ARTICLE
Les papillomavirus humains (HPV), décrits en 1954 comme agents
responsables des condylomes génitaux [1], sont des virus de la
famille des Papovaviridae, non enveloppés, de 45 à
50 nm de diamètre, de symétrie icosaédrique (72 capsomères),
dont le génome est une molécule d'ADN bicaténaire
circulaire d'environ 8 000 paires de bases. Le génome viral code,
entre autres, des oncoprotéines non structurales avec cinq gènes
essentiels. Les gènes E5, E6 et E7 sont impliqués dans les
mécanismes d'immortalisation et de transformation de la cellule
hôte [2].
Les données épidémiologiques montrent que, dans
plus de 80 % des cas, l'infection à HPV est asymptomatique ou se
traduit par des lésions transitoires régressant spontanément
et évolue vers la guérison, conférant un état
d'immunité acquise. Et ce n'est que dans 10 à 20% des cas
que les lésions ano-génitales vont persister et évoluer
en néoplasies cervicales [3]. Les lésions bénignes
sont associées à des HPV dits à bas risque (types
6, 11, 42, 43, 44) et les lésions précancéreuses
et cancéreuses à des HPV dits à haut risque (types
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68). Il est désormais
admis que ces virus ont une transmission sexuelle prédominante
[4, 5] et qu'en Europe les HPV 16 et 18 jouent un rôle étiologique
dans la grande majorité des cancers du col utérin [6]. Ainsi
l'infection à HPV pose un réel problème de santé
publique et sa prévalence demeure élevée, en particulier
chez les femmes jeunes. L'incidence du cancer du col en France est de
28 pour 100 000 femmes par an avec une mortalité de 3/100 000 [7].
Depuis l'introduction des programmes de dépistage par frottis
cervico-vaginaux, une réduction majeure de l'incidence de la mortalité
par cancer du col a été observée [8]. Toutefois,
le diagnostic des lésions du col, reposant sur le trépied
cytologie-colposcopie-histologie, est parfois mis en défaut du
fait d'une couverture insuffisante de la population cible et d'une prise
en charge inadaptée en cas de frottis anormaux. La sensibilité
du dépistage cytologique dépend de la qualité des
prélèvements et des faux résultats négatifs
qui en découlent. De plus, la détection des HPV potentiellement
oncogènes peut servir de marqueur de risque chez des patientes
présentant des frottis anormaux.
Le virus n'est pas cultivable in vitro et les résultats
de la sérologie présentent un intérêt diagnostique
et pronostique très controversé [9]. Le diagnostic virologique
repose donc essentiellement sur la recherche de l'ADN des HPV à
partir d'écouvillons cervico-vaginaux et de fragments de biopsie.
L'objectif de notre travail était d'une part d'évaluer une
méthode d'hybridation moléculaire en tube avec amplification
du signal chimioluminescent pour la détection de l'ADN des HPV
et de confronter les résultats obtenus avec ceux de la cytologie
et de l'histologie, et d'autre part, de mieux cerner la place de la recherche
de l'ADN des HPV dans le dépistage et le suivi des cancers du col
de l'utérus.
Matériel et méthodes
Patients
Soixante-dix patientes ont été incluses dans l'étude
et réparties en trois groupes (tableau
1). Le premier groupe était constitué de 42 patientes
présentant des lésions cervicales et qui n'avaient pas encore
été traitées. Quatorze avaient des dysplasies de
grade 1 et/ou des condylomes (CIN1/condylomes), 27 des dysplasies de grade
2 et/ou de grade 3 (CIN2/3) et 1 un cancer invasif. La recherche de l'ADN
des HPV a été effectuée après l'obtention
des résultats des examens cytologiques. Le deuxième groupe
comportait 25 patientes qui avaient subi un traitement pour CIN1/condylomes
(12 cas), CIN2/3 (12 cas) et adénocarcinome in situ (1 cas).
