ARTICLE
Depuis Louis Pasteur et l'individualisation de la notion de « maladie
virale », et durant tout le xxe siècle, n'ont cessé
de se développer les connaissances sur les virus, leur épidémiologie,
leurs effets pathogènes, les méthodes de diagnostic et de
traitement. L'avènement en 1949, grâce à Enders, des
cultures cellulaires a permis les premiers isolements viraux (entérovirus,
herpèsvirus et adénovirus) ; le développement, dès
1960, des méthodes d'immunomarquage et des anticorps monoclonaux
a favorisé les recherches d'anticorps et la détection antigénique,
réduit les délais de réponse et permis l'identification
de nouveaux virus. L'apparition, aux environs de 1980, des premières
médications spécifiques antivirales est venue justifier
si besoin en était la recherche des virus en pathologie quotidienne
pour mieux en établir l'indication thérapeutique. Enfin,
depuis 1985, les méthodes de biologie moléculaire se sont
imposées à juste titre en complément ou en substitution
des méthodes traditionnelles dans le diagnostic viral. Dans ce
domaine une importance particulière doit être faite aux techniques
d'amplification génomique initialement décrites par Saïki
en 1985 [1].
La virologie médicale quotidienne doit répondre à
des objectifs aussi variés que l'épidémiologie des
viroses, le diagnostic précoce, rapide, sensible et spécifique
d'infection virale, la prédiction et la confirmation de maladie
virale, l'évaluation quantitative du risque et l'adaptation et
le suivi de la thérapeutique. La plupart des critères biologiques
utilisés à ces effets se trouvent profondément perturbés
par la sensibilité particulière des sujets immunodéprimés
à développer des infections virales souvent graves et d'apparence
inhabituelle, notamment par réactivation de virus demeurés
latents dans l'organisme et par transactivations réciproques de
virus ou d'autres agents infectieux.
La culture cellulaire, qui demeure la méthode de référence
pour détecter les virions réplicatifs et l'activité
des antiviraux, est lourde et nécessite un prélèvement
maintenu infectieux et des délais de réponse souvent longs.
Elle est en défaut pour les virus non cultivables et pour les virions
inactivés. Sa sensibilité est faible dans des fluides biologiques
comme le liquide céphalo-rachidien (LCR) ou l'humeur aqueuse. Les
détections antigéniques par immunofluorescence ou méthode
immunoenzymatique manquent de sensibilité malgré un certain
aspect semi-quantitatif et peuvent être en défaut lorsqu'existent
des complexes immuns. Les anticorps sont d'apparition souvent différée
dans l'infection aiguë et ils ne permettent guère, à
quelques exceptions près, qu'un diagnostic rétrospectif.
Toutefois, les IgM ont une forte valeur diagnostique dans la primo-infection
rubéolique ou dans l'hépatite B en phase aiguë. La
recherche et le dosage de cytokines comme l'interféron alpha sont
des éléments d'orientation complémentaires dans les
méningo-encéphalites virales, de même que le dosage
de la protéine MxA, protéine antivirale synthétisée
par la cellule sous l'effet de l'interféron, pourrait dans l'avenir
être un marqueur de l'activité du traitement par interféron.
Par contre les méthodes de biologie moléculaire permettent,
dans tous types de prélèvements, la détection de
quelques copies du génome viral qui s'avèrent d'excellents
marqueurs d'infection. L'identification par hybridation est un élément
de spécificité absolue. La mesure de la charge virale par
quantification génomique apporte des arguments prédictifs
et de suivi évolutif qui faisaient défaut par ailleurs.
La biologie moléculaire a permis également l'amélioration
des antigènes utilisés en sérologie, l'obtention
d'une nouvelle génération de vaccins, le génotypage
des souches virales, la détection des mutations à l'origine
des résistances aux antiviraux et l'établissement de la
carte génomique de nouveaux virus.
Bien que nécessitant une particulière rigueur technique,
la biologie moléculaire apporte beaucoup dans le diagnostic et
la surveillance quotidienne des infections virales dans la mesure où
le biologiste sait l'interpréter, en adapter les indications et
se souvenir de l'existence de la latence, des variations et des mutations
virales.
