii succumb to a lethal immune response dependent on CD4⁺ T cells and accompanied by overproduction of IL12, IFNgamma, and TNFalpha. J Immunol 1996 ; 157 : 798-805.

11. Couvreur J. Les fœtopathies infectieuses. In : Debré R. Traité de pédiatrie. Paris : Masson, 1979 : 494-518.

12. Roberts CW, Satoskar A, Alexander A. Sex steroids, pregnancy-associated hormones and immunity to parasitic infection. Parasitol Today 1996 ; 12 : 382-8.