ARTICLE
Les substances endogènes (hémoglobine, bilirubines, lipides)
interfèrent dans les lectures spectrophotométriques de la
région ultraviolette ou visible du spectre de certaines analyses
de biochimie. Les études de Glick et Ryder [1] ont montré
qu'en dépit des corrections utilisées par les nouveaux automates
(lecture en bichromatisme, blanc sérum, mesure en cinétique),
il subsistait de nombreuses causes d'inexactitudes dans les résultats.
En effet, l'hémoglobine, les bilirubines, les lipides absorbent
dans la région visible et ultraviolette du spectre. L'absorbance
de ces substances diminue progressivement de l'ultraviolet (en dessous
de 400 nm) au visible (400-600 nm) pour être minimale au-dessus
de 620 nm. Dans l'infrarouge, l'interférence de la bilirubine et
de l'hémoglobine est éliminée, celle des lipoprotéines
est considérablement diminuée. Récemment, ont été
développées des méthodes de dosage qui utilisent
des chromophores absorbant fortement dans le proche infrarouge entre 600
et 850 nm et qui limitent ainsi les interférences chromatiques.
Le but de l'étude a été d'utiliser la spectrophotométrie
dans le proche infrarouge sur un analyseur multiparamétrique, pour
les dosages de l'acide urique, du calcium, des chlorures, du cholestérol,
du glucose, du phosphore, de valider ces dosages et d'étudier l'influence
des interférences chromatiques.
Matériels et méthodes
Tous les dosages ont été réalisés sur un
analyseur multiparamétrique Dax 96® (Bayer Diagnostic).
Les méthodes utilisant des chromophores absorbant fortement dans
le proche infrarouge (Synermed France) ont été comparées
aux méthodes et réactifs Bayer habituellement utilisés
sur le Dax 96®.
Les principes des méthodes utilisées sont décrits
dans le tableau 1.
Pour chaque analyte, le domaine d'analyse, la limite de détection,
la répétabilité, la reproductibilité, l'inexactitude
sur des échatillons de patients par comparaison de techniques et,
enfin, l'influence des substances interférentes ont été
étudiés selon le protocole de validation de techniques publié
par la commission Validation de techniques de la SFBC [2].
La linéarité a été
étudiée à partir d'un spécimen de contrôle
(Bayer) titrant 32 mmol/l de glucose, 1 185 mmol/l d'acide urique, 10,50
mmol/l de cholestérol, 152 mmol/l de chlorures, 4,42 mmol/l de
phosphore et 3,2 mmol/l de calcium. Pour chaque analyte, la limite de
détection a été déterminée par des
mesures répétées (n = 50) du blanc de la réaction
dans une même série de dosage. La répétabilité
et la reproductibilité ont été étudiées
à partir de deux spécimens de contrôle de niveau moyen
et élevé (Bayer). L'évaluation de l'inexactitude
par comparaison de techniques a été réalisée
sur 150 plasmas provenant de patients hospitalisés. Ils ont été
choisis pour couvrir une gamme de mesures étendue et ils reflètent
les principales variations physiopathologiques, conformément aux
objectifs du protocole de comparaison de techniques. Les droites d'allométrie,
les coefficients de corrélation ont été calculés.
L'inexactitude observée pour les trois niveaux de concentration
différents a été comparée aux normes proposées
par le protocole de validation de technique [2].
L'influence des interférences analytiques dues à l'hémolyse,
à la bilirubine, aux lipides a été étudiée
selon la méthodologie du protocole de validation de techniques
[2]. Un mélange de plasma est surchargé à différents
niveaux de concentrations par des solutions concentrées d'hémoglobine,
de bilirubine (Bilirubine Sigma B 4126), de lipides (Ivélep 20
% Clintec).
Les différents analytes ont été dosés en
double sur chacun des échantillons non surchargés et surchargés.
Pour chaque analyte, la valeur moyenne des dosages du spécimen
non surchargé est soustraite de celle des spécimens surchargés.
Les résultats sont reportés sur un graphe et comparés
aux normes d'interprétation du protocole de validation de techniques
[2].
Résultats
Le domaine d'analyse a été vérifié pour
les valeurs de concentration des différents analytes du contrôle
Bayer et couvre la gamme de mesure utile en pratique quotidienne.
Les limites de détection des méthodes Synermed (tableau
2) sont inférieures à celles des techniques de Bayer
pour le glucose et l'acide urique, et comparables pour les autres.
Les coefficients de variation déterminés lors des tests
de répétabilité et de reproductibilité (tableau
3) sont inférieurs aux limites d'acceptabilité établies
par la SFBC. Notamment, le dosage du calcium est particulièrement
répétable et reproductible avec des coefficients de variation
de l'ordre de 1 %, inférieurs aux limites d'acceptabilité
(1,5 et 1,6 %).
Les résultats de la comparaison des mesures obtenues avec les
méthodes Synermed et Bayer (pente, ordonnée à l'origine
de la droite d'allométrie, coefficients de corrélation)
sont rassemblés dans le tableau
4. Les coefficients de corrélation sont très satisfaisants
pour les différents analytes testés. Tous les analytes ont
satisfait aux critères d'exactitude proposés par le protocole
de validation [2] pour les trois niveaux de concentrations.
Les interférences chromatiques sont représentées
dans les figures 1 et 2.