Le troisième groupe comportait 3 patientes présentant des
lésions extracervicales (vulvaire, vaginale et anale) et qui n'avaient
pas encore été traitées.
Chez 9 patientes, nous avons pu réaliser la recherche du virus
avant et après traitement.
Au total, 79 prélèvements ont été réalisés.
Il s'agissait d'écouvillons cervicaux envoyés dans un 1
ml milieu de transport spécial (Digène) avec conservateur
pour retarder la croissance bactérienne et pour maintenir l'intégrité
de l'ADN. Les échantillons peuvent être conservés
pendant deux semaines à température ambiante et transportés
sans réfrigération jusqu'au laboratoire. Au laboratoire,
les échantillons étaient conservés à
20 °C jusqu'à la mise en œuvre de la réaction.
Méthodes
La détection de l'ADN des HPV est réalisée à
l'aide de la trousse Hybrid Capture® I (HCT-I) (Digène)
qui est un test d'hybridation moléculaire en tube, avec amplification
du signal chimioluminescent. Les échantillons (milieu de transport
avec écouvillon) sont décongélés à
température ambiante et homogénéisés à
l'aide d'un agitateur pendant 5 s ; 500 ml de réactif de dénaturation
sont distribués dans 1 ml d'échantillon (milieu de transport
avec écouvillon) et incubés à 65 °C pendant
45 min. Pendant l'incubation, les tubes d'hybridation sont préparés,
en distribuant, dans le tube A 50 ml de la sonde HPV A (groupe de sondes
ARN des HPV 6, 11, 42, 43, 44) et dans le tube B, 50 ml de la sonde HPV
B (groupe de sondes ARN des HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56). Dans
ces tubes sont rajoutés 150 ml d'échantillons dénaturés.
Ils sont ensuite incubés à 65 °C pendant 45 min. Les
échantillons sont ensuite transférés dans des tubes
contenant des anticorps antihybrides ARN-ADN fixés (tubes de capture)
qui sont mis en agitation à 1 100 rpm à 25 °C pendant
65 min. À ce stade, les hybrides ARN-ADN résultants sont
capturés par les anticorps antihybrides. Les tubes sont ensuite
décantés et essuyés ; 250 ml d'anticorps antihybrides
ARN-ADN conjugués à la phosphatase alcaline sont ajoutés
et incubés à 25 °C pendant 30 min. Durant cette phase,
les hybrides ARN-ADN immobilisés réagissent avec l'anticorps
conjugué. Et 250 ml de substrat chimioluminescent (LumiPhos®
530) sont ajoutés, puis incubés à 25 °C pendant
30 min. Les tubes sont soigneusement essuyés, puis lus au luminomètre
DCR-1 (Digène) qui mesure la radiation lumineuse émise par
le substrat, clivé par la phosphatase alcaline. L'intensité
de la lumière émise, exprimée en unités RLU
(relative lights units), est proportionnelle à la quantité
d'ADN cible présente dans l'échantillon.
Résultats
Patientes avec des lésions cervicales
non traitées
Chez les patientes présentant des lésions cytologiques
intraépithéliales de bas grade (LBG), nous avons détecté
dans 5 cas des HPV à haut risque, dans 1 cas des HPV à bas
risque et dans 2 cas à la fois des HPV à haut risque et
à bas risque. Parmi 27 patientes présentant des lésions
cytologiques intraépithéliales de haut grade (LHG), nous
avons mis en évidence dans 23 cas des HPV à haut risque
et dans 1 cas à la fois des HPV à haut risque et à
bas risque (tableau 2).
Ainsi, des HPV à haut risque sont retrouvés chez près
de 50 % des patientes avec des LBG et chez 90 % des patientes avec des
LHG. Au total, sur les 42 patientes présentant des lésions
histologiques, 32 étaient infectées par des HPV, soit 76
% (tableau 2).
