ARTICLE
La bactériologie des infections de l'œil
a évolué durant ces dernières années grâce
à l'amélioration des techniques d'isolement et d'identification
des agents pathogènes potentiels par des méthodes traditionnelles,
mais aussi, grâce à de nouvelles techniques recherchant antigènes
ou génome. Les techniques de biologie moléculaire, antérieurement
utilisées sur d'autres prélèvements, sont également
applicables aux prélèvements oculaires et sont susceptibles
d'améliorer les performances du diagnostic dans les prochaines
années.
Il est essentiel de connaître les bactéries
impliquées dans les différentes infections oculaires afin
d'adapter les méthodes de recherche en fonction de leurs particularités
: fragilité, exigences de culture, caractéristiques antigéniques...
Les liquides endoculaires (humeur aqueuse et vitré...)
sont stériles, contrairement à la surface de l'œil
qui possède une flore résidente saprophyte (tableau
1) [1] qu'il ne sera pas toujours facile de distinguer de la flore
« pathogène » dont on peut dresser une liste (non exhaustive)
en fonction des manifestations cliniques (tableau
2) [2]. Nous détaillerons les agents responsables des infections
oculaires en opposant les infections oculaires superficielles et les endophtalmies
avant d'aborder le diagnostic bactériologique proprement dit.
Étiologies
Les principales bactéries
responsables d'infections oculaires superficielles
Certaines espèces bactériennes sont
retrouvées plus fréquemment que d'autres selon l'âge
des patients.
En période néonatale, Chlamydia
trachomatis et Neisseria gonorrhoeae occupent une place dominante.
L'infection gonococcique est rare en France grâce aux instillations
prophylactiques systématiques, l'infection à C. trachomatis
est non négligeable puisqu'elle est responsable, pour Armstrong,
de 28 % des endophtalmies néonatales [3]. Une enquête récente
multicentrique réalisée en France en dehors du contexte
d'endophtalmies néonatales a montré, lors d'une recherche
systématique, que le portage oculaire néonatal de C.
trachomatis variait de 1 à 12 % selon les centres [4].
Chez le nourrisson et l'enfant, Haemophilus
influenzae occupe une place importante, surtout avant l'âge
de 3 ans, mais Streptococcus pyogenes et S. pneumoniae,
de même que Branhamella catarrhalis peuvent aussi être
rencontrés.
Chez l'adulte, Staphylococcus aureus,
Branhamella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae sont les espèces
les plus fréquemment rencontrées ; les autres streptocoques,
les entérobactéries et les Moraxella, Acinetobacter
et Haemophilus sont isolés plus rarement. Il est certain
que l'infection à C. trachomatis chez l'adulte est sous-estimée
en France du fait des difficultés de diagnostic. Ainsi C. trachomatis
est à l'origine de 18 % des atteintes oculaires externes au
Danemark [5]. Dans une étude personnelle, nous l'avons retrouvé
chez 57 % des adultes consultant pour conjonctivite aiguë ou chronique
[4].
Dans les kératites [2, 6], S. aureus
et S. epidermidis sont les principaux agents (27
%), les autres bactéries à Gram positif, cocci : streptocoques
(14,5 %) ou bacilles : corynébactéries ou autres (10 %),
occupent une place moindre, mais importante. Parmi les germes à
Gram négatif, Neisseria et Branhamella occupent une
place restreinte (0,5 %) presque à égalité avec Haemophilus,
la plus grande part revenant aux entérobactéries (12 %)
et surtout aux Pseudomonas (29 %). La place de C. trachomatis
est aussi sous-estimée dans les kératites, cette espèce
serait responsable d'au moins 4 % des kératites bactériennes.
La nature des espèces bactériennes
en cause varie selon que le patient est ou non porteur de lentilles [7,
8] (tableau 3), le port
de lentilles favorisant l'infection par les bacilles à Gram négatif
(Enterobacteriaceae, Pseudomonas et Acinetobacter).
Rappelons que le trachome dû à C.
trachomatis (sérovars A, B, Ba et C) est responsable de conjonctivites
trachomateuses qui évoluent en quatre stades allant de la conjonctivite
folliculaire avec surinfections bactériennes fréquentes
à l'ulcère cornéen et l'uvéite. Cette maladie
endémique sévit en zone intertropicale et est rarement évoquée
sous nos latitudes. Les souches de C. trachomatis retrouvées
en France dans les conjonctivites ou kératites appartiennent aux
sérovars D, E, F, G, H, I, J et K.