L'erreur apportée par la surcharge est significative lorsque la
courbe obtenue sort des limites d'inexactitude tolérable définies
par le protocole de validation [2]. Il n'a été constaté
aucune interférence des substances chromatiques avec les méthodes
Synermed à l'exception du dosage du cholestérol pour lequel
une faible interférence de la bilirubine a été observée
à partir de 400 mmol/l.
Discussion
L'évaluation de l'inexactitude par comparaison de technique,
du domaine d'analyse et de la précision a montré les bonnes
performances analytiques de ces méthodes. En particulier, la grande
précision du dosage du calcium est appréciable compte tenu
de l'étroite fourchette de normalité de la calcémie.
Les interférences analytiques sont nettement diminuées
par l'emploi des réactifs et méthodologies Synermed France
par rapport à celles observées avec les différents
procédés utilisés jusqu'à présent.
Parmi ces derniers, certains auteurs [3, 4] préconisent des modifications
de méthodologie : l'oxydation de la bilirubine par un agent oxydant
comme la bilirubine oxydase, le ferricyanure, ou la précipitation
de la bilirubine liée à l'albumine par l'acide trichloracétique
dans le cas de sérums ictériques et pour les sérums
lipémiques l'emploi de réactif clarifiant.
Cependant, ces traitements peuvent rendre irréalisables le dosage
ultérieur de certains analytes. Il est aussi possible de modifier
les techniques de dosage sur les automates. Ces adaptations portent essentiellement
sur le mode de lecture (mesures en cinétique, en bichromatisme),
ou encore par la mise en place d'un blanc sérum. Cependant, cette
dernière adaptation utilise un canal supplémentaire et,
de plus, certains analyseurs sont incapables de gérer le résultat
de la mesure d'un blanc sérum. Afin de contourner cette difficulté,
il est toujours possible de recourir aux méthodes dites en biréactif
avec mesure d'un blanc spécimen dans la cuve réactionnelle
elle-même. Toutefois, dans ce cas, l'ajout du second réactif
peut clarifier le milieu ou encore réagir avec l'hémoglobine
ou la bilirubine, annulant ainsi l'effet correcteur du blanc [4]. Comme
l'ont montré les études de Glick et Ryder [1], de Grafmeyer
et al. [5], ces procédés ne donnent pas entière
satisfaction.
Dans notre étude, l'utilisation des méthodologies Synermed
France [6] nous a permis de constater pour les différents paramètres
testés : l'élimination des interférences dues à
l'hémoglobine et aux lipides, l'absence complète d'interférence
due à la bilirubine, excepté pour le cholestérol
où cette interférence n'est observée que pour des
concentrations très élevées supérieures à
400 mmol/l. L'élimination de cette interférence représente
un avantage considérable par rapport aux méthodes de dosage
utilisant la réaction de Trinder. Dans cette réaction, le
mode d'interférence de la bilirubine est complexe et paraît
être attribué à la fois à un chevauchement
spectral entre la bilirubine et le chromophore et à des interférences
chimiques. La bilirubine réagirait avec le composé intermédiaire
formé dans la réaction à la peroxydase, avec pour
conséquence une diminution de la quantité de chromogène
formé. D'après Witte et al., ce dernier mécanisme
serait le plus plausible [7].
CONCLUSION
Il ressort de cette étude que la lecture dans le proche infrarouge
limite les interférences dues à l'hémolyse, à
la bilirubine, aux lipides et améliore l'exactitude des résultats.
La plupart des réactifs sont liquides, prêts à l'emploi,
faciles d'utilisation et stables plusieurs mois.
Ces méthodes sont facilement réalisables sur des analyseurs
multiparamétriques de biochimie possédant une gamme de mesure
allant jusqu'à 700 nm. L'adaptation de ces méthodologies
sur divers analyseurs devrait ainsi permettre de s'affranchir des problèmes
liés aux interférences chromatiques et d'améliorer
la qualité des résultats.
Article reçu le 20 juin 1998, accepté le 26 octobre 1998.
REFERENCES
1. Glick MR, Ryder KW. Analytical systems ranked by freedom from
interferences. Clin Chem 1987 ; 33 : 1453-8.
2. Vassault A, Grafmeyer D, Naudin C, et al. Protocole
de validation de techniques. Ann Biol Clin 1986 ; 44 : 686-745.
3. Sapin MA, Wu AHB. Bilirubin interference with determination
of uric acid, cholesterol and triglycerides in commercial peroxydase coupled
assays and the effect of ferrocyanide. Clin Chem 1986 ; 32 : 518-21.
4. Brady J, O'Leary N. Interference due to lipaemia in routine
photometric analysis-survey of an underrated problem. Ann Clin Biochem
1994 ; 31 : 281-8.
5. Grafmeyer D, Bondon M, Manchon M, Levillain P. Étude
de l'influence des interférences « visibles » - bilirubine,
hémolyse, turbidité - sur les principaux dosages réalisés
sur les analyseurs multiparamétriques. Spectra Biologie
1993 ; 93 : 33-42.
6. Denny JW. Infrared detection in routine clinical chemistry
automation. Synermed Inc., Montréal, Canada, 1993.
7. Witte DL, Brown LF, Feld RD. Effects of bilirubin on detection
of hydrogen peroxide by use of peroxidase. Clin Chem 1978 ; 24
: 1778-82.
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