Oxydation des lipoprotéines et mécanisme d’action des anti-oxydants : apport de la radiolyse gamma

ARTICLE

La radiolyse concerne l'ensemble des transformations chimiques provoquées par l'interaction de rayonnements ionisants avec le milieu qu'ils traversent [1]. Ces rayonnements peuvent être de nature variable (électrons, photons, neutrons, particules chargées lourdes), mais le plus couramment utilisé est le rayonnement g émis soit par le ⁶⁰Co (photons de 1,17 et 1,33 MeV), soit par le ¹³⁷Cs (photons d'environ 660 keV). Ces photons ionisent le solvant (aqueux ou éthanolique), en produisant très rapidement (en quelques dizaines de nanosecondes) des espèces radicalaires. Le soluté dissous dans le solvant ainsi irradié ne subit pas directement l'effet des rayonnements ionisants car sa concentration est choisie suffisamment faible (en général inférieure à 10^{­ 3} mol.l^{­ 1}) pour que cet effet direct soit négligeable. En revanche, le soluté dissous subit l'action des radicaux libres produits par la radiolyse du solvant. La radiolyse g est utilisée pour étudier l'oxydation de molécules d'intérêt biologique [2], qu'il s'agisse des glucides [3], des protéines [4], des acides nucléiques [5, 6] ou des lipides [7]. Une telle approche permet en effet d'étudier les sites d'attaque de ces composés par des espèces radicalaires produites par radiolyse, et de comprendre les mécanismes réactionnels qui en résultent. Toutefois, très peu de travaux sont relatifs à l'action des radicaux libres oxygénés sur les lipoprotéines, alors qu'une telle approche présente un très grand intérêt au regard de la théorie oxydative de l'athérosclérose. En effet, il est maintenant généralement admis que l'oxydation des lipoprotéines, aussi bien des lipoprotéines de basse densité (LDL) [8, 9] que des lipoprotéines de haute densité (HDL) [10], favorise le développement de la plaque d'athérome. En particulier, à la suite de leur accumulation dans l'espace sous-endothélial, les LDL subiraient une oxydation par certaines cellules de la paroi artérielle (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, monocytes-macrophages). Les mécanismes exacts de cette oxydation in vivo sont mal connus.

Toutefois, l'implication de radicaux libres oxygénés tels que l'anion superoxyde (O₂^*­) et le radical hydroxyle (^*OH) est probable. Ces LDL oxydées ne sont alors plus reconnues par les récepteurs classiques, dits B/E, et sont captées au niveau des macrophages grâce à des récepteurs « scavenger », de façon non régulée par la concentration de cholestérol intracellulaire. Ce processus aboutit à la formation de cellules spumeuses, qui vont constituer des stries lipidiques, première étape dans la constitution de la plaque d'athérome. En outre, les HDL, en étant présentes comme les LDL au niveau de l'espace sous-endothélial [11], constituent aussi une cible potentielle pour les radicaux libres, et peuvent donner naissance à des HDL oxydées qui contribuent également au développement de la plaque d'athérome. En particulier, les HDL oxydées perdraient, au moins partiellement, leur capacité d'efflux du cholestérol cellulaire [11, 12]. De plus, au cours de l'oxydation des HDL, la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT), enzyme associée aux HDL et impliquée dans le transport inverse du cholestérol, serait en partie inactivée [13]. Par conséquent, aussi bien les LDL oxydées que les HDL oxydées semblent fortement impliquées dans le développement du processus athéromateux.

L'étape d'initiation de cette oxydation est encore mal connue, mais fait vraisemblablement intervenir des radicaux libres oxygénés produits par des cellules au contact de ces lipoprotéines. C'est la raison pour laquelle nous nous sommes particulièrement intéressés à un mode d'oxydation original des lipoprotéines in vitro, la radiolyse g de l'eau, puisqu'elle permet de générer des espèces radicalaires qui seraient impliquées in vivo, telles que ^*OH, O₂^*­, HO₂^*. Cette méthode originale d'oxydation nous a permis, sur le plan physico-chimique, de proposer des mécanismes d'oxydation des lipoprotéines par divers radicaux libres oxygénés (^*OH, O₂^*­, HO₂^*, RO₂^*). Par ailleurs, elle nous a amenés à mettre en évidence des propriétés biologiques originales de ces lipoprotéines oxydées, remettant parfois en cause des mécanismes classiquement admis. Enfin, la radiolyse g constitue une méthode de choix pour l'étude des mécanismes d'action des anti-oxydants, que l'on s'intéresse à leur capacité directe de piégeage d'espèces radicalaires ou que l'on apprécie indirectement cette action anti-oxydante en les mettant en présence de lipoprotéines soumises à une irradiation g*.