Les agents des endophtalmies
bactériennes [9-12]
On distingue les endophtalmies postopératoires,
les endophtalmies exogènes opératoires et post-traumatiques
avec ou sans corps étranger et les endophtalmies endogènes.
Les infections postopératoires sont heureusement rares. Les publications
récentes font état de taux d'infection allant de 0,28 à
0,5 % [9]. Dans l'étude multicentrique française rapportée
par Salvanet-Bouccara et al. [12], l'incidence de l'infection oculaire
est de 0,32 % après chirurgie réglée et de 2,8 %
après plaie du globe oculaire. La répartition des germes
retrouvés dans cette étude (tableau
4) révèle, comme dans beaucoup d'enquêtes
rétrospectives récentes, la place importante des bactéries
à Gram positif et de S. epidermidis tout particulièrement
; de même, une progression de la fréquence des infections
à streptocoques-entérocoques est signalée par plusieurs
auteurs [12]. Les endophtalmies dues à des germes anaérobies
sont rares, mais gravissimes [13]. Le pronostic redoutable des endophtalmies
a fait que les travaux portant sur le diagnostic et les traitements prophylactiques
et curatifs se sont multipliés ces dernières années
[9, 14-17].
Diagnostic bactériologique
Le diagnostic bactériologique est essentiellement
un diagnostic direct, reposant classiquement sur la mise en évidence
des bactéries par examen direct (Gram...), par culture, et identification
grâce aux galeries d'identification, mais aussi par mise en évidence
de constituants bactériens spécifiques (génomes,
antigènes, activités enzymatiques).
Le diagnostic indirect sérologique a beaucoup
moins d'intérêt, les infections bactériennes induisant
rarement une réponse immune importante et les sérologies
étant assez peu spécifiques.
Infections superficielles
[2, 18, 19]
Prélèvements
Ils doivent être effectués avant
tout traitement local ou général (antiseptique ou antibiotique)
et avant toute toilette oculaire. Dans le cas de patients recevant un
traitement, celui-ci doit être suspendu depuis au moins 24 heures.
Les prélèvements de conjonctive ou de cornée peuvent
être effectués :
soit avec un coton monté très
serré, stérile en présentation unitaire,
soit avec une spatule en platine de Kimura
préalablement stérilisée, puis refroidie avant usage.
Dans le cas de ces prélèvements
de conjonctives, un frottement doux de la conjonctive inférieure
est effectué en partant de l'angle externe pour aboutir à
l'angle interne de l'œil où l'on récupère la
sécrétion.
Dans le but de diagnostiquer une infection à
Chlamydia, il est indispensable de recueillir de nombreuses cellules,
car il s'agit d'une bactérie à développement intracellulaire.
Les conjonctives sont raclées prudemment soit avec des écouvillons
en plastique imprégnés d'alginate, soit avec du matériel
ophtalmologique. La qualité du prélèvement conditionne
celle des résultats.
Les prélèvements doivent être
acheminés rapidement au laboratoire pour mise en culture, même
si des frottis ont été réalisés sur place
au lit du malade ; ils ne doivent pas arriver desséchés
au laboratoire ; il ne faut pas non plus les noyer en plaçant l'écouvillon
dans un volume important de sérum physiologique. Le recours à
des milieux de transport généraux (Portagerm®...)
ou spécifiques pour C. trachomatis est nécessaire
si le prélèvement n'est pas réalisé au laboratoire.
De même, il faut recourir à des milieux de transport spécifiques
si l'ont veut réaliser différents tests immunoenzymatiques
à la recherche d'antigènes bactériens et pour certaines
techniques de biologie moléculaire.
Diagnostic direct
L'examen cytobactériologique du
frottis avec coloration au May-Grünwald-Giemsa permet de caractériser
les élements cellulaires présents : polynucléaires
neutrophiles ou éosinophiles, lymphocytes, monocytes, cellules
épithéliales. Il constitue un élément d'orientation
étiologique non négligeable. La coloration de Gram permet
de préciser l'absence ou la présence de bactéries
et d'évoquer tel ou tel genre bactérien, Staphylococcus,
Streptococcus, Neisseria, Corynebacterium...
La mise en culture nécessite l'emploi en
routine de milieux riches (trypticase-soja, Mueller-Hinton, gélose
au sang...) et de milieux pour bactéries exigeantes : gélose
« chocolat » additionnée de facteurs de croissance, milieux
solides et liquides pour bactéries anaérobies... Les milieux
de culture seront incubés soit en atmosphère enrichie de
CO2, soit en anaérobiose.