Patientes avec des lésions cervicales
traitées
Le tableau 3 présente
les résultats obtenus dans le groupe des 25 patientes dont les
lésions cervicales ont été traitées. Les résultats
cytologiques et virologiques sont ceux obtenus après traitement
; en revanche, les résultats histologiques ont été
obtenus avant traitement. Chez les 17 patientes présentant aux
frottis des résultats cytologiques normaux, nous avons détecté,
dans 2 cas, à la fois des HPV à haut risque et à
bas risque et dans 1 cas des HPV à bas risque. La détection
à la fois de HPV à haut risque et à bas risque a
été faite chez 1 patiente infectée par le VIH et
chez 1 patiente de plus de 65 ans.
Nous avons détecté des HPV à haut risque chez 2
patientes parmi les 4 présentant des altérations cellulaires
malpighiennes de signification indéterminée (Ascus) (tableau
3).
Chez 1 patiente sur 3 avec des LBG et chez 1 patiente avec des LHG,
nous avons mis en évidence à la fois des HPV à haut
risque et à bas risque. Les 2 patientes porteuses d'HPV étaient
infectées par le VIH (tableau
3).
Patientes avec des lésions extracervicales
Dans le groupe des 3 patientes ayant des lésions extracervicales,
nous avons détecté chez 1 patiente des HPV à bas
risque et chez 2 patientes des HPV à haut risque (tableau
4).
Résultats après traitement
Neuf patientes ont bénéficié de la recherche de
l'ADN viral avant et après traitement. Après traitement,
l'examen cytologique des frottis était normal et la détection
des HPV était négative chez 7 patientes qui avaient des
dysplasies CIN3, et chez 2 autres qui avaient des dysplasies CIN1, associées
soit à des HPV à bas risque, soit à des HPV à
haut risque, soit aux deux types d'HPV à la fois (tableau
5).
Discussion
Dans notre étude, nous avons montré que 76 % des patientes
présentant des lésions à l'histologie étaient
infectées par des HPV (32/42). L'infection à HPV à
haut risque est corrélée dans 90 % des cas aux LHG et aux
dysplasies CIN2/3, et dans 50 % des cas aux LBG et aux dysplasies CIN1/condylomes.
Ces résultats sont en accord avec ceux de la littérature
[10, 11] qui indiquent que l'infection à HPV à haut risque
constitue un facteur étiologique important dans la survenue des
dysplasies cervicales. En effet, Cox et al. [12] ont montré
que la sensibilité de l'Hybrid Capture® est de 86
% (43/50) dans les dysplasies cervicales de grade 1 et de 93 % (14/15)
dans les dysplasies cervicales de grades 2 et 3, alors qu'un test cytologique
répété ne présente respectivement qu'une sensibilité
de 60 % (30/50) et de 73 % (11/15). D'autres études prospectives
ont montré qu'environ 30 % des patientes avec des LBG, porteuses
d'HPV à haut risque, ont développé des LHG dans les
3 ans, à l'inverse de celles présentant des résultats
HPV-négatifs ou des LBG avec HPV à faible risque [11]. Par
ailleurs, Franco [13] a montré que, chez des femmes ayant des frottis
normaux, 49 à 70 % des porteuses d'HPV à haut risque vont
développer une LBG contre 3 à 14 % chez des non-porteuses.
Turazza et al. [14] ont rapporté que des HPV à
faible risque pour le développement de cancers génitaux
tels que les types 6 et 11 ont été retrouvés isolément
dans 4 cas de tumeurs génitales. Par ailleurs, dans notre étude,
nous avons détecté des HPV à bas risque chez 2 patientes
présentant des dysplasies CIN2/3 et chez une autre ayant une lésion
vulvaire de grade 1 et des condylomes. Les HPV à bas risque peuvent
être impliqués dans la survenue de ces lésions ; cependant,
le rôle d'HPV à haut risque ne peut être exclu car
leur non-détection peut être une conséquence du manque
de sensibilité du test HCT-I, ou de l'absence de détection
de certains types d'HPV. Des travaux complémentaires réalisés
à l'aide de techniques de PCR ou de southern-blot sont nécessaires
pour clarifier le rôles des HPV à haut risque dans ces lésions.
