ARTICLE
L'homocystéine est un acide aminé soufré non protéique
qui circule lié à 80 % aux protéines plasmatiques
et principalement à l'albumine. Les 20 % restants sont retrouvés
dans le plasma sous forme de disulfides et seules des traces d'homocystéine
libre sont présentes au niveau sanguin [1].
Sur le plan physiologique, l'homocystéine occupe une place centrale
dans le métabolisme des acides aminés soufrés. Elle
est le produit de déméthylation de la méthionine,
principal donneur de méthyle de l'organisme sous sa forme S-adénosylméthionine.
Celle-ci, en donnant son méthyle, se transforme en S-adénosyl-homocystéine
qui se scinde en homocystéine et en adénosine [2]. Environ
50 % de l'homocystéine ainsi formée sera reméthylée
sous l'action de la méthyltétrafolate réductase en
présence de cofacteurs tels que la vitamine B12 et les folates.
Sous l'action de cystathionine-bêtasynthétase agissant en
présence de vitamine B6, l'homocystéine se métabolise
en cystathionine, puis en cystéine [3]. Ces différentes
voies métaboliques expliquent que des hyperhomocystéinémies
peuvent être observées lors d'anomalies héréditaires
impliquées dans ce métabolisme ou lors de déficit
vitaminique acquis [2]. Ainsi, le déficit congénital homozygote
en cystathionine-bêtasynthétase est responsable de l'homocystinurie
caractérisée par une accumulation au niveau sanguin d'homocystéine.
Des déficits total ou partiel en méthyltétrafolate
réductase sont également responsables de l'accumulation
plasmatique d'homocystéine [2]. Bien que, dans leur forme homozygote,
ces déficits soient très peu fréquents, ils se caractérisent,
au niveau clinique, par l'apparition très précoce de thromboses
[4]. Ces constatations ont conduit à suspecter l'implication de
l'homocystéine dans les mécanismes d'artériosclérose
depuis la fin des années 60 [5]. De nombreuses études tant
prospectives que rétrospectives ont montré qu'une hyperhomocystéinémie
est un facteur de risque dans les maladies cardiovasculaires, indépendant
des facteurs de risque classiques que sont le tabagisme, l'hypercholestérolémie,
le diabète, l'obésité et l'hypertension [6]. De plus,
il semblerait exister une relation étroite entre les concentrations
plasmatiques en homocystéine et l'étendue des lésions
d'artériosclérose [3].
L'intérêt de ce nouveau facteur de risque a entraîné
l'apparition de nombreuses méthodes de dosages, essentiellement
par chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec détection
fluorimétrique après dérivation [7]. La plupart de
ces techniques basées sur l'utilisation de la tri-n-butylphosphine
comme agent réducteur sont longues et délicates.
Dans cette étude, nous avons évalué une nouvelle
technique par chromatographie liquide haute performance commercialisée
par la société Bio-Rad. Cette technique combine les étapes
de réduction et de dérivation avec un temps d'élution
chromatographique très court inférieur à 5 min. Nous
présentons dans ce travail les résultats de sa validation
analytique ainsi que les valeurs de référence obtenues chez
des sujets considérés comme exempts de toutes pathologies.
Matériel et méthodes
Principe du dosage
Le principe de la technique Bio-Rad repose sur le protocole suivant
: libération des aminothiols des protéines et réduction
des formes oxydées par un dérivé de la tri-n-butylphosphine,
dérivation des thiols réduits par l'action d'un réactif
contenant du 7-fluoro-2,1,3-benzodiazole-4-sulfonamide, précipitation
des protéines par l'acide trichloracétique à 20 %,
puis séparation chromatographique par CLHP en phase inverse avec
détection par fluorescence.
L'originalité de la technique repose sur la réalisation
simultanée des étapes de réduction et de dérivation
dans des conditions opératoires très simples consistant
en une seule étape d'incubation de 5 min à 50 °C suivie
d'un refroidissement brutal de 5 min à + 4 °C.
Préparation des solutions étalons
et des réactifs
Tous les réactifs, solutions de calibration et de contrôles
sont fournis dans la trousse commercialisée par Bio-Rad (réf.
195-4075) qui permet la réalisation de 100 dosages.