Les méthodologies de la biologie moléculaire s'intéressent
d'abord aux génomes eux-mêmes puis aux messagers premiers
produits de l'expression des gènes et enfin aux protéines
fruits de leur traduction. Le développement considérable
des applications en virologie est directement lié à la parfaite
connaissance de la structure, de l'organisation et du fonctionnement du
génome viral.
Les génomes viraux
À la différence des autres micro-organismes et des eucaryotes,
les virus ne possèdent qu'un seul acide nucléique, désoxyribonucléique
(ADN) ou ribonucléique (ARN), support de leur information génétique.
Ces acides nucléiques sont directement ou indirectement infectieux
comme l'ont montré les expériences de transfection.
L'ADN viral est le plus souvent bicaténaire et sa structure est
celle de la double hélice où chaque brin est un enchaînement
de désoxyribonucléotides formés d'une base purique
(adénine : A, guanine : G) ou pyrimidique (cytosine : C, thymine
: T) et d'un désoxyribose 5'phosphate. Toutes les chaînes
commencent par un nucléotide avec une extrémité 5'OH
et se terminent par un nucléotide avec une extrémité
3'OH. Les deux brins d'orientation opposée, antiparallèles
par complémentarité des couples A = T et G = C, forment
la double hélice. Les brins sont dissociables par dénaturation
(par la chaleur) et se réassocient par hybridation, deux phases
majeures utilisées en biologie moléculaire. L'ordre d'enchaînement
des bases définit des codons de trois bases qui représentent
les codes des acides aminés (code génétique). Il
faut noter que dans les oligonucléotides de synthèse, l'uracile
(U) peut remplacer la thymine.
L'ARN viral est généralement monocaténaire ou diploïde
(rétrovirus) ; la structure des brins est analogue à celle
de l'ADN avec l'uracile à la place de la thymine et un ribose au
lieu du désoxyribose. Un ARN peut être copié en ADN
monobrin par une enzyme, la transcriptase inverse (reverse transcriptase
ou RT) à partir d'une amorce oligonucléotidique complémentaire
de l'extrémité 3' ou d'un oligo dT apparié à
la queue polyA en 3'. L'ARN viral positif est messager et directement
infectieux ; il comporte une extrémité 5' coiffée
(cap) et une extrémité 3' polyadénylée. L'ARN
viral négatif ne peut être traduit qu'après transcription
en brin positif par une ARN polymérase virale. L'ARN viral peut
être segmenté (8 segments pour les myxovirus ; 11 segments
pour les réovirus), ce qui favorise alors les recombinaisons génétiques
et l'expression d'une grande variabilité. Enfin, chez les rétrovirus,
chaque brin de l'ARN diploïde est copié en un ADN double brin
capable d'intégration dans un gène cellulaire grâce
à des séquences d'insertion aux extrémités
des brins dénommées LTR (long terminal repeat) :
ces virus sont alors présents simultanément sous leur forme
native à ARN et sous une forme cellulaire provirale à ADN.
Les génomes viraux sont soit circulaires (papillomavirus) avec
parfois deux brins d'inégale longueur (hepadnavirus), soit linéaires
(majorité d'entre eux) avec cependant possibilité de circularisation
par l'intermédiaire d'une protéine (adénovirus).
Certains (herpèsvirus) possèdent deux régions L (long)
et S (short) comportant à chaque extrémité des séquences
répétitives inversées à l'origine de la circularisation
et de la formation de quatre isoformes du génome.
Le poids moléculaire des génomes viraux humains varie
de 2,5 à 15.106 d pour les virus à ARN et de
3 à 160.106 d pour les virus à ADN et leur taille
de 7,5 kb (entérovirus) à 150 kpb (herpès simplex
virus) ou 200 kpb (vaccine). Les génomes viraux sont organisés
en gènes de structure (S) codant pour les glycoprotéines
d'enveloppe et les protéines de capside et de core viral et en
gènes non structuraux (NS) à l'origine notamment des enzymes
de réplication (pol), de protéines de régulation
(tax, rex, nef...) ou de transformation (produit de v-onc). Il est également
fréquent de constater que, par mesure d'économie, en raison
des tailles réduites des génomes viraux, une même
zone peut être transcrite selon plusieurs régions de lectures
ouvertes (ORF) et donner naissance à des protéines différentes
(hepadnavirus) [2].
