ARTICLE
Nous présentons ici les résultats d'une évaluation
des performances analytiques de l'Immage®, automate d'immunoanalyse
commercialisé par la société Beckman, concernant
le dosage de dix protéines sériques : immunoglobulines G
(IgG), A (IgA), M (IgM), apolipoprotéines A1 (Apo A1) et B (Apo
B), protéine réactive C (CRP), haptoglobine, alpha1-glycoprotéine
acide ou orosomucoïde, albumine, transferrine. Il s'agit d'un système
d'immunonéphélémétrie travaillant patient
par patient. Le protocole retenu s'inspire du protocole Valtec version
1997 de la SFBC et les techniques de comparaison sont celles du BNA®
ou de l'Array® selon le paramètre considéré.
Nous avons également effectué quelques dosages d'albumine
et d'IgG dans le LCR ainsi que des dosages d'albumine et d'alpha1-microglobuline
dans l'urine.
Descriptif de l'analyseur
La présentation de l'analyseur est faite selon le descriptif
standardisé des analyseurs de biologie [1]. L'Immage®,
commercialisé par la société Beckman, est un automate
d'immunoanalyse utilisant la néphélémétrie
cinétique pour le dosage des protéines et la turbidimétrie
cinétique pour celui des marqueurs tumoraux et des médicaments.
Cet automate multiparamétrique permet le traitement des spécimens
« patient par patient », par séries, ou en urgence en
fonction de la demande, et effectue jusqu'à 140 tests par heure
pour certains paramètres. Le premier résultat est obtenu
en sept à dix minutes pour la plupart des dosages.
* La gestion du milieu réactionnel
L'automate possède un portoir permettant l'installation de 24
cartouches de réactifs d'une capacité de 40, 150 ou 300
tests chacune, munies d'un code à barres permettant leur identification
et la gestion permanente par le logiciel du nombre de tests disponibles.
L'utilisation simultanée de deux cartouches de même lot est
possible, le système utilisant préférentiellement
celle contenant le plus petit nombre de test disponibles. De même,
l'appareil peut garder en mémoire des calibrations de lots différents
pour un même test. L'ensemble du portoir est maintenu entre 13 et
22 °C par effet Peltier. Quatre flacons de tampon de réaction
sont disposés au centre du portoir de réactifs et leur volume
disponible est également géré par le logiciel.
L'ensemble des réactifs est muni de bouchons anti-évaporation
et anticontamination. Après dilution des échantillons, la
réaction est effectuée sur le plateau réactionnel
contenant 39 cuvettes maintenues à 37 ± 0,5 °C dans lesquelles
sont déposés les réactants combinés. Les cuvettes
sont lavées après chaque réaction. Des rinçages
supplémentaires sont effectués dans certaines conditions
(avant un dosage sur urine ou LCR, ou après un dosage effectué
sur une faible dilution de l'échantillon). Elles doivent être
changées tous les 10 000 tests.
* L'identification des spécimens
Le plateau d'échantillons (72 positions) permet l'utilisation
simultanée de plusieurs types de portoirs pour tubes primaires
de 10, 7 ou 5 ml, avec possibilité d'utiliser des microtubes ou
des godets pour les faibles volumes. La reconnaissance des tubes et des
portoirs se fait grâce à un lecteur code à barres
permettant une identification positive des patients, suivie d'une interrogation
de l'informatique centrale (connexion bidirectionnelle).
Le volume prélevé est de 3,5, 6,5 ou 21 µl, mais
le volume minimal de prise d'essai à prévoir est variable
suivant le type de tubes, en tenant compte du volume mort.
La dilution des échantillons est assurée dans des segments,
à l'aide des diluants placés au centre. Au maximum, deux
prédilutions permettent de réaliser l'ensemble des paramètres.
La consommation des diluants et des segments est gérée par
le logiciel.
* Les mesures
Deux sources lumineuses sont disponibles sur l'appareil :
- une source laser à 670 nm fonctionnant avec un détecteur
placé perpendiculairement par rapport au rayon incident (pour la
mesure des protéines), conçue pour permettre la quantification
de complexes dans une large gamme de tailles tout en évitant les
interférences dues aux grosses molécules (lois de Debye
et Rayleigh) ;
- une diode électroluminescente (DEL) à une longueur d'onde
de 940 nm fonctionnant avec un détecteur placé dans le prolongement
du faisceau incident assure la mesure de la baisse d'intensité
lumineuse produite par la dispersion de la lumière par les particules
(pour le dosage des médicaments et des marqueurs tumoraux).
L'exploitation des informations
Le calibrage s'opère par réajustement d'une courbe étalon
(master curve), à l'aide d'une concentration de calibrateur
spécifique. Quatre mesures successives de la valeur du calibrant
sont effectuées. La calibration n'est acceptée que si le
facteur de réajustement est compris entre 0,66 et 1,50.
