Etude comparative de l'adhérence de cinq espèces de Candida au polychlorure de vinyle

ARTICLE

Les infections fongiques représentent un problème majeur en milieu hospitalier. Le genre Candida, en particulier Candida albicans est le plus impliqué. L'acquisition d'un pouvoir pathogène par ces levures résulte de la conjonction de plusieurs facteurs dont le primum movens est la capacité d'adhérence de Candida aux cellules épithéliales et aux surfaces inertes endogènes, première étape de la colonisation des tissus hôtes. Le phénomène d'adhérence résulte d'un processus complexe associant à la fois des facteurs physicochimiques non spécifiques et des liaisons spécifiques du type ligand-récepteurs [1]. Plusieurs travaux se sont intéressés aux modalités d'interaction entre Candida et différents types de cellules, de protéines de l'hôte et de supports inertes.

Notre étude s'est intéressée à l'adhérence comparative de cinq espèces du genre Candida, quatre espèces responsables d'infection clinique : Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata et une espèce colonisante, Candida kefyr. Le support inerte testé est le polychlorure de vinyle (PVC), matériel utilisé en médecine dans la fabrication de plusieurs types de prothèses (sonde d'intubation, cathéter central, cathéter urinaire...) et réputé hydrophobe et fixant [2, 3].

Matériels et méthodes

Origine des souches

Cinq espèces de Candida ont été étudiées (tableau 1). Des souches provenant de patients adultes hospitalisés en réanimation médico-chirurgicale et présentant un tableau clinique et paraclinique suspect d'une infection candidosique profonde. Il s'agit de :

- septicémies avec au moins deux hémocultures positives ;

- infections urinaires authentifiées par deux ECBU positifs à Candida en culture pure (>= 10⁵ germes/ml) associée à une leucocyturie (>= 10⁴ cellules/ml) ;

- pneumopathies acquises sous ventilation artificielle, les sécrétions pulmonaires profondes (< 25 cellules épithéliales/ml) étaient obtenues par lavage bronchoalvéolaire perbronchoscopique (>= 10³ germes/ml) ;

- une péritonite postopératoire.

Parallèlement, nous avons utilisé quatre souches de collection de Candida kefyr prélevées chez des malades de réanimation dans le cadre d'une surveillance systématique de l'infection nosocomiale. Les prélèvements proviennent du tube digestif, du liquide d'alimentation entérale, d'urines et des selles.

Identification des souches

Les cultures ont été réalisées sur milieu de Sabouraud solide (liquide pour les hémocultures) additionné de chloramphénicol-gentamicine, à 37 °C pendant 24 heures.

L'identification des différentes espèces a fait appel à :

- l'examen microscopique à l'état frais et après une coloration MGG ;

- le test de blastèse (de germination) pour l'identification rapide de Candida albicans ;

- le test de chlamydosporulation avec repiquage sur milieu PCB ou RAT pendant 24-48 heures à 27 °C, spécifique de Candida albicans ;

- l'identification biochimique par les galeries API 20C Aux (Biomérieux-France).

Étude de l'adhérence

La technique utilisée est inspirée de celle de Waters et al. [4]. Pour optimiser l'adhérence in vitro des souches de Candida, nous avons utilisé la technique de culture standardisée telle que décrite par Kennedy [1, 5], le support PVC remplaçant les cellules épithéliales.

* Préparation des souches : les souches sont préalablement repiquées sur un milieu de Sabouraud solide pendant 24 heures à température ambiante. Les colonies sont ensuite incubées dans un bouillon Sabouraud supplémenté en saccharose 500 mmol/l à 37 °C et incubées pendant 18 à 24 heures. La culture obtenue est centrifugée à la vitesse de 1 400 rpm pendant 10 minutes à 37 °C (centrifugeuse Jouan CR 412). Le culot est lavé deux fois au tampon phosphate (pH = 7,2). La numération des cellules est faite à la cellule de Mallassez. Les cellules sont ensuite diluées dans le tampon phosphate et ramenées à la concentration de 10⁶ cellules/ml³.

* Préparation du support inerte : les sondes en PVC sont coupées en carrés de 1 cm de côté et incubées pendant 30 minutes dans la solution tampon, puis placées dans des boites de Pétri stériles et séchées à 37 °C pendant 30 minutes. Toutes les manipulations sont faites dans des conditions d'asepsie.