La réplication virale intracellulaire s'effectue en plusieurs
étapes successives mettant en œuvre des ARNm très précoces
inducteurs de protéines initiatrices de la réplication,
puis des ARNm précoces à l'origine des enzymes de réplication
et des ARNm tardifs donnant naissance aux protéines structurales
(herpèsvirus). Dans la cellule permissive la totalité des
étapes précédentes se déroule et aboutit à
la formation et à la libération de nouveaux virions alors
que dans les cellules non permissives ce mécanisme peut être
interrompu à tout moment et il s'établit un état
d'infection latente, chronique, lente ou abortive. Dans ces dernières
éventualités, on peut alors détecter soit le génome
viral en tout ou partie et parfois en plusieurs copies, soit des antigènes
précoces sans qu'il y ait de production de virions infectieux.
La cellule hôte ainsi infectée peut néanmoins transmettre
l'infection virale (cytomégalovirus).
Les outils
Les outils du génie génétique utiles à l'étude
des génomes viraux vont permettre dans un premier temps l'extraction
des ADN et ARN, leur découpage, leur analyse fragmentaire, et leur
séquençage et, dans un deuxième temps, la mise en
évidence qualitative ou quantitative de fragments soigneusement
choisis.
L'extraction
Les méthodes d'extraction, à partir de fluides biologiques
cellulaires on non ou de fragments tissulaires homogénéisés
par appareil de Potter, utilisent des tampons détergents en présence
de protéinase K pour libérer les acides nucléiques
dans le milieu et digérer les protéines associées.
L'extraction des ADN est habituellement réalisée par le
phénol associé au chloroforme ou à l'éther,
suivie d'une concentration à l'alcool. Elle peut aussi être
obtenue par lyse, ou par chauffage analogue à la décomplémentation
du sérum, ce qui a pour effet de détruire les inhibiteurs
non spécifiques de la taq-polymérase [3]. Il existe également
des minicolonnes chargées négativement qui permettent une
fixation-élution de l'ADN (Quiagen). L'extraction des ARN est beaucoup
plus délicate en raison de leur extrême sensibilité
aux RNAses omniprésentes : il est alors nécessaire d'ajouter
à la technique précédente des inhibiteurs des RNAses.
On peut utiliser un réactif commercial à base de sels de
guanidium et de phénol (RNAzol) ou des billes magnétiques
couplées à un poly-dT ou à une sonde pour extraire
les ARN (Dynal). Une suspension de poudre de verre a aussi été
proposée pour extraire ARN et ADN [4].
Les enzymes-outils
Les enzymes ont une place prépondérante dans toutes ces
études. Les enzymes de restriction utilisées au laboratoire
sont des endonucléases d'origine bactérienne coupant l'ADN
double brin au niveau de séquences palindromiques spécifiques.
Les fragments obtenus sont de taille réduite et peuvent ainsi être
facilement analysés. La RT codée par le gène pol
des rétrovirus transcrit l'ARN en ADN complémentaire (ADNc)
dans le sens 3'---> 5'. Elle a aussi une activité de type RNase
H qui détruit l'ARN dans les hybrides ARN-ADN. Elle est très
utilisée pour la construction de banques d'ADNc et pour les techniques
d'amplification en chaîne des ARN (RT-PCR). D'autres enzymes ont
un rôle important : l'ADN polymérase I et le fragment de
Klenow qui en dérive et la T4 ADN polymérase sont utilisées
pour copier un ADN à partir d'une matrice. Les ARN polymérases
transcrivent l'un des brins de l'ADN en un brin d'ARN (T7 ARN polymérase).
La taq polymérase thermostable d'origine bactérienne (thermus
aquaticus) réplique l'ADN dans des cycles opératoires
stricts automatisés. Enfin DNases et RNases permettent d'éliminer
respectivement l'ADN ou l'ARN contaminant des préparations biologiques.