L'hybridation moléculaire en tube est
une méthode simple, sensible, standardisée, bien adaptée
à la routine et les résultats peuvent être rendus
dans la journée. Ce test permet de détecter 14 types d'HPV
différenciés en bas risque et en haut risque en utilisant
deux mélanges de sondes distinctes. En revanche, ce test peut donner
des résultats faussement négatifs lorsque les prélèvements
sont incorrects et/ou parce que la valeur seuil de 10 pg /ml d'ADN d'HPV
est faible comparée à celle de la PCR ou du test de deuxième
génération HC-II (0,2 pg/ml). De plus, le test HCT-I ne
détecte pas certains HPV à haut risque tels que les types
39, 58, 59 et 68. Un nouveau test de deuxième génération
Hybrid Capture® II Digène HPV test en microplaque
(HC-II) remplace désormais le premier et détecte ces types.
Ferris et al. [15] ont montré que le test HC-II est plus
sensible et qu'il détecte des HPV à haut risque chez 90
% des patientes présentant des dysplasies CIN2/3, alors que l'HCT-I
ne détecte des HPV à haut risque que chez 62 % des patientes
avec de telles lésions. De plus, ce test présente une sensibilité
et une spécificité comparables à celles de la PCR
[5].
Des auteurs ont montré que parmi les techniques les plus couramment
utilisées pour la détection des HPV, le southern-blot est
considéré comme la méthode de référence.
Il permet de distinguer l'état de l'ADN viral (épisomique
ou intégré) et a une très bonne spécificité,
mais il est long et nécessite une quantité importante de
matériel biologique ; l'hybridation in situ présente
une faible sensibilité (45 %) mais permet de localiser l'ADN viral
à l'échelon cellulaire ; la PCR est très sensible
(90 à 100 %) mais présente une faible valeur prédictive
en raison des résultats positifs discordant avec la clinique ;
l'Hybrid Capture® Digène présente un bon
rapport coût/efficacité, les résultats concordent
souvent avec la clinique et, de plus, il s'adapte bien aux dépistages
de routine [16, 17].
Par ailleurs, un nouveau système de prélèvement
en milieu liquide, la méthode ThinPrep® Pap testTM
(Cytyc Corporation), devrait permettre de standardiser les modalités
de prélèvement et d'améliorer ainsi les résultats
des examens cytologiques. Selon des études récentes, il
permet une amélioration de 50 à 100 % de la détection
à la fois des LBG et des LHG [18, 19] et réduit considérablement
le taux de faux résultats négatifs [20].
Une étude a montré que la combinaison de la détection
des HPV et des résultats cytologiques présente une sensibilité
de plus de 95 % pour détecter des dysplasies CIN2/3 et une valeur
prédictive négative de 98 % pour ne pas détecter
des néoplasies intra-épithéliales cervicales [21].
La détection des HPV à haut risque est donc utile dans la
prise en charge des patientes présentant au frottis des lésions
de type Ascus ou équivoques car elle permet aux gynécologues
de sélectionner les patientes nécessitant une colposcopie
et de standardiser le suivi des lésions.
En conclusion, la détection des HPV par hybridation moléculaire
peut être utile en complément du frottis cervico-vaginal
pour le diagnostic et le suivi des lésions et leur traitement.
Article reçu le 3 février 1999, accepté le 23 avril
1999.
REFERENCES
1. Barret TJ, Silbar JD, McGinley JP. Genital Warts. A venereal
disease. JAMA 1954 ; 154 : 333-4.
2. Mougin C, Bernard B, Lab M. Biologie des infections à
papillomavirus : I. Caracteristiques générales. Ann Biol
Clin 1997 ; 55 : 553-63.