* Mesure de l'adhérence : vingt millilitres de la suspension de Candida sont versés dans les boites de Pétri stériles contenant 5 à 10 carrés de PVC et incubés à 37 °C pendant 60 minutes, puis lavés par la solution tampon pendant 1 minute à deux reprises. Après fixation par le méthanol pendant 1 minute, la coloration est réalisée par le cristal violet à 1 % pendant 30 secondes et lavée par la solution tampon pendant 30 secondes. La numération est réalisée au microscope optique par comptage des cellules colorées de 30 champs (champs = 0,25 mm²), les résultats sont exprimés en nombre de cellules /mm² de matériel. Toutes les lectures sont faites sur cinq exemplaires et tous les essais sont répétés au moins à deux reprises. Chaque souche est étudiée séparément.

Étude statistique

Pour la comparaison entre les différentes souches des moyennes de cellules de Candida adhérentes au PVC, une transformation de variable a été effectuée. Le nombre de cellules adhérentes/mm² est exprimé en moyenne de logarithme décimal ± DS. La comparaison du pouvoir d'adhérence entre les souches et les espèces utilise le test non paramétrique de Kruskal-Wallis (logiciel EPIINFO 6). Le seuil retenu de signification est de 0,05.

Résultats

Le tableau 2 rapporte la moyenne logarithmique de levures adhérentes au PVC par souche. Il existe une variabilité de la moyenne des cellules adhérentes d'une souche à l'autre. Cette différence du pouvoir d'adhérence entre les souches d'une même espèce est particulièrement importante chez C. albicans. Le nombre de cellules adhérentes est multiplié par 10³ d'une souche à l'autre, alors que toutes les souches sont cliniquement virulentes. La variabilité du nombre de cellules adhérentes est moins significative pour les trois souches de C. glabrata qui semblent dotées d'un grand pouvoir d'adhérence au PVC et pour les quatre souches de C. kefyr qui restent globalement très peu adhérentes au PVC.

La comparaison des logarithmes décimaux correspondant aux moyennes de cellules adhérentes pour les cinq espèces met en évidence une différence statistiquement significative du pouvoir d'adhérence entre les cinq espèces (P = 0,049) (tableau 3). L'étude comparative bilatérale entre les moyennes des espèces deux à deux (tableau 3) ne retrouve pas de différence significative de l'adhérence au PVC entre les souches de C. albicans comparativement à celles de C. tropicalis et C. glabrata. En revanche, la moyenne (logarithmique) des cellules adhérentes de C. glabrata est significativement supérieure à celles de C. tropicalis et C. kefyr (P < 0,05). De même, les souches de C. tropicalis sont statistiquement plus adhérentes au PVC que les souches de C. kefyr (P < 0,05). Une seule souche de C. parapsilosis a été testée, elle apparaît adhérente mais aucune conclusion statistique ne peut être retenue. La dispersion des moyennes des cellules adhérentes chez C. albicans et la différence du nombre de souches testées par rapport à C. kefyr sont des facteurs à incriminer dans l'absence de différence significative de l'adhérence respective de ces deux espèces. Cependant, les souches de C. kefyr restent faiblement adhérentes par rapport à C. albicans et significativement moins adhérentes que celles de C. tropicalis et C. glabrata.

Il n'existe aucune différence statistiquement significative du pouvoir d'adhérence entre les souches de Candida, qu'elles proviennent de septicémie, d'infection urinaire ou d'infection pulmonaire profonde (tableau 4). En revanche, les 16 souches de Candida dites virulentes in vivo (albicans, tropicalis, glabrata et parapsilosis) sont statistiquement plus adhérentes au PVC que les souches non virulentes dites de colonisation (4 souches de C. kefyr) (P < 0,05) laissant suggérer une interrelation entre l'adhérence de Candida aux différents supports et sa virulence clinique.

Discussion

La pathogénie de l'infection fongique résulte d'une série complexe de facteurs séparés mais interdépendants qui ne peuvent être reproduits in vitro. Dans les milieux naturels, les mécanismes d'adhérence sont également multiples. Les études in vitro ne permettent que l'identification, la différenciation et l'étude des mécanismes d'adhésion à l'échelle moléculaire [5]. L'interprétation de ces résultats ainsi que leur extrapolation in vivo restent difficiles, d'autant plus que la diversité des techniques d'études in vitro dans la littérature rend difficile la comparaison des différents résultats rapportés.