La séparation
La séparation et l'étude analytique des fragments d'acides
nucléiques obtenus sont mises en œuvre par électrophorèse
en gel de polyacrylamide de 3,5 à 15 % pour des fragments de 20
à 2 000 pb ou d'agarose, de 0,6 à 1,5 % pour des fragments
de 0,2 à 20 kb. L'adjonction de bromure d'éthidium permet
l'observation du gel d'agarose sous UV et les marqueurs de masse moléculaire
définissent la taille des fragments. Une variante appelée
électrophorèse en champ pulsé permet d'analyser des
fragments d'ADN supérieurs à 50 kb.
Les sondes
Les oligonucléotides de synthèse sont des fragments d'ADN
de moins de 100 bases (généralement de 20 à 50),
simple brin, facilement obtenus actuellement par des automates pilotés
par microprocesseur. Une purification est souvent nécessaire pour
les oligonucléotides de grande taille et lorsqu'ils sont marqués.
Ces oligonucléotides sont utilisés comme amorces ou comme
sondes spécifiques. L'oligonucléotide peut être marqué
pour assurer son repérage et sa quantification. Les sondes peuvent
également être obtenues par clonage. Le marquage au 32P
est valablement remplacé par un marquage en 5' par la biotine (dUTP-biotine)
ligand de l'avidine ou de la streptavidine à forte constante d'affinité
qui est elle-même couplée à un fluorochrome, à
une enzyme ou captée par un anticorps anti-avidine dont le signal
est amplifié. D'autres alternatives sont soit l'utilisation d'un
marquage par la digoxigénine (dUTP-digoxigénine) révélé
par des anticorps anti-digoxigénine ou par un couplage en présence
de glutaraldehyde à la peroxydase qui sera révélé
rapidement sur film radiographique par bioluminescence grâce au
luminol [5]. Des ribosondes (sondes à ARN) sont obtenues après
clonage de l'ADN dans un vecteur. Elles ont une activité spécifique
supérieure à celle des sondes à ADN et sont marquées
grâce à l'incorporation d'ARN triphosphate radio-actif (35S).
Les techniques
L'hybridation moléculaire
Établie sur la complémentarité des bases nucléotidiques
des acides nucléiques, l'hybridation moléculaire utilise
des sondes nucléotidiques marquées qui se fixent électivement
à la séquence cible. L'acide nucléique doit être
extrait et immobilisé sur un support comme le nylon ou la nitrocellulose.
Après lavage, l'hybride est révélé en fonction
du marqueur utilisé. On dispose de plusieurs techniques [6] :
- L'hybridation sur tâche ou dot-blot se réalise
directement sur l'échantillon déposé sur un filtre
; elle révèle la présence du fragment génomique.
- Dans le Southern-blot, l'hybridation s'effectue après
digestion enzymatique de l'extrait, électrophorèse, dénaturation
et transfert sur nitrocellulose ; le southern-blot a un aspect analytique
(mise en évidence de fragments modifiés, de mutations ou
de délétions) et semi-quantitatif ; une technique analogue
existe pour les ARN (Northern-blot).
- L'hybridation en milieu liquide est suivie d'une étape de capture
des hybrides sur un support et de la mesure du signal fonction du marqueur
utilisé.
Ces trois tests requièrent des sondes de 18 à 25 bases.
- L'hybridation in situ se réalise sur coupes tissulaires
ou sur cellules fixées ; elle permet d'associer l'étude
de la morphologie et de la localisation ; elle nécessite une sonde
de 50 bases environ. L'hybridation simple est peu sensible : elle ne détecte
que 104 à 105 copies.
L'amplification enzymatique
La polymerase chain reaction (PCR) [7] est la technique la plus
utilisée (figure 1).