Principe de la radiolyse g et intérêt dans l'étude de l'oxydation des lipoprotéines

In vitro, plusieurs procédés sont disponibles pour obtenir des lipoprotéines oxydées (incubation avec des sels de cuivre [14], avec des cellules en culture [15], soumission à un rayonnement UV [16], interaction avec des radicaux libres d'origine chimique [17]...). Les conséquences de cette oxydation sur les propriétés physico-chimiques et biologiques des LDL sont très variables selon les procédés utilisés. Par ailleurs, les espèces initiatrices de l'oxydation des lipoprotéines sont différentes dans chaque cas et parfois même sont encore mal individualisées. C'est donc afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l'oxydation des lipoprotéines que nous avons fait appel à une méthode originale de production de radicaux libres : la radiolyse g de l'eau. Cette méthode permet en effet de générer quantitativement et spécifiquement, par le choix des conditions expérimentales, les principaux radicaux libres oxygénés impliqués lors d'un stress oxydant (^*OH, O₂^*­, HO₂^*, RO₂^*) et donc d'étudier leurs effets respectifs.

La radiolyse de l'eau par les rayons g de ⁶⁰Co conduit, en quelques dizaines de nanosecondes, à la production d'une solution homogène d'espèces radicalaires et moléculaires (figure 1). Les mécanismes de formation de ces espèces sont bien connus [1]. Ces espèces sont produites avec des rendements radiolytiques de formation G, exprimés en nombres de molécules ou de radicaux formés pour une énergie absorbée égale à 1 Joule. Les valeurs de G, à pH 7, sont les suivantes [1, 18] :

G_*OH = 2,8 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

G_H* = 0,6 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

G_e-aq = 0,6 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

G_H2 = 0,4 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

G_H2O2 = 0,7 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

Ces rendements de décomposition de l'eau sont indépendants de la nature du soluté éventuellement présent en solution et, dans certaines limites (jusqu'à environ 10^{­ 2} mol.l^{­ 1}), de sa concentration. En présence d'air, les radicaux H^* et les électrons hydratés se transforment rapidement et quantitativement en ions radicaux superoxyde O₂^*­ ou en radicaux hydroperoxyle HO₂^*, leur forme acide :

e^­_aq + O₂ * O₂^*­

H^* + O₂ * HO₂^*, avec HO₂^* * O₂^*­ + H⁺ pK_a = 4,8

*

Nous avons étudié l'action individuelle des radicaux ^*OH, O₂^*­ et de sa forme protonée HO₂^*, ainsi que l'action combinée des radicaux ^*OH et O₂^*­ sur les lipoprotéines. Le choix des conditions expérimentales permet de sélectionner ces espèces radicalaires (figure 1).

La production simultanée des radicaux ^*OH et O₂^*­ a lieu en milieu aéré, avec les rendements suivants :

G_*OH(O2) = 2,8 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}

G_O2*­(O2) = G_e-aq + G_H* = 3,4 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 7}

La production sélective des radicaux oxydants ^*OH implique l'élimination des radicaux réducteurs e^­_aq. Pour cela, les solutions aqueuses de lipoprotéines à irradier (en tampon phosphate de sodium 10^{­ 2} mol.l^{­ 1}) sont saturées avec du protoxyde d'azote N₂O. Dans ce cas, les radicaux e^­_aq sont transformés quantitativement en radicaux ^*OH, et le rendement radiolytique de formation des radicaux ^*OH devient :

G_*OH(N2O) = G_*OH + G_e-aq = 5,6 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}, ce qui correspond à environ 90 % des radicaux formés (il existe 10 % de radicaux H^*).