Nous avons adapté le protocole de standardisation de la technique de culture décrit par Kennedy [1, 5]. Les techniques de marquage et de comptage des cellules adhérentes sont des éléments contributifs à la fiabilité et la reproductibilité des résultats. La technique de marquage radioactif est la technique de référence [3, 6, 7], mais la technique de bioluminescence [7, 8] est une alternative facile d'utilisation avec une fiabilité et une reproductibilité comparables [7]. Néanmoins, la coloration de Gram ou au cristal violet, avec lecture au microscope optique est la plus simple des techniques, mais sa fiabilité et sa reproductibilité sont arbitraires [9, 10-12]. Afin d'améliorer sa performance, nous avons fait une lecture microscopique sur au minimum cinq spécimens par souche et refait toutes les manipulations à deux reprises. Les résultats se sont révélés reproductibles.

Ces résultats in vitro ne peuvent cependant reproduire la réalité de l'adhérence in vivo. La possibilité de l'influence des conditions de culture et de la technique d'étude, sur le phénomène adhérence in vitro suppose par analogie l'influence du milieu intérieur dans l'adhérence in vivo de Candida aux différents dispositifs implantés. Une multitude de molécules et de cellules circulantes vont interférer et interagir dans le processus d'adhérence de Candida aux surfaces inertes implantées. L'adsorption de protéines plasmatiques sur les surfaces polyhydroxyéthylmathacrylate (PEHMA) (sondes urinaires) a été démontré [13]. Ce biofilm est également retrouvé sur les surfaces en PVC, en téflon et en silicone [14]. C'est ainsi que l'acide salicylique incorporé au cathéter urinaire en silastic a un rôle protecteur en s'opposant au phénomène d'adhérence [7]. Plusieurs travaux in vitro et in vivo ont démontré la contribution de molécules circulantes dans l'adhérence de staphylocoque à coagulase négative et de Staphylococcus aureus aux dispositifs intravasculaires. Fibrinogène, fibronectine, laminine, collagène et molécules du système complément sont autant de molécules qui vont constituer un biofilm autour du cathéter sur lequel vont s'adsorber les bactéries circulantes [15, 16]. Ces mécanismes d'adhérence spécifique sont également identifiés chez les levures du genre Candida, rendant complexe leur adhérence aux surfaces non biologiques [17-19].

De la revue de la littérature, il se dégage que le phénomène d'adhérence est un mécanisme de la virulence. Mais, la contribution de ce phénomène dans la virulence résulte, d'une part, des caractéristiques de la souche et, d'autre part, de son interaction avec le tissu hôte et les mécanismes de défense. Cette corrélation entre le pouvoir d'adhérence et la virulence de la souche apparaît également dans notre travail. Toutes nos souches virulentes provenant de septicémies, d'infection urinaire, de pneumopathies et de péritonite, étaient plus adhérentes que les souches de C. kefyr, choisi comme espèce de colonisation. L'interrelation adhérence-virulence a suscité plusieurs travaux dans la littérature. La virulence in vivo chez l'animal, est corrélée à la capacité de germination des souches de Candida albicans [20] dans un modèle animal, le phénomène de germination étant associé à l'apparition des adhésines pariétales et donc à la capacité d'adhérence des levures. L'utilisation de mutants morphologiques, sans pouvoir germinatif, réduit la virulence de la souche dans les modèles d'infection expérimentale à C. albicans chez l'animal [21] et vice versa, les souches les plus adhérentes à l'acrylique in vitro étant les plus virulentes chez l'animal [22]. Plusieurs hypothèses ont été avancées afin d'expliquer la relation adhérence-virulence chez Candida, telles que la résistante à la phagocytose par les polynucléaires neutrophiles [23] et la sécrétion enzymatique [18-20].