Pour le dosage des protéines, il est possible d'effectuer un
test d'excès d'antigène par ajout d'antigène supplémentaire
une fois la réaction terminée et d'éviter ainsi les
phénomènes de zone (recommandé pour les dosages d'immunoglobulines,
de microalbumine urinaire et d'haptoglobine). Ce test est automatiquement
réalisé sur les spécimens si cette fonction a été
choisie lors du paramétrage des tests.
* Caractéristiques informatiques
L'informatique de l'Immage® est assurée par un
Pentium 133 HP Vectra VL 4 avec 64 Mo de mémoire vive et 2 Mo pour
la mémoire vidéo. Le disque dur a une capacité de
1,6 Go. Ce PC comporte un CD-ROM 8X pour le chargement du logiciel. Tout
cet équipement est protégé par un onduleur UPS-SU450.
Le logiciel multitâche en français est d'utilisation conviviale.
* La connexion
La connexion bidirectionnelle en dialogue instantané est possible
avec la majorité des systèmes informatiques, permettant
un chargement aléatoire des tubes. Nous l'avons utilisée
dans notre site avec succès.
Protocole d'étude
L'évaluation, inspirée du protocole Valtec version 1997
[2], s'est déroulée en deux périodes : familiarisation
(évaluation de la répétabilité 3 jours consécutifs),
puis validation comprenant : l'évaluation de la répétabilité,
de la reproductibilité, du seuil de quantification, de la limite
de linéarité, de la comparaison avec d'autres techniques,
des interférences de substances physiologiques (bilirubine, hémoglobine,
triglycérides) et enfin des contaminations et recherche d'éventuels
effets zone par excès d'antigène. L'exploitation des résultats
a été réalisée à l'aide du logiciel
Mac Valtec 97, version 1.0.1, qui comporte tous les critères d'acceptabilité
nécessaires (version complète non publiée).
* Techniques évaluées
Il s'agit des techniques de mesure des dix protéines les plus
couramment prescrites en biologie clinique. Leurs caractéristiques
sont réunies dans le tableau
1. Le calibrage a été effectué selon les
directives du fabricant. Les sérums Vigil PRx level 1, 2, 3 et
Vigilplus level 1, 2, 3 (Beckman) ont été choisis comme
témoins, ainsi que les sérums Liquicheck (Bio-rad) niveau
1, 2, 3.
* Techniques de comparaison
Les techniques de comparaison sont celles que nous utilisons en routine
dans notre laboratoire (tableau
1).
Spécimens de patients
Les spécimens de patients (n = 100/paramètre) ont été
choisis afin de couvrir l'essentiel du domaine des variations physiopathologiques.
Les dosages ont été réalisés le même
jour par les deux techniques sur les sérums préalablement
congelés à - 20 °C pendant trois mois au maximum. Les
dosages sur urines ou LCR ont été effectués sur spécimens
frais.
Résultats et commentaires
Période de familiarisation
Un essai de répétabilité réalisé
pendant trois jours consécutifs (20 dosages par jour), sur un sérum
de contrôle titré, a permis d'observer des coefficients de
variation (CV) inférieurs à 4 % pour l'ensemble des paramètres
étudiés avec une variation interséries des CV inférieure
à 1 % sauf pour l'albumine (1,8 %).
Période de validation
* Répétabilité. L'essai de répétabilité
a été effectué sur une série de vingt dosages
de sérums de contrôle à trois niveaux. Tous les paramètres
répondent aux critères d'acceptabilité et ce pour
les niveaux de concentration bas, moyens et élevés. Ainsi,
il est à noter que même les niveaux de concentration faibles
présentent des CV inférieurs à 6,5 % (tableau
2).
* Reproductibilité. L'essai a été réalisé
sur trois niveaux de contrôle en exploitant l'ensemble des valeurs
obtenues dans vingt séries différentes, soit 40 valeurs
pour chaque niveau. Les résultats obtenus sont satisfaisants dans
l'ensemble (tableau 2).
Tous les niveaux de contrôle sont acceptés au risque de 5
% selon les normes Valtec.
* Limite de détection. Nous n'avons pas pu réaliser
ce test selon la formule DL = (KSd)/p, l'appareil ne donnant les résultats
qu'en concentrations et pas en signal. Toutefois, tous les blancs passés
sur l'appareil nous ont toujours donné une valeur inférieure
au seuil de détection pour chaque paramètre.
* Seuil de quantification. Le seuil de quantification correspond
à la plus petite valeur exprimée en concentration, rendue
avec une confiance acceptable en précision et en exactitude. C'est
la valeur pour laquelle le CV et l'écart à la valeur théorique
sont inférieurs à 20 %. Ce test a été réalisé
en diluant un calibrateur pour se trouver dans des valeurs basses. Les
dilutions ont été dosées 10 fois. Les résultats
obtenus pour les dilutions proches du seuil annoncé par le fabricant
répondent à ce critère (tableau
3). Les seuils donnés par le fabricant peuvent donc être
retenus.