Enfin, pour sélectionner les radicaux libres O₂^*­, il est nécessaire d'éliminer les radicaux ^*OH et H^*, en ajoutant préalablement aux solutions à irradier du formiate de sodium (à la concentration de 10^{­ 1} mol.l^{­ 1}). Dans ce cas, les radicaux ^*OH et H^* sont transformés quantitativement en radicaux COO^*­ selon les réactions :

^*OH + HCOO^­ * H₂O + COO^*­

H^* + HCOO^­ * H₂ + COO^*­

Les radicaux COO^*­ sont ensuite oxydés par l'oxygène en conduisant à CO₂ et à la production simultanée de O₂^*­. De même, en milieu aéré, l'électron hydraté réagit également avec O₂ pour donner le radical O₂^*­. Par conséquent, dans ces conditions (milieu aéré et en présence d'ions formiate), les radicaux O₂^*­ sont produits avec un rendement G_O2*­ = G_e-aq + G_*OH + G_H* = 6,2 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}. Tous les radicaux de la radiolyse de l'eau sont alors transformés en radicaux O₂^*­.

Insistons sur le fait que les solutions aqueuses de lipoprotéines soumises à l'irradiation g sont oxydées par action des espèces radicalaires issues de la radiolyse des molécules d'eau environnant les lipoprotéines et non par une action directe du rayonnement g (car la concentration molaire des lipoprotéines en solution est relativement faible ; par exemple, une concentration de LDL totales de 3 g.l^{­ 1} équivaut à une concentration molaire de 1,2 x 10^{­ 6} mol.l^{­ 1}, si l'on considère pour les LDL une masse moléculaire moyenne de 2,5 x 10⁶ Da).

La radiolyse g est donc une méthode présentant deux intérêts majeurs : l'aspect quantitatif et la sélectivité de production des radicaux libres. L'aspect quantitatif vient du fait que les rendements de formation des radicaux libres sont très bien définis. Ces rendements permettent de calculer la quantité de radicaux libres apparus pour une dose d'irradiation donnée. Par exemple, une dose de 20 Gy (1 Gy = 1 J.kg^{­ 1}) correspond à une concentration totale de radicaux ^*OH égale à 5,6 x 10^{­ 7} mol.l^{­ 1} en milieu aéré (G(mol.J^{­ 1}) = concentration (mol.l^{­ 1})/dose d'irradiation (Gy)). Toutefois, une telle concentration reste fictive dans la mesure où les radicaux libres ne s'accumulent pas en solution. En effet, les radicaux libres sont produits en concentration quasi stationnaire, c'est-à-dire que leur vitesse de formation par l'action du rayonnement est égale à leur vitesse de disparition dans le milieu réactionnel. Cette vitesse de disparition étant généralement très rapide, les concentrations quasi stationnaires des radicaux libres ainsi produits sont très faibles, par exemple 10^{­ 10} à 10^{­ 12} mol.l^{­ 1} pour les radicaux ^*OH. La connaissance de la dose d'irradiation (exprimée en Gy (J.kg^{­ 1})) est donc indispensable à la détermination de la quantité totale de radicaux libres formés. Or, la dose d'irradiation est proportionnelle au temps d'irradiation t et à l'intensité I (ou débit de dose, exprimé en Gy.s^{­ 1}) selon la relation :

dose d'irradiation (Gy) = I (Gy.s^{­ 1}) x t (s).

La détermination précise de l'intensité I (propre à chaque source de rayonnement) est effectuée grâce à la dosimétrie de Fricke [19]. Cette dernière est basée sur l'oxydation d'ions ferreux (sel de Mohr), de concentration égale à 10^{­ 3} mol.l^{­ 1} en solution aqueuse sulfurique (H₂SO₄ 0,4 mol.l^{­ 1}), en ions ferriques, avec un rendement bien connu égal à 16,2 x 10^{­ 7} mol.J^{­ 1}, en milieu aéré. La concentration en ions ferriques formés est mesurée par absorption spectrophotométrique à 304 nm (e₃₀₄ = 2 204 mol^{­ 1}.l.cm^{­ 1} à 25 °C). Le caractère quantitatif de la radiolyse g constitue un atout majeur pour l'étude des mécanismes réactionnels radicalaires. En effet, la comparaison des rendements relatifs aux marqueurs d'oxydation des lipoprotéines (par exemple G(-vitamine E), G(-b-carotène), G(susbtances réagissant avec l'acide thiobarbiturique), G(diènes conjugués) avec les rendements de production des espèces radicalaires par radiolyse g permet de connaître le pourcentage de radicaux initiateurs ayant participé à l'oxydation. De plus, l'étude de l'influence de la concentration en soluté (ici, les lipoprotéines) sur les rendements, donne des indications sur les compétitions cinétiques possibles entre plusieurs réactions. En conséquence, il est possible de proposer des mécanismes réactionnels radicalaires. Ces derniers sont d'autant plus précis que la nature des produits d'oxydation est mieux déterminée.