Le réactif de réduction est reconstitué par ajout
de 6 ml de tampon borate fourni dans la trousse. Après reconstitution,
il est réparti en aliquotes de 500 ml (volume nécessaire
pour 10 dosages) conservés à 20 °C (stable 2
mois). Le réactif de dérivation est repris par 3 ml de tampon
borate, puis réparti sous un volume de 1 ml et congelé immédiatement
à 20 °C (durée maximale de conservation de 2
semaines).
La solution de calibration et les deux contrôles (contrôle
bas : valeur cible = 7,5 mmol/l ; contrôle haut : valeur cible =
26 mmol/l) sont reconstitués par 1 ml d'eau distillée, aliquotés
sous 50 ml et conservés à 20 °C jusqu'au moment
du dosage (durée maximale de conservation de 3 mois).
L'étalon interne est reconstitué à l'aide de 12
ml de tampon borate, puis aliquoté sous 1 ml et conservé
à 20 °C (stable 2 mois).
Préparation des échantillons
Les échantillons de sang sont prélevés sur tube
Vacutainer contenant de l'EDTA. Après le prélèvement,
les tubes sont placés dans la glace et doivent être centrifugés
le plus rapidement possible à leur arrivée au laboratoire.
Après décantation, les plasmas sont conservés à
80 °C jusqu'au moment des dosages.
La préparation du calibrant, des contrôles et des échantillons
est réalisée de la façon suivante. Dans des tubes
Eppendorf, 50 ml de plasma (calibrant, contrôles, échantillons),
100 ml d'étalon interne, 50 ml de réactif de réduction
et 100 ml de dérivation sont mis à incuber à 50 °C
pendant 5 min. Après 5 min de refroidissement dans la glace, 100
ml de réactif de précipitation sont ajoutés. Les
tubes sont centrifugés pendant 5 min à 4 000 tours par minute.
À l'issue de la centrifugation, 30 ml de surnageant sont injectés
dans le système chromatographique. Après précipitation,
le produit de dérivation est stable pendant au moins 24 heures
à
+ 4 °C.
Conditions chromatographiques
Le système chromatographique est composé d'une pompe isocratique
(Waters 515), d'un injecteur automatique (Autosampler 712, Waters), d'une
enceinte thermostatée (Bio-Rad). La séparation est réalisée
sur une colonne C18 (70 mm x 3,2 mm ID) protégée par une
précolonne (colonne et précolonne, Bio-Rad) thermostatées
à 45 °C. La phase mobile (Bio-Rad) contient du méthanol
et est utilisée au débit de 0,7 ml/min.
La détection est réalisée à l'aide d'un
spectrofluorimètre Shimadzu RF-535 (Touzart et Matignon), réglé
aux longueurs d'ondes d'excitation de 385 nm et d'émission de 515
nm. La sensibilité du fluorimètre est réglée
sur la position haute. Le signal est divisé par 512 avant d'être
transmis à l'intégrateur. Les données sont recueillies
sur un intégrateur (Waters 746). L'atténuation est réglée
à 8.
La quantification de l'homocystéine dans les contrôles
et les échantillons est réalisée par rapport à
la solution de calibrant en appliquant la formule suivante :
Analyse statistique
Les résultats obtenus chez les sujets témoins sont exprimés
en moyenne et écart type. Le test d'analyse de variance (Anova)
est utilisé pour comparer les concentrations plasmatiques de l'homocystéine
en fonction du sexe et de l'âge. Une valeur de p inférieure
à 0,05 a été considérée comme significative.
Résultats
Chromatographie
Dans les conditions décrites précédemment, la technique
permet, avec une très bonne résolution la séparation
rapide (durée de chromatographie inférieure à 5 min)
de 4 aminothiols que sont : le glutathion, la cystéine, l'homocystéine
et la cystéinylglycine avec des temps de rétention respectivement
de 1,40, 1,77, 2,95 et 3,65 min. L'étalon interne est élué
au bout de 2,33 min. La figure
1 représente les chromatogrammes obtenus pour la solution
de calibration (figure 1, A),
un patient sain (figure 1, B)
et un sujet présentant une homocystéinémie à
70 mmol/l (figure 1, C).