* Limite de linéarité. Des dilutions effectuées
sur plusieurs spécimens de sérum et de calibrateur dont
la valeur était proche de la valeur supérieure du domaine
de mesure indiqué par le fabricant et dosées dans quatre
séries différentes ont montré que les résultats
après dilution manuelle correspondaient aux valeurs attendues (tableau
3). Les limites pour passer à la dilution supérieure
semblent donc satisfaisantes, à l'exception de l'Apo A1. Pour ce
paramètre, l'automate effectue une dilution au 1/36 pour un domaine
de mesure compris entre 0,25 et 2,25 g/l. Nos essais ont montré
qu'au-delà de 1,8 g/l, une dilution au 1/72 donne de meilleurs
résultats. Dans l'ensemble, les domaines de mesure annoncés
par le fabricant sont fiables.
* Étude de la corrélation (ou comparaison). Dix
séries de dix spécimens de patients ont été
mesurées par la technique Immage® ainsi que par
la technique de comparaison pour chaque paramètre étudié.
Les coefficients de corrélation obtenus sont supérieurs
ou égaux à 0,98 en utilisant la régression de Passing-Bablok
[3], à l'exception de l'Apo A1 pour laquelle il est de 0,95 (figure
1). L'inexactitude observée est toujours inférieure
à l'inexactitude tolérable et la corrélation est
acceptée aux trois niveaux pour tous les paramètres testés.
* Surcharges et interférences. Nous avons procédé
à l'étude des interférences suivant le protocole
Valtec : étude de l'effet de l'hémolyse, de la bilirubine
et de la turbidité par surcharge d'un pool de sérums avec
des concentrations croissantes et connues d'hémoglobine, de bilirubine
et d'intralipide. Nous n'avons constaté aucune influence de la
turbidité ni de la bilirubine sur les résultats. Par contre,
l'hémoglobine affecte le dosage d'haptoglobine (figure
2).
* Phénomène de zone. Il n'a pas été
constaté de phénomène de zone grâce au système
de détection d'« excès d'antigène » existant
pour certains paramètres dont le domaine physiopathologique est
large : respectivement jusqu'à 75, 54 et 35 g/l pour les IgG, IgA,
IgM, jusqu'à 8g/l pour l'haptoglobine, et jusqu'à 3 g/l
pour l'albumine dans l'urine. Par ailleurs, la redilution dans les domaines
faibles ou élevés est automatique.
* Contamination. Les séquences utilisant l'alternance
de spécimens à concentration élevée et de
blancs échantillons n'ont jamais montré une quelconque contamination
entre les pipetages d'échantillons. De même, nous avons pu
vérifier que la lecture d'une réaction faible dans une cuvette
n'était pas modifiée si elle intervenait après la
lecture d'un spécimen à concentration élevée,
cela permettant de passer les spécimens dans un ordre quelconque.
* Dosage de protéines dans d'autres milieux que le sérum.
Pour les dosages dans l'urine et le LCR, les résultats de reproductibilité
obtenus pour la microalbumine et l'alpha1-microglobuline à partir
des urines de contrôle Beckman level 1 et 2, pour l'albumine, les
IgG, IgA, IgM à partir du liquide de contrôle Liquicheck
Bio-rad level 1, ont été satisfaisants (tableau
4). Les CV obtenus sont voisins de ceux du BNA et même meilleurs
pour les IgA et les IgM du LCR (respectivement 9,1 et 16,7 % pour le BNA).
L'équation de la droite de régression obtenue pour l'albumine
urinaire, par comparaison de 30 échantillons de patients, montre
une bonne corrélation entre les deux techniques (Y = 0,89 X + 0,21
; coefficient de corrélation = 0,99). Pour le LCR, les dosages
sont réalisés selon le même programme que pour les
sérums mais avec des échantillons purs. La comparaison n'a
porté que sur un nombre limité d'échantillons, compte
tenu du nombre de prélèvements disponibles et n'a de ce
fait pas été exploitée. L'utilisation d'une faible
prise d'essai est particulièrement intéressante.
* Effet « matrice ». Nous avons réalisé
des blancs échantillons en remplaçant une cartouche d'antisérum
par du tampon réaction. La détermination de vingt spécimens
différents n'a donné aucun signal supérieur au seuil
de la technique. Par ailleurs l'Immage® effectue un blanc
cinétique pour les dosages effectués sur une dilution au
1/6.
* Stabilité des réactifs. Pour le rythme des calibrations,
nous avons suivi les recommandations du fabricant, soit 30 jours pour
les protéines testées et nous n'avons constaté aucun
phénomène de dérive pendant cette période.