Le caractère sélectif de la méthode est lui aussi extrêmement important, puisqu'il permet d'étudier l'action spécifique de chaque espèce radicalaire, en particulier sans contamination par d'autres espèces. Notons que l'influence de l'oxygène, dont l'importance dans le phénomène de peroxydation lipidique en chaîne est considérable, peut également être étudiée d'une manière précise. En effet, en saturant les solutions d'un mélange gazeux N₂O/O₂ approprié, il est possible d'initier le phénomène d'oxydation par les radicaux libres ^*OH réagissant sur un soluté donné et de suivre la réaction ultérieure de l'oxygène agissant sur la (ou les) espèce(s) radicalaire(s) du soluté.

Aspects physico-chimiques et biologiques de l'oxydation des lipoprotéines par radiolyse g

Oxydation des LDL

Dans le cadre de l'oxydation des lipoprotéines, la radiolyse g a été initialement utilisée par Bedwell et al. [20, 21] pour apprécier l'action de certains radicaux libres oxygénés (^*OH, O₂^*­) sur les LDL. Toutefois, ces auteurs n'ont apporté aucune appréciation quantitative concernant les rendements de formation des produits de peroxydation lipidique (hydroperoxydes) et de consommation de l'anti-oxydant endogène majoritaire des LDL, l'a-tocophérol, dans leurs conditions expérimentales. Par conséquent, aucune donnée sur les mécanismes d'action des espèces radicalaires n'était fournie. Nous avons donc, dans un premier temps, déterminé des rendements radiolytiques obtenus lors d'irradiation de solutions aqueuses de lipoprotéines, après avoir sélectionné les espèces radicalaires initiant le processus d'oxydation.

Nous avons ainsi proposé, pour la première fois, des mécanismes de la peroxydation lipidique des LDL par les radicaux libres oxygénés tels que ^*OH, ^*OH/O₂^*­ et O₂^*­/HO₂^* [22-24] et étudié certaines conséquences physico-chimiques de cette peroxydation [25]. Nous avons en particulier montré que les radicaux ^*OH (produits seuls, en solution saturée de protoxyde d'azote et donc en l'absence d'oxygène) ne peuvent pas bien sûr initier de peroxydation lipidique à proprement parler (puisque ce terme doit être réservé aux réactions d'oxydation des lipides en présence d'oxygène). En revanche, ils sont capables d'oxyder très rapidement tous les constituants des LDL (anti-oxydants endogènes, lipides, apolipoprotéine B), induisant ainsi notamment une disparition de l'a-tocophérol, une faible formation concomitante de produits réagissant avec l'acide thiobarbiturique (TBARS), une augmentation de mobilité électrophorétique et une augmentation de la fluorescence à 430 nm (longueur d'onde d'excitation : 360 nm). Ces deux derniers marqueurs traduisent une attaque de la protéine apo B s'ajoutant à l'oxydation des lipides. En revanche, lorsque les radicaux ^*OH et O₂^*­ sont produits simultanément (en présence d'oxygène), l'effet potentialisateur de l'oxygène sur les chaînes de peroxydation lipidique initiées par les radicaux ^*OH se matérialise par des rendements de disparition de l'a-tocophérol et de formation de TBARS environ 10 fois plus importants que ceux obtenus par les radicaux ^*OH seuls. L'effet global des radicaux ^*OH et O₂^*­ est donc en fait pratiquement équivalent à celui des radicaux ^*OH en présence d'oxygène (les radicaux O₂^*­ étant de très faibles initiateurs de la peroxydation lipidique). Enfin, l'action des radicaux O₂^*­/HO₂^* a été étudiée à pH 7 et à pH 5,7. À ces deux pH, la proportion des radicaux HO₂^* par rapport aux radicaux O₂^*­ est respectivement d'environ 1 et 10 %. Les mécanismes invoqués font intervenir une dégradation de l'a-tocophérol préalable à l'initiation de la peroxydation des lipides des LDL. Les radicaux superoxyde étant connus pour ne pas réagir avec l'a-tocophérol, l'attaque de cet anti-oxydant se fait vraisemblablement par une attaque directe des radicaux HO₂^* (réaction bien sûr plus importante à pH acide) et par une attaque des radicaux peroxyle secondaires RO₂^* (provenant de l'action de radicaux initiateurs sur les constituants des LDL). Nous avons montré que les radicaux HO₂^* initient une peroxydation lipidique très intense in vitro. Une telle action pourrait se révéler importante in vivo dans des sites où le pH est abaissé, tels que les vésicules d'endocytose des LDL ou les membranes cellulaires.