Répétabilité et reproductibilité
Elles ont été déterminées d'une part sur
les deux contrôles de la trousse et sur un pool de plasma. Chaque
échantillon a été mesuré trente fois dans
les mêmes conditions et calculé par rapport à la solution
de calibrant dosée en début de manipulation. Pour des valeurs
de 7,5 et 26 mmol/l (témoins) et 5,2 mmol/l (valeur moyenne pour
le pool de plasma), les coefficients de variation intraséries sont
respectivement de 4,6, 3,8 et 3,6 %.
Pour l'étude de la précision interséries basée
sur la détermination des échantillons précédents
dans 30 séries différentes, nous avons retrouvé des
coefficients de variation compris entre 3,1 et 4,6 %.
Limite de détection
La limite de détection a été déterminée
par injection de quantité décroissante de la solution de
calibrant. En adoptant une valeur du rapport signal sur bruit de 5:1,
l'homocystéine était encore très facilement détectable
à la concentration de 0,75 mmol/l (correspondant à une quantité
injectée de 2,2 pmol).
Exactitude
L'évaluation de l'exactitude a été réalisée
par les épreuves de dilutions et de surcharges. Le test de dilution
pratiqué sur le contrôle fort et sur un plasma témoin
montre que les pourcentages de récupération sont compris
entre 83 et 118 % (tableau 1,
A). L'épreuve de surcharge a été pratiquée
en surchargeant le contrôle bas et un plasma témoin par des
volumes croissants de la solution calibrante. Les résultats (tableau
1, B) montrent que les pourcentages de récupération
varient de 92 à 103 %. Les résultats de ces deux épreuves
confirment la bonne exactitude et la linéarité de la méthode.
Corrélation
L'étude de corrélation a été réalisée
sur 60 échantillons variant dans une gamme de concentration de
5 à 70 mmol/l avec pour technique de référence la
méthode décrite par Fermo et al. [8]. La figure
2 montre l'excellente corrélation (R2 = 0,997)
retrouvée entre les deux techniques même pour les valeurs
inférieures à 15 mmol/l considérées comme
physiologiques par la méthode Bio-Rad (R2 = 0,967).
Interférences
L'étude de différentes substances à groupements
thiols (N-acétyl-cystéine, Captopril®, D-pénicillamine)
capables de réagir avec le réactif de dérivation
montre qu'il n'existe pas d'interférence. En effet, ces substances
sont soit éluées très rapidement (comme la N-acétyl-cystéine),
soit au contraire très tardivement pour les deux autres composés
testés.
Influence de l'anticoagulant
Elle a été étudiée chez dix témoins
supposés sains prélevés simultanément sur
tube sec et sur des tubes contenant de l'héparinate de lithium,
du citrate de sodium et de l'EDTA. Les résultats de notre travail
montrent que les valeurs en homocystéine sont similaires pour les
prélèvements réalisés sur EDTA et citrate.
Le prélèvement sur héparinate induit les valeurs
les plus élevées (+ 25 % en moyenne), celles obtenues sur
sérum sont intermédiaires avec une augmentation de 10 à
15 % selon les échantillons.
Influence du délai
et de la température de conservation de l'échantillon avant
centrifugation
Les érythrocytes sont impliqués dans l'augmentation de
la concentration plasmatique en homocystéine pendant la conservation
des prélèvements, due à un apport d'homocystéine
dérivée des réactions de carboxyméthylation
dans les cellules [9].
Pour étudier cette variation, nous avons prélevé
8 tubes EDTA chez un même sujet témoin. Après homogénéisation,
chaque tube a été séparé en deux parties égales,
l'une conservée à température ambiante (+ 22 °C),
l'autre étant placé à + 4 °C. Le premier tube
de chaque série a été centrifugé immédiatement
à froid, décanté puis congelé. Les autres
tubes ont respectivement été centrifugés 30 min,
1, 2, 4, 6, 8 et 10 heures après le prélèvement.
Tous les plasmas ont été congelés à
80 °C pour être dosés dans une même série.
Pour les tubes conservés à + 4 °C, nous n'avons pas
observé de variation significative des concentrations au cours
du temps. À l'inverse, la conservation à température
ambiante induit une augmentation significative de l'homocystéine
dès la 4e heure, qui atteint
+ 25 % après 10 heures de conservation de l'échantillon
à température ambiante (figure
3, A).