Après extraction et dénaturation de l'ADN ou après
extraction et transcription inverse de l'ARN en ADNc, des amorces synthétiques
s'hybrident à chaque extrémité des deux brins. La
taq polymérase provoque l'élongation des brins en présence
des quatre nucléotides en concentration suffisante. Cette succession
de dénaturation-hybridation-élongation constitue les trois
étapes d'un cycle qui se déroulent à des températures
différentes dans un thermocycler ; le cycle sera renouvelé
n fois (25 à 40) et permettra d'obtenir une population homogène
de 2n copies de l'acide nucléique cible initial qui
sera visualisée par électrophorèse et identifiée
par hybridation. Cette méthode est très sensible et détecte
quelques copies du génome viral. Toutefois la variabilité
de certains gènes est à l'origine de fausses réactions
négatives ; la contamination par des ADN étrangers, ou par
des amplicons, est responsable de faux positifs ; la taq polymérase
réalise de fréquentes erreurs de copies ; le choix de la
zone à amplifier est fondamental : elle doit être spécifique,
de taille suffisante et se situer dans une région hautement conservée.
Il est indispensable de bloquer les activités enzymatiques indésirables
dans l'échantillon, d'inclure dans chaque série des témoins
positifs et négatifs, un témoin d'extraction, et de vérifier
l'absence d'inhibiteurs de la taq polymérase. Pour ce faire, il
est habituel de co-amplifier un fragment génomique d'un gène
cellulaire constamment présent dans les fluides biologiques (gène
de la beta-globine ou du système HLA) ou mieux un témoin
analogue présent à quelques copies. Afin d'augmenter la
spécificité il est possible de réaliser une nested-PCR
(PCR nichée) ou une semi-nested PCR. Le principe consiste
à pratiquer sur un aliquot du premier amplifiat une deuxième
PCR en utilisant des amorces internes aux premières par rapport
à la cible.
La PCR multiplex permet de pallier les inconvénients des
faibles quantités des échantillons. Le principe consiste
à réaliser sur un seul aliquot une amplification simultanée
de fragments génomiques de différents virus grâce
à l'utilisation d'amorces propres à chaque cible. La taille
des fragments amplifiés est choisie de telle sorte qu'ils puissent
être nettement séparés et identifiés par électrophorèse.
Il est en outre indispensable de s'assurer qu'il n'y a pas autohybridation
des amorces entre elles, que les températures d'élongation
sont proches les unes des autres et que les conditions de salinité
et de quantité de réactifs sont appropriées.
Il est parfois nécessaire d'associer à la sensibilité
et à la spécificité de cette technique la localisation
de l'acide nucléique cible au sein de la cellule ou du tissu intacts.
On réalise alors une PCR suivie d'une hybridation in situ
(PCR in situ) sur coupe tissulaire en paraffine ou sur frottis
cellulaires obtenus par cytocentrifugation. Les coupes tissulaires en
paraffine ou les cellules fixées sont déposées sur
une lame. Après déparaffinage et traitement aux protéases,
l'amplification est réalisée sur la lame par adjonction
des réactifs habituels dans un puits spécialement adapté
du thermocycler. La révélation de l'amplification est obtenue
grâce à une sonde interne selon les mêmes protocoles
colorimétriques que l'hybridation habituelle. Il est aussi possible
de pratiquer une co-amplification de plusieurs cibles détectables
grâce à des marqueurs différents [8].
La technique NASBA (nucleic acid sequence based amplification)
permet d'amplifier indifféremment ADN ou ARN sans changement de
température en employant une amorce promoteur pour la T7-ARN polymérase
et la RT. Le rendement est supérieur à celui de la PCR mais
a un risque accru d'amplifications parasites (figure
2).
La technique de l'ADN branché est basée sur un
concept différent : au lieu d'amplifier la cible, c'est le le signal
qui est amplifié par l'utilisation d'une sonde ramifiée
dont chacun des bras du rameau est l'objet du processus de révélation.
La réaction se fait en phase solide : après extraction de
l'acide nucléique, hybridation avec un mélange de sondes
spécifiques d'une part de la sonde de capture du support solide
et, d'autre part, de l'ADN branché amplificateur, la révélation
est obtenue grâce à la phosphatase alcaline en chimioluminescence
(figure 3).
L'amplification est d'environ 1 500 à 1 800 fois par molécule
cible. D'autres méthodes d'amplification enzymatique ont été
décrites mais n'ont pas trouvé à ce jour d'application
quotidienne en virologie médicale (ligase chain reaction :
LCR ; Q beta replicase...).