Parallèlement, nous avons entrepris une étude de certaines conséquences biologiques de l'oxydation de ces LDL par radiolyse g. Les procédés classiques d'oxydation des LDL (en particulier, sels de cuivre) avaient mis en évidence que les LDL oxydées perdaient leur capacité à être reconnues par les récepteurs B/E [9]. La peroxydation lipidique des LDL a été proposée comme un facteur déterminant de leur perte de reconnaissance par les récepteurs B/E. En faisant appel à la radiolyse g, nous avons montré que les LDL oxydées par les radicaux ^*OH, qui sont caractérisées par un très faible niveau d'oxydation, sont cependant reconnues par les récepteurs B/E de façon équivalente aux LDL oxydées par les radicaux ^*OH/O₂^*­, présentant quant à elles un niveau de peroxydation lipidique environ 10 fois supérieur [26]. Ainsi, nous montrons que le niveau de peroxydation lipidique de ces LDL n'est pas, contrairement à ce qui était initialement admis, le seul élément entrant en jeu dans leur reconnaissance au niveau cellulaire [27]. En revanche, l'équipe du professeur Mazière a montré que l'activation d'un facteur de transcription, l'activator protein 1 (AP1) dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses est totalement dépendante du niveau de peroxydation lipidique des LDL soumises à la radiolyse g [28]. Ainsi, les LDL oxydées par ^*OH seul sont capables d'activer l'AP1 de façon similaire à des LDL témoins non oxydées, tandis que les LDL oxydées par ^*OH/O₂^*­ sont beaucoup plus efficaces en termes d'activation. L'ensemble de ces observations montre la complexité des inter-relations entre peroxydation lipidique et certaines fonctions biologiques des LDL oxydées.

Oxydation des HDL

Nous nous sommes également intéressés à l'étude de l'oxydation des HDL qui, coexistant avec les LDL au niveau de l'espace sous-endothélial, constituent aussi une cible pour les radicaux libres. L'utilisation de la radiolyse g comme système initiateur de l'oxydation des HDL nous a permis d'étudier les modifications physico-chimiques des HDL induites par les radicaux libres oxygénés (*OH, ^*OH/O₂^*­) et de proposer des mécanismes radicalaires rendant compte de ces modifications [29]. Comme pour les LDL, les radicaux ^*OH produits en l'absence d'oxygène attaquent les différentes cibles des HDL (lipides, apolipoprotéines) et n'induisent qu'une très faible formation de TBARS. En outre, nous avons mis en évidence, sous l'action de ces radicaux ^*OH, la persistance d'une concentration résiduelle d'a-tocophérol (anti-oxydant majeur) dans les HDL, même aux fortes doses d'irradiation. Ce phénomène original, non observé dans les LDL soumises aux mêmes conditions d'irradiation, pourrait être dû à une régénération de l'a-tocophérol par un produit d'oxydation capable de réduire le radical a-tocophéroxyle. En revanche, comme précédemment observé avec les LDL, les radicaux ^*OH produits en présence d'oxygène (formation simultanée de radicaux ^*OH et O₂^*­) conduisent à une formation de TBARS nettement supérieure à celle obtenue avec les radicaux ^*OH seuls.