3. Koutsky L. Epidemiology of genital human papillomavirus Infection.
Am J Med 1997 ; 102 (5A) : 3-8.
4. Schiffman MH, Briton LA. The epidemiology of cervical carcinogenesis.
Cancer 1995 ; 76 (10 suppl.) : 1888-901.
5. Mougin C, Bernard B, Lab M. Biologie des infections à
papillomavirus : II. Leur rôle dans la carcinogenèse du col
utérin. Ann Biol Clin 1998 ; 56 : 21-8.
6. Bosch FX, Manos MM, Munoz N, et al. Prevalence of human
papillomavirus in cervical cancer : a worldwide perspective. International
biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer
Inst 1995 ; 87 : 796-802.
7. Michel G, Castaigne D, Luton D. Cancer du col de l'utérus
: épidémiologie, anatomie pathologique, dépistage,
diagnostic, évolution, pronostic, traitement. Rev Prat 1996
; 46 : 605-13.
8. Hakama M, Magnus K, Pettersson F, Storm H, Tulinius H. Effect
of organized screening on the risk of cervical cancer in the Nordic countries.
In : Miller AB, Chamberlain J, Day NE, Hakama M, Prorok PC, eds.
Cancer Screening. Cambridge. UICC Projects on evaluation of screening
for cancer, 1991 : 153-62.
9. Meschede W, Zumbach K, Braspenning J, et al. Antibodies
against early proteins of human papillomaviruses as diagnostic markers
for invasive cervical cancer. J Clin Microbiol 1998 ; 36 : 475-80.
10. Schiffman MH, Bauer HM, Hoover RN, et al. Epidemiologic
evidence showing that human papillomavirus infection causes most cervical
intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 1993 ; 85 : 958-64.
11. Kousty LA, Holmes KK, Critchlow CW, et al. A cohort
study of the risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in
relation to papillomavirus infection. N Engl J Med 1992 ; 327 :
1272-8.
12. Cox JT, et al. Human papillomavirus testing by hybrid
capture appears to be useful in triaging women with a cytologic diagnosis
of atypical squamous cells of undeterminated significance. Am J Obstet
Gynecol 1995 ; 172 : 946-54.
13. Franco EL. Cancer causes revisited : human papillomavirus
and cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst 1995 ; 87 : 779-80.
14. Turazza E, Lapena A, Sprovieri O, et al. Low-risk
human papillomavirus types 6 and 11 associated with carcinomas of the
genital and upper aero-digestive tract. Acta Obst Gynecol Scand
1997 ; 76 : 271-6.
15. Ferris DG, Wright TC Jr, Litaker MS, et al. Comparaison
of two tests for detecting carcinogenic HPV in women with Papanicolaou
smear reports of Ascus and LSIL. J Fam Pract 1998 ; 46 : 136-41.
16. Cope JU, Hildescheim A, Schiffman MH, et al. Comparaison
of the hybrid capture tube test and PCR for detection of human papillomavirus
DNA in cervical specimens. J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 2262-5.
17. Wieland U, Pfister H. Molecular diagnosis of persistent human
papillomavirus infections. Intervirology 1996 ; 39 : 145-57.
18. Papillo JL, Zarka MA, St John TL. Evaluation of the ThinPrep
Pap Test in clinical practice. A seven-month, 16, 314-case experience
in northern Vermont. Acta Cytol 1998 ; 42 : 203-8.
19. Bolick DR, Hellman DJ. Laboratory implementation and efficacy
assessment of the ThinPrep cervical cancer screening system. Acta Cytol
1998 ; 42 : 209-13.
20. Linder J, Zahniser D. ThinPrep Papanicolaou testing to reduce
false-negative cervical cytology. Arch Pathol Lab Med 1998 ; 122
: 139-44.
21. Cuzick J, Szarewski A, Terry G, et al. Human papillomavirus
testing in primary cervical screening. Lancet 1995 ; 345 : 1533-6.
|
Version imprimable