La quantification des acides nucléiques
Elle est essentiellement mise en œuvre par trois méthodologies.
La méthode de PCR quantitative par compétition
avec standard interne pour les ARN consiste à amplifier simultanément
avec les mêmes amorces l'échantillon extrait et un standard
interne synthétique ayant les mêmes séquences terminales
que la cible mais une région centrale différente et plus
courte et dont les détections différentielles pourront être
obtenues par des sondes spécifiques. Il se produit alors une amplification
compétitive entre la cible et le standard qui peut être mesurée
et exprimée de façon linéaire. Dans le test Amplicor
Monitor est incluse avant extraction une concentration unique de standard
interne ARN. Après amplification (RT-PCR) des dilutions sériées
des produits amplifiés sont hybridées en microplaques avec
une sonde spécifique de la cible d'une part et une sonde spécifique
du standard d'autre part. Après révélation par Elisa
(peroxydase), le résultat est calculé en fonction des densités
des signaux obtenus avec la cible et le standard et exprimé en
nombre de copies d'ARN/ml ou en logarithme décimal (log10). La
sensibilité du test est de 200 copies/ml.
Dans la méthode NASBA quantitative la quantification est réalisée
en introduisant dans la réaction trois contrôles internes
de séquences propres différentes de la cible et reconnues
par des sondes spécifiques. Les signaux obtenus par luminescence
permettent le calcul du nombre initial de copies de l'échantillon.
La sensibilité de la technique est de l'ordre de 400 copies/ml.
La méthode de l'ADN branché est adaptée à
la quantification en comparant le signal obtenu avec la cible à
une courbe d'étalonnage établie à partir de témoins
compris entre 104 et 107 copies. Un test plus sensible
avec seuil de détection à 500 copies/ml a été
développé.
Quelle que soit la méthode utilisée, l'extraction doit
permettre l'élimination de tout inhibiteur ; la procédure
doit être parfaitement standardisée sur des appareils d'excellente
qualité de reproductibilité ; il doit exister une relation
linéaire entre la quantité du produit amplifié et
le nombre initial de copies et le test de détection doit assurer
une relation linéaire entre la quantité du produit et la
valeur du signal. Enfin le prix de revient de ces tests est élevé.
Le génotypage
Il est réalisé sur un fragment génomique isolé
par PCR ou RT-PCR. Plusieurs protocoles sont utilisables :
- La PCR spécifique de type est réalisée sur une
région choisie pour comporter les séquences spécifiques
des types viraux connus avec une amorce universelle et une amorce type-spécifique
et pour amplifier un fragment de taille différente pour chaque
type. La technique peut être effectuée en un temps en mélangeant
les réactifs ou, mieux, en autant de tests que de types recherchés.
La révélation se fait par électrophorèse.
Cette méthode ne prend en compte que les types connus ; elle est
lourde à mettre en œuvre lorsqu'existent de nombreux types
et sous-types.
- La PCR universelle consiste à faire une amplification avec
des amorces universelles prenant en compte tous les types connus ou inconnus.
Divers modes de révélation sont alors possibles : le produit
d'amplification marqué à la biotine est hybridé sur
un support contenant des sondes spécifiques des types connus et
révélé par un conjugué streptavidine phosphatase
alcaline ; le produit d'amplification est soumis à l'action d'endonucléases
choisies pour obtenir des fragments de tailles différentes et séparables
par électrophorèse pour chaque type ou sous-type ; les produits
d'amplification sont séquencés par méthode de Sanger.
On obtient une résolution au niveau du nucléotide. C'est
la méthode de référence encore réservée
à la recherche.
REFERENCES
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Enzymatic amplification of beta-globine genome sequences and restriction
site analysis for diagnosis of sikle cell anemia. Science 1985
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5. Champiat D, Larpent JP. Biochimiluminescence. Principes et applications.
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6. Kaplan JC, Delpech M. Biologie moléculaire et médecine.
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8 Nuovo GJ. PCR in situ hybridization. Protocols and applications.
2nd edit, New York, Raven Press, 1994.
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