De plus, nous avons recherché l'éventuelle altération d'une propriété biologique majeure des HDL, la capacité d'efflux du cholestérol cellulaire, qui joue un rôle primordial dans leurs propriétés anti-athérogènes. En effet, il a été mis en évidence, en faisant appel à différents systèmes d'oxydation, que les HDL oxydées in vitro perdaient en partie cette capacité d'efflux du cholestérol [11, 12]. Nous avons confirmé cette observation avec des HDL oxydées par radiolyse g. Selon certains auteurs, cette diminution de capacité d'efflux du cholestérol cellulaire serait due à l'oxydation des lipides des HDL. Ainsi, Rifici et al. [29] ont observé une relation inverse entre la perte de la capacité d'efflux et l'intensité de la peroxydation lipidique (mesurée par les TBARS) des HDL. Nous n'avons pas retrouvé cette relation inverse avec des HDL oxydées par radiolyse g [30]. Cette méthode permet d'obtenir des entités de HDL oxydées très différentes par leur degré de peroxydation lipidique. Ainsi, les HDL oxydées par les radicaux ^*OH présentent un faible degré de peroxydation lipidique tandis que les HDL oxydées conjointement par les radicaux ^*OH et O₂^*­ sont le siège d'une importante peroxydation lipidique qui semble d'ailleurs similaire à celle des HDL oxydées par les sels de cuivre. Or, que les HDL soient oxydées par ^*OH, par ^*OH/O₂^*­, ou par les sels de cuivre, leur perte de capacité d'efflux du cholestérol cellulaire est sur le plan quantitatif sensiblement identique. Ainsi, le niveau de peroxydation lipidique des HDL oxydées ne constituerait donc pas le seul élément à prendre en compte pour expliquer ce phénomène [31]. Nous avons proposé l'intervention d'un autre facteur qui est l'état de fluidité des HDL oxydées. Il a été montré que la fluidité des HDL natives joue un rôle important dans leur capacité d'efflux du cholestérol cellulaire [32]. Cette fluidité, évaluée par polarisation de fluorescence ou par résonance paramagnétique électronique, dépend à la fois du rapport cholestérol non estérifié/phospholipides des HDL natives et de leur composition en acides gras. Nous avons mis en évidence, par polarisation de fluorescence et par résonance paramagnétique électronique, que les HDL oxydées, quel que soit leur degré de peroxydation lipidique, présentaient une fluidité nettement abaissée [31, 33]. L'hypothèse de la diminution de la fluidité des HDL oxydées et leur moindre capacité à capter le cholestérol cellulaire a été également proposée par Gesquière et al. [34].

Enfin, puisque les HDL pourraient jouer un rôle protecteur dans l'athérogénèse, non seulement par leur rôle dans le transport inverse du cholestérol [34], mais aussi par le biais d'une inhibition de la peroxydation des LDL [10], nous nous sommes intéressés aux interactions réciproques entre HDL et LDL soumises simultanément à l'action de radicaux libres oxygénés produits par radiolyse g (^*OH, ^*OH/O₂^*­). En effet, ces deux classes de lipoprotéines sont présentes in vivo au niveau de l'espace sous-endothélial et sont donc susceptibles d'y subir une attaque radicalaire. Nous avons ainsi pu mettre en évidence, en irradiant des mélanges HDL/LDL, non seulement une protection des LDL par les HDL simultanément soumises à l'action des radicaux hydroxyle (^*OH) ­ ce qui avait déjà été montré lors d'une oxydation induite par des ions cuivriques [36] ­, mais aussi, de façon surprenante, une protection des HDL par les LDL. Une telle protection réciproque de ces deux classes de lipoprotéines ne se manifeste qu'en présence d'oxygène (action des radicaux ^*OH/O₂^*­) [37]. Il reste à déterminer les mécanismes expliquant cette protection réciproque.

Intérêt de la radiolyse g pour l'étude des anti-oxydants

Étant donné l'implication des radicaux libres dans de nombreuses pathologies dont l'athérosclérose, on comprend tout l'intérêt porté aux anti-oxydants dans un but préventif et thérapeutique. Toutefois, leur utilisation passe par une bonne connaissance de leurs mécanismes d'action. Ces derniers sont généralement mal connus. Dans ce but, la radiolyse g, pour des raisons déjà évoquées, s'avère également une méthode de choix. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux molécules anti-oxydantes, le probucol qui est lipophile et l'aminoguanidine qui est hydrophile.