L'identification repose sur la morphologie des
germes et sur les résultats des galeries d'identification (caractères
respiratoires, exigences nutritionnelles, métaboliques glucidiques,
protéiques...), l'antibiogramme complétant l'identification.
Dans le cas particulier de C. trachomatis,
on ne peut utiliser comme pour les autres bactéries, des milieux
synthétiques, leur culture nécessite l'inoculation de cultures
cellulaires Mac Coy, HeLa 229... La sensibilité de la culture cellulaire
a été améliorée d'une part, en bloquant la
prolifération cellulaire par un traitement à la cycloheximide,
d'autre part, par une étape de centrifugation du prélèvement
favorisant l'entrée des bactéries dans les cellules, enfin
par l'utilisation d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux fluorescents
ou marqués à la peroxydase révélant des inclusions
caractéristiques après 2 à 3 jours de culture.
Le diagnostic direct repose aussi sur la recherche
d'antigènes. On peut tenter d'identifier les bactéries directement
à partir du produit pathologique par des méthodes immunologiques
:
soit en visualisant de manière spécifique
les corps bactériens ou leurs inclusions par des anticorps révélés
en immunofluorescence ou par immunoperoxydase ; cela peut s'appliquer
à N. gonorrhoeae, H. influenzae capsulés,
S. pneumoniae et certains streptocoques (groupes A, B, C...) en
visualisant les corps bactériens, et à C. trachomatis
(visualisation des corps réticulés, et des corps élémentaires,
en utilisant des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, détectant
tous les sérotypes de C. trachomatis) ;
soit en utilisant d'autres techniques permettant
de révéler la présence d'antigènes solubles
(ou extractibles) à l'aide de techniques immuno-enzymatiques (Elisa).
On dispose actuellement de techniques plus ou moins rapides (allant, selon
les fabricants, de 15 min à 3 h), il s'agit soit d'Elisa classiques
(en plaques ou avec billes), soit d'Elisa sur filtres ne nécessitant
pas d'appareillage pour lire les résultats.
Enfin des méthodes moléculaires
sont disponibles. Les recherches de génome par hybridation (sondes
chaudes ou froides) manquent de sensibilité. En revanche, les techniques
d'amplification génique sont très prometteuses. Actuellement,
il existe des trousses permettant la recherche de C. trachomatis
et de N. gonorrhoeae sur prélèvements génitaux.
Les premiers résultats obtenus avec ces trousses utilisées
pour rechercher ces germes sur des prélèvements oculaires
révèlent, comme lors des comparaisons de techniques réalisées
sur prélèvements génitaux, une supériorité
des techniques de PCR (polymerase chain reaction), sur les recherches
d'antigènes ou sur les cultures.
Cela a été vérifié
pour C. trachomatis dans un contexte de trachome notamment par
Bobo et al. [20, 21], Bailey et al. [22], mais aussi dans
des contextes de conjonctivites non trachomateuses [23]. On peut classer
les différentes techniques en fonction de leur sensibilité
respective selon Black [24] (figure
1). Ce classement a été retrouvé lors d'une
réévaluation de trousses Chlamydia récemment
réalisée en France [25]. Différentes approches sont
commercialisées ou en développement (PCR, LCR, TMA, Qb...),
elles devront être validées sur prélèvements
oculaires. La majorité des techniques recherche un plasmide cryptique
de C. trachomatis. Pour Bailey [22] dans le trachome, la sensibilité
de la PCR est de 72 % et la spécificité de 92,5 % alors
que l'Elisa, pour une spécificité comparable, a une sensibilité
un peu plus faible de 62 %.
Mais ces outils de biologie moléculaire
mettent en évidence l'ADN de C. trachomatis même en
l'absence d'agent infectieux cultivable [21] montrant une persistance
même après traitement [20] et révèlent la présence
de germes même chez des sujets asymptomatiques.
Il est indispensable de respecter strictement
(tant pour les recherches d'antigènes que de génomes) les
modalités de prélèvement et de traitement de l'échantillon
recommandées par le fabricant.
Diagnostic indirect
Il a peu d'intérêt, il peut essentiellement
être utilisé pour compléter, chez les enfants et les
adultes, le diagnostic des infections à Chlamydia : les
nouveau-nés reçoivent les anticorps passifs d'origine maternelle
(IgG), ce qui complique le diagnostic sauf s'ils possèdent des
anticorps anti-Chlamydia de type IgM, ce qui signe une synthèse
d'anticorps propre à l'enfant.