Les premiers travaux qui se sont intéressés à l'adhérence du genre Candida aux surfaces inertes concernaient l'adhérence au matériel dentaire (en acrylique) et sa contribution dans la survenue de stomatites chroniques à Candida chez les malades diabétiques et les porteurs du syndrome sec de Gougerot Sjögren [9, 10]. Depuis, plusieurs études se sont intéressées à l'adhérence de différentes espèces et souches du genre Candida à plusieurs types de surfaces non biologiques. Le pouvoir d'adhérence du genre Candida aux surfaces inertes est variable avec la nature physicochimique de ces surfaces. Dans une étude comparative de plusieurs composés inertes, Klotz [3] identifie le téflon comme la surface non biologique la plus hydrophobe et donc la plus adsorbante vis-à-vis du genre Candida. Rotrosen et al. [2] ont étudié, in vitro, l'adhérence comparative de C. albicans et C. tropicalis aux cathéters en téflon (périphérique) et en PVC (centraux). Les deux espèces adhéraient plus au PVC qu'au téflon. Dans une étude récente [24], l'adhérence d'une même souche de C. albicans uropathogène à différents matériaux utilisés dans la fabrication des sondes urinaires, polypropylène (PP), polyuréthane (PU), polyhydroxyéthylmathacrylate (PEHMA), a été comparée. Son pouvoir d'adhérence est corrélé aux propriétés physicochimiques de la surface inerte qui définissent son hydrophobicité. Bien que la différence ne soit pas significative, le silicone semble être moins fixant vis-à-vis des cellules de Candida comparativement à l'acrylique [8].

Il existe également une grande variabilité du pouvoir d'adhérence du genre Candida en fonction de l'espèce, mais également dans l'espèce même en fonction de la souche. Les espèces non albicans sont plus adhérentes aux surfaces inertes comparativement à l'espèce albicans. C. krusei se comporte comme une espèce hautement adhérente à l'acrylique, par rapport à Candida albicans mais avec une variabilité intra espèce significative [25]. C. tropicalis adhère plus que C. albicans à différentes résines dentaires [12], mais également au PVC et au téflon [2]. Klotz et al. [3] ont comparé l'adhérence de plusieurs espèces de Candida aux différents matériaux primaires. La variabilité de l'adhérence des différentes souches est de règle, avec un pouvoir d'adhérence supérieur pour C. krusei. La variabilité inter- et intraespèce du pouvoir d'adhérence de cinq espèces de Candida au PVC, est retrouvée dans notre travail. L'espèce C. albicans apparaît aussi adhérente au PVC que les espèces non albicans (tropicalis et glabrata). La dispersion des moyennes des différentes souches de C. albicans par rapport aux espèces non albicans virulentes suggère un pouvoir d'adhérence au PVC plus stable et plus important chez les espèces non albicans, bien que cela ne soit pas démontré statistiquement du fait du nombre réduit des souches étudiées. Cette variabilité intra- et inter-espèces du pouvoir d'adhérence du genre Candida fait évoquer l'intervention de mécanismes spécifiques [3, 25]. Plusieurs études ont corrélé l'adhérence du genre Candida aux différentes surfaces inertes à l'apparition de la néocouche fibrillaire à la surface de la cellule de Candida qui donne naissance aux adhésines spécifiques intervenant dans l'adhérence spécifique de type adhésine-ligand [10, 23, 26].

CONCLUSION

Dans notre modèle d'étude de l'adhérence du genre Candida au PVC, nous avons démontré que l'adhérence de Candida est une qualité de l'espèce mais également de la souche. La variabilité du pouvoir d'adhérence d'une souche à l'autre est encore plus notable pour l'espèce albicans. Dans ce travail, Candida albicans apparaît aussi adhérent au PVC que Candida tropicalis et Candida glabrata. Les souches provenant de malades infectés, dites souches virulentes, sont plus adhérentes in vitro que les souches de colonisation (Candida kefyr). La virulence de ces souches in vivo apparaît être corrélée à leur adhérence in vitro.

Le pouvoir d'adhérence du genre Candida contribue fondamentalement à sa virulence en clinique humaine. Les espèces non albicans sont douées d'un pouvoir d'adhérence aux surfaces inertes bien supérieur que celui de Candida albicans, expliquant l'éclosion de telles espèces comme nouveaux pathogènes chez les malades des unités de soins intensifs porteurs de plus d'une prothèse [2, 3, 12, 25]. La recherche de nouveaux matériaux destinés à la fabrication de cathéters et de sondes devrait viser à diminuer sinon à inhiber les facteurs contribuant à l'adhérence de levures in vivo, afin de prévenir les infections candidosiques qui sont de plus en plus fréquentes et graves dans les milieux de soins intensifs.

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