Étude de la conservation des échantillons
Nous avons réalisé cette étude sur un pool de plasma
témoin (6,6 mmol/l), réparti en aliquotes conservés
à + 4 °C, 20 °C et 80 °C. Les dosages
ont été réalisés le jour de la fabrication
du pool, puis 1, 7, 15, 45 et 90 jours après.
Les résultats (figure
3, B) montrent une bonne stabilité des échantillons
à 20 °C et 80 °C et une augmentation significative
dès J30 pour les échantillons conservés à
+ 4 °C. Cependant, même à 20 et 80 °C,
nous avons observé une augmentation de 20 à 25 % au bout
de 90 jours de conservation.
Concentrations plasmatiques chez les sujets sains
Les résultats ont été obtenus à partir d'une
population de 80 sujets sains (20-60 ans) se répartissant en 40
femmes (âge moyen 39,2 ± 12,5 ans) et 40 hommes (âge
moyen 40,1 ± 13,2 ans). Tous ces patients présentaient des
concentrations normales de vitamine B12 et de folates sériques.
La figure 4 représente
les concentrations en homocystéine en fonction du sexe pour tous
les sujets (20-60 ans) et par tranches d'âge de 10 ans. Les valeurs
moyennes en homocystéine tous âges confondus sont respectivement
de 9,6 ± 2,8 mmol/l chez les hommes et de 8,4 ± 2,5 mmol/l chez
les femmes. Nous n'avons pas retrouvé de différence significative
selon le sexe quelle que soit la tranche d'âge étudiée.
En revanche, nous avons noté une augmentation significative de
la concentration en homocystéine dans la population 50-60 ans par
rapport au groupe 20-30 ans pris comme référence. Cette
différence a été retrouvée dans les deux sexes.
Cependant, toutes les valeurs déterminées chez les patients
sains sont inférieures à 15 mmol/l, considérée
comme valeur seuil pour la technique Bio-Rad.
Commentaires
La méthode développée par la société
Bio-Rad permet un dosage fiable de l'homocystéine comme le montrent
les caractéristiques analytiques de la trousse. À noter,
en particulier, l'excellente précision de la technique et une bonne
limite de sensibilité voisine de 0,5 mmol/l, tout à fait
suffisante, d'autant plus que les valeurs d'homocystéine inférieures
à 3-4 mmol/l sont extrêmement rares. Cependant, l'intérêt
principal de cette technique réside dans la rapidité de
la préparation de l'échantillon (étapes de réduction
et de dérivation simultanées) et dans le temps d'analyse
très court d'environ 5 min. D'un point de vue analytique, bien
que la méthode soit linéaire, il semblerait intéressant
de pouvoir remplacer le seul point de calibration par une gamme d'étalonnage.
Le principal inconvénient reste, comme pour toute trousse commerciale,
le coût relativement élevé, d'autant plus que la technique
nécessite une enceinte thermostatée pas toujours disponible
dans les laboratoires. Cela, associé à des durées
de péremption courtes pour certains réactifs, peut poser
des problèmes pour les laboratoires ne réalisant que peu
de dosages.
L'application de cette technique à l'établissement de
valeurs de référence a permis de retrouver des valeurs de
référence proches de celles de la littérature [10].
S'il existe bien une variation de l'homocystéinémie en fonction
du sexe, quel que soit l'âge, nous n'avons pu mettre en évidence
de différences significatives contrairement à certaines
publications [11]. En revanche, nous avons retrouvé une élévation
de l'homocystéine en fonction de l'âge devenant significative
pour des sujets dont celui-ci est compris entre 50 et 60 ans, observation
en concordance avec celles de la littérature [11].
En conclusion, la technique Bio-Rad, nous paraît bien adaptée
au dosage de l'homocystéine plasmatique totale dans la pratique
courante du laboratoire en raison de la préparation simple des
échantillons, de la stabilité du dérivé fluorescent
et d'une durée de séparation chromatographique très
inférieure à celles rapportées pour d'autres méthodes.
Article reçu le 20 avril 1999, accepté le 15 mai 1999.
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10. Ueland PM, Refsum H, Stabler SP, Malinow MR, Andersson A,
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Hultberg B. Homocysteine and cysteine : determinants of plasma levels
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