Praticabilité du système
Le système est d'apprentissage rapide et d'utilisation simple.
Le fait qu'il n'y ait aucune maintenance journalière nous paraît
particulièrement intéressant. La cadence de l'automate est
variable selon les protéines dosées : à titre d'exemple,
il faut une heure pour obtenir le résultat de 72 CRP en ligne (environ
deux fois plus sur l'Array®), trente minutes pour obtenir
les résultats d'Apo A1 et B sur 36 spécimens. Nous avons
particulièrement apprécié les volumes très
faibles nécessaires au dosage (50 µl en microtube pour un
profil CRP/orosomucoïde chez le nouveau-né, 120 µl pour
l'albumine et les IgG, IgA, IgM de LCR). Les différents portoirs,
utilisables simultanément, permettent aussi bien des dosages sur
tube primaire que secondaire.
Le maintien du portoir de réactifs à une température
basse, l'utilisation de bouchons antiévaporation pour tous les
réactifs, contribuent à la qualité des résultats.
Le portoir d'antisérums est placé dans son ensemble au réfrigérateur
en fin de journée sans aucune manipulation de réactifs,
évitant ainsi des erreurs d'attribution de bouchons toujours possibles.
La gestion des différents réactifs par le logiciel nous
a donné toute satisfaction.
La faible prise d'essai pour les contrôles, le faible volume de
diluant et de tampon utilisés par la machine, une bonne tenue de
la calibration ainsi qu'un effort sur le prix des antisérums expliquent
un coût du test annoncé beaucoup moins élevé
que ceux des systèmes actuellement utilisés dans notre laboratoire.
Les résultats sont édités par patient (avec possibilité
d'en-tête du service). L'automate garde en mémoire jusqu'à
30 000 patients ou 100 000 résultats.
La version actuelle dispose d'une gestion des contrôles réduite
: possibilité de définir cent contrôles différents,
avec leur valeur cible et leurs limites acceptables, et identification
positive par l'automate grâce à une étiquette code
à barres, mais il est impossible, pour le moment, d'exploiter les
résultats cumulés. Cette lacune devrait être comblée
dans la prochaine version annoncée pour la fin de l'année.
Le passage d'échantillons en urgence est possible, à condition
de faire une programmation manuelle sur l'automate, si l'on ne veut pas
réduire la cadence par une pause. Nous déplorons qu'il ne
soit pas possible de charger en continu les spécimens sur la machine,
en effet il n'y a pas de relecture des codes à barres en cours
de série. Nous pensons aussi que certaines améliorations
pourraient être apportées dans le logiciel concernant la
consultation du statut des spécimens en cours de réalisation
(en cours, terminés, résultats...). Nous attendons avec
un vif intérêt l'ouverture du système annoncée
dans une version future qui permettra ainsi l'adaptation de dosages particuliers.
CONCLUSION
Pour les dix protéines étudiées, les résultats
ont été totalement satisfaisants pour la répétabilité
et la reproductibilité, et bien corrélés aux techniques
utilisées dans le laboratoire. Les seuils de quantification annoncés
par le fabricant sont vérifiés. Les essais montrent également
une bonne linéarité pour huit paramètres. Dans le
cas de l'Apo A1 et de l'albumine, il semble cependant exister une moins
bonne exactitude pour les valeurs les plus élevées. La seule
interférence constatée concerne le dosage d'haptoglobine,
affecté par l'hémolyse. Il n'a pas été observé
de phénomène de zone ni de phénomène de contamination
de l'échantillon. L'application aux milieux autres que le sérum
(LCR, urine), a donné entière satisfaction, d'autant que
des volumes de prise d'essai faibles peuvent être utilisés.
Le maintien des réactifs en milieu réfrigéré
nous paraît très intéressant. Le système, convivial,
se prête bien aux petites et aux moyennes séries. La cadence
annoncée par le fabricant n'est exacte que pour certains paramètres
et fonction de la technique (absence d'excès d'anticorps notamment).
L'ensemble de ses performances analytiques, ainsi que les perspectives
d'ouverture de la prochaine version, le rendent compétitif au sein
des automates d'immuno-analyse pour le dosage des protéines.
REFERENCES
1. Gruson A. Descriptif standardisé des automates d'immunoanalyse
: apports et intérêts. Rev Fr Lab 1995 ; 275 : 193-9.
2. Capolaghi B, Vassault A, Grafmeyer D, Yvert J.P. Le protocole
Valtec : évolution du concept et du contenu. Ann Biol Clin
1997 ; 55 : 167-8.
3. Payne RB. Method comparison : evaluation of least squares,
Deming and Passing/Bablok regression procedures using computer stimulation.
Ann Clin Biochem 1997 ; 34 : 319-20.
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