En conclusion, le diagnostic bactériologique
d'infection oculaire superficielle repose sur le recours à la bactériologie
traditionnelle, mais également sur la recherche d'antigènes
ou mieux de génomes bactériens. Ces dernières approches
rendent accessible le diagnostic de Chlamydia, même pour
un laboratoire non spécialisé, pour les autres laboratoires,
cette approche sera utilisée parallèlement à la culture.
Enfin, dans un contexte d'infection oculaire superficielle,
une recherche de virus, de parasites (amibes) et de champignons doit être
systématiquement associée au diagnostic bactériologique.
Endophtalmies
La confirmation du diagnostic d'endophtalmie ne
peut être obtenue que par l'examen et la mise en culture de prélèvements
d'humeur aqueuse et/ou de vitré.
Prélèvements
La technique de prélèvement de l'humeur
aqueuse a été décrite par Forster en 1974 [26] :
incision cornéenne périphérique non perforante puis
introduction d'une aiguille fine en prenant bien soin de ne pas léser
l'endothélium et le cristallin, recueil de 0,1 à 0,2 ml
d'humeur aqueuse qui sont immédiatement ensemencés sur différents
milieux de culture.
Chez l'aphake (sujet n'ayant plus de cristallin),
l'incision cornéenne est élargie et une deuxième
aiguille est poussée dans le vitré qui est alors aspiré
(0,2 à 0,3 ml peuvent ainsi être récupérés).
Chez les patients phakes (sujets ayant gardé leur cristallin),
le vitré est aspiré après réalisation d'une
perforation sclérale à 3,5 mm du limbe (selon certains auteurs,
cette technique devrait aussi s'appliquer à l'aphake car la voie
d'abord antérieure favoriserait la contamination du vitré).
Si le prélèvement est insuffisant ou si une vitrectomie
thérapeutique est prévue, l'orifice scléral est agrandi
pour permettre l'introduction d'un vitréotome. Il est évident
qu'il s'agit de prélèvements précieux qui doivent
être acheminés rapidement au laboratoire.
Les prélèvements vitréens,
dilués par la solution d'irrigation, doivent être filtrés
avant d'ensemencer les différents milieux de culture.
À noter que lorsqu'une infection fongique
est suspectée, les prélèvements doivent être
réalisés au niveau des exsudats et des foyers inflammatoires
car des études histologiques ont démontré qu'ils
contenaient des champignons.
Lorsqu'une vitrectomie est pratiquée, il
est nécessaire de filtrer la totalité du liquide vitréen
sur membrane Millipore®.
L'étude microbiologique classique des prélèvements
comporte en fait deux étapes : l'examen direct sur lame et la réalisation
de cultures.
Diagnostic direct [1,
9-12, 14, 19]
L'examen direct après coloration de Gram,
de Giemsa ou de Grocott permet d'affirmer la présence de germes
et, s'ils sont présents (en petit nombre), peut permettre une orientation
diagnostique. Il a comme avantage d'être rapide mais présente
deux inconvénients : s'il montre des germes, il ne précise
pas l'espèce en cause et, s'il n'en montre pas, il ne permet pas
d'éliminer une infection endoculaire (faux négatif).
C'est pourquoi l'examen bactériologique
par culture est indispensable car il permet l'identification du germe,
d'en soupçonner la pathogénicité et d'en apprécier
la résistance aux antibiotiques. Il a l'inconvénient de
demander des délais plus longs que l'examen direct. Les cultures
sont pratiquées sur milieux solides (gélose au sang, gélose
chocolat enrichie en facteurs de croissance...), sur milieux liquides
(au thioglycolate, bouillon cœur-cervelle...) et sur milieux spéciaux,
milieux pour hémocultures aérobies et anaérobies
(Sabouraud...). L'incubation se fait à 37 °C en atmosphère
de CO2 et en anaérobiose pour les bactéries ;
de plus une culture à température ambiante est recommandée,
notamment pour les champignons. Pour qu'une culture soit considérée
comme positive, il faut qu'un micro-organisme se développe sur
deux ou plusieurs milieux, ou de manière semi-confluente sur un
ou plusieurs milieux solides au niveau du point d'inoculation. Une culture
équivoque se définit par la croissance d'un micro-organisme
sur un milieu liquide ou une faible croissance sur un milieu solide uniquement
[26]. Il faut savoir que l'ensemencement de prélèvements
ne permet de mettre en évidence un agent infectieux que dans un
cas sur deux.