Le probucol [4,4'-(isopropylidène dithio)bis(2,6-di-tert-butylphénol)] possède à la fois des propriétés hypocholestérolémiantes et anti-oxydantes et s'avère donc une molécule d'un grand intérêt. De plus, administré par voie orale, il est véhiculé dans le plasma essentiellement par les lipoprotéines au sein desquelles il s'incorpore facilement grâce à ses propriétés lipophiles. De nombreuses études réalisées in vitro et ex vivo ont montré que le probucol protégeait les LDL de la peroxydation lipidique initiée par différents systèmes oxydants (sels de cuivre, cellules endothéliales en culture). Cependant, les mécanismes par lesquels le probucol exerce cet effet ne sont pas clairement établis. Des informations contradictoires ont été données concernant la capacité du probucol à piéger l'anion superoxyde O₂^*­ ou le radical peroxyle RO₂^*. Ainsi, grâce à la radiolyse g, nous avons pu étudier les propriétés anti-oxydantes du probucol vis-à-vis de l'oxydation des LDL initiée par ces deux types de radicaux libres oxygénés. Les résultats obtenus montrent que le probucol est incapable de réagir avec les radicaux RO₂^*. De ce fait, il ne protège pas la vitamine E endogène des LDL contre l'attaque de ces radicaux [38]. De plus, la capacité du probucol à piéger les radicaux O₂^*­ est très faible. Ainsi, en fonction de nos résultats, les propriétés anti-oxydantes du probucol semblent dues à sa capacité à piéger certains radicaux intermédiaires générés au cours de la peroxydation lipidique des LDL. C'est la raison pour laquelle nous suggérons que son effet anti-oxydant in vivo ne peut pas s'expliquer par sa capacité à piéger les radicaux O₂^*­ et RO₂^* [38]. Enfin, au cours de cette étude, nous avons pu préciser la concentration de probucol au sein des LDL pour laquelle cet anti-oxydant exerce un effet optimal vis-à-vis de la peroxydation lipidique. Cette concentration est de 15 molécules de probucol pour une particule de LDL, ce qui correspond sensiblement à la concentration retrouvée avec les doses thérapeutiques administrées [38].

L'aminoguanidine, quant à elle, est un composé hydrosoluble très nucléophile possédant une structure analogue à celle du groupement aminé terminal de l'arginine [39]. Elle a la capacité de bloquer la formation de produits terminaux de la glycation rencontrés chez les diabétiques [40]. Récemment, il a été montré que cette substance avait également des propriétés anti-oxydantes en inhibant la peroxydation des LDL et en réagissant avec les composés aldéhydiques provenant de la décomposition des hydroperoxydes [41]. Un autre mécanisme a été proposé pour rendre compte de l'effet anti-oxydant de l'aminoguanidine. Elle piègerait certaines espèces radicalaires, notamment le radical HO₂^* [42]. Par ailleurs, d'autres études suggèrent la capture de radicaux ^*OH [43-45]. Toutefois, aucun des travaux publiés ne fournit de preuve directe de la capture de ces espèces radicalaires par l'aminoguanidine. C'est la raison pour laquelle nous avons étudié, par radiolyse g, la capacité de l'aminoguanidine à capter des espèces radicalaires bien définies. D'après les résultats obtenus, il apparaît que cette molécule possède des propriétés de capteur des radicaux ^*OH et ^*OH/O₂^*­ produits par radiolyse g de l'eau [46], ainsi que des radicaux peroxyle RO₂^* générés dans l'alcool [47].

* Travaux réalisés en collaboration avec le Laboratoire de chimie-physique (URA 400 CNRS), UFR Biomédicale des Saints-Pères, 45, rue des Saints-Pères, 75270 Paris cedex 06.

CONCLUSION

La radiolyse g de l'eau est une méthode sélective et quantitative de production d'espèces radicalaires oxygénées permettant l'étude de l'oxydation monoélectronique de nombreux systèmes d'intérêt biologique. Nous avons illustré ici l'apport de cette méthode à l'étude des mécanismes d'oxydation des lipoprotéines par des radicaux libres oxygénés (^*OH, O₂^*­, HO₂^*, RO₂^*), qu'il s'agisse des LDL mais aussi des HDL, puisqu'une telle oxydation semble fortement impliquée dans le développement du processus athéroscléreux. De plus, cette méthode nous a permis de mettre en évidence des propriétés biologiques particulières des lipoprotéines ainsi oxydées, qu'il s'agisse de la reconnaissance au niveau des récepteurs B/E pour les LDL ou de la capacité d'efflux du cholestérol cellulaire pour les HDL. Enfin, la radiolyse g est une méthode particulièrement appropriée à l'étude des mécanismes d'action de molécules anti-oxydantes, que ce soit en solution pure ou que l'on s'intéresse à leur capacité d'inhibition de la peroxydation des lipoprotéines in vitro. En outre, il faut souligner que cette méthode très générale est applicable non seulement aux systèmes hydrosolubles mais également aux systèmes liposolubles. En effet, dans ce dernier cas, il est possible d'irradier des solutions aqueuses micellaires [48] ou des solutions éthanoliques, puisque la radiolyse de l'éthanol est également bien connue [1].

Article reçu le 16 janvier 1999, accepté le 26 février 1999.

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