Pour Forster [26], l'aspiration du vitré
donne de meilleurs résultats que la ponction de chambre antérieure.
Mais un prélèvement négatif au niveau de la chambre
antérieure ne permet pas d'éliminer une infection endoculaire
et il faut pratiquer systématiquement un prélèvement
vitréen devant une suspicion d'endophtalmie.
Malgré tout, un grand nombre de prélèvements
donnent lieu à une culture négative, il faut alors discuter
la réalité de l'infection oculaire et éliminer une
inflammation oculaire ; celle-ci étant écartée, la
possibilité d'une endophtalmie bactérienne, voire fongique,
ne peut être exclue car, sur modèle animal selon Prenner
et al. [27], des prélèvements d'humeur aqueuse et
de vitré peuvent être négatifs alors que l'examen
histopathologique met en évidence un grand nombre de germes dans
le vitré.
Compte tenu de la fréquence des endophtalmies
aiguës ou chroniques dont les prélèvements restent
stériles, et vue la gravité de ces infections, il est nécessaire
d'envisager la recherche de génome bactérien par amplification
génique appliquée aux liquides intra-oculaires. Les articles
et les ouvrages sur le diagnostic bactériologique par biologie
moléculaire se multiplient [28, 29], mais la complexité
du problème dans ce cas précis tient au très large
spectre des espèces impliquées.
On peut schématiquement proposer deux approches.
L'une comparable à celle envisagée dans le diagnostic des
méningites purulentes [30] repose sur la recherche de séquences
communes à toutes les bactéries, à l'aide d'amorces
universelles dont la cible est l'ARN 16S, puis hybridations en cascade
avec des sondes spécifiques des bactéries à Gram
positif et des bactéries à Gram négatif pour arriver
au diagnostic de genre et d'espèce. Nous pouvons proposer une telle
démarche pour le diagnostic des endophtalmies (figure
2) en utilisant les amorces et sondes détaillées
dans le tableau 5. Les
résultats préliminaires utilisant cette approche dans le
diagnostic des endophtalmies sont encourageants ; cette approche a été
étudiée dans le cas des liquides céphalorachidiens
[28-30].
À noter que la détection et l'identification
des streptocoques et des entérocoques peut être réalisée
après amplification génique d'une région intergénique
de séquences codant pour deux ARNt spécifiques
des genres streptocoques et entérocoques [31]. La détection
directe de P. aeruginosa est réalisable par PCR multiplex
basée sur l'amplification de deux gènes codant pour une
lipoprotéine spécifique des Pseudomonas fluorescens
et des lipoprotéines de P. aeruginosa [32].
L'autre approche, peut-être plus prometteuse,
a recours aux puces à ADN ou Chips [33-35], ce qui permet de détecter
un très large éventail de séquences spécifiques
d'un grand nombre d'espèces. Ces techniques ont l'avantage de s'appliquer
aux espèces cultivables et aux espèces difficilement ou
non cultivables. Elles permettront certainement de mettre en évidence
des espèces bactériennes jusque-là insoupçonnées
dans cette pathologie.
Mais ces techniques ont leur limite, le seuil
de détection d'un seul génome ou d'un plasmide est rarement
atteint et reste très théorique, le seuil réel étant
plus élevé car l'étape d'extraction de génome
à partir de l'échantillon n'est pas toujours facile à
maîtriser et à standardiser ; par ailleurs les inhibiteurs
d'amplification bien qu'assez rares dans les liquides intra-oculaires
ne sont pas exceptionnels. Enfin, ces techniques d'amplification connaissent
des problèmes de spécificité du fait de souillures
ou de contaminations de l'échantillon.
Ces techniques ont également l'inconvénient
de ne pas permettre la réalisation d'un antibiogramme, ce qui fait
l'avantage de la culture ; cependant la recherche de mécanismes
de résistance à partir du génome avance à
grand pas.
CONCLUSION
Les techniques du diagnostic bactériologique
sont à un virage, nous sommes à la veille du saut de la
bactériologie pastorienne au diagnostic moléculaire, et
la bactériologie des infections oculaires devrait bénéficier
de ces progrès. Mais il ne faut pas perdre de vue que de toute
façon, quelle que soit l'approche diagnostique, la qualité
des résultats dépend de la qualité du prélèvement
et que, pour obtenir de meilleurs résultats, la collaboration clinicien-biologiste
est indispensable [36].
Article reçu le 27 janvier 1999, accepté
le 3 mars 1999.
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