ARTICLE
Auteur(s) : Frédéric Carrière
Laboratoire d’enzymologie interfaciale et de physiologie de la
lipolyse, CNRS UPR 9025, 31 chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille
cedex 20, France
La médaille Chevreul récompense chaque année depuis 1963 une
personnalité française et une personnalité étrangère ayant
contribué de façon significative au développement des connaissances
ou des réalisations industrielles dans le domaine des corps gras.
Elle rappelle que c’est en France, grâce aux travaux de Michel
Eugène Chevreul (1786-1889), que sont nées la chimie des corps gras
et la lipochimie. Je suis très heureux de la recevoir cette année
pour mes travaux sur les lipases, ces enzymes qui permettent de
digérer les corps gras. Je voudrais à cette occasion rappeler que
je suis le cinquième chimiste formé à Marseille à recevoir cette
distinction. Pierre Desnuelle (1965), Maurice Naudet (1971),
Bernard Entressangles (1983) et Jean Graille (1997) m’ont précédé.
Nous avons tous en commun d’avoir travaillé sur les lipases à un
moment de notre carrière. Comme la fabrication du savon, l’étude
des lipases est ainsi une longue tradition marseillaise initiée il
y a plus de 60 ans et reconnue au niveau international.
Lorsque le Professeur Pierre Desnuelle (figure 1) arriva à
Marseille en 1943 pour y enseigner la biochimie et prendre la
direction du Laboratoire national des matières grasses (futur
ITERG, localisé aujourd’hui à Bordeaux), l’industrie des huiles et
corps gras était encore importante dans la région marseillaise et
la Chambre de commerce et d’industrie l’incita à développer une
recherche à l’interface entre la chimie des lipides et la biologie.
Ingénieur chimiste de formation, élève du Prix Nobel Victor
Grignard à Lyon, Pierre Desnuelle comprit rapidement qu’une bonne
connaissance de la physico-chimie était essentielle pour
appréhender le mode d’action des enzymes agissant sur des substrats
insolubles tels que les huiles. Pour recruter un grand nombre de
ses futurs élèves, il se tourna donc naturellement vers l’Ecole
supérieure de Chimie de Marseille (figure 2) dirigée par le
Professeur Margaillan et qui se trouvait à quelques pas de son
laboratoire sur le site de la faculté des sciences de St Charles.
Ce lien avec les élèves de l’Ecole de Chimie (devenue aujourd’hui
une composante de l’Ecole Centrale de Marseille) s’est perpétué
depuis cette époque et plusieurs d’entre eux ont contribué aux très
nombreuses publications sur les lipases issues de la cité
phocéenne : Pierre Savary (Promotion 1939), Maurice Naudet
(Promotion 1940), Mireille Rovery (Promotion 1945), Louis Sarda
(Promotion 1954), Odette Guy-Crotte (Promotion 1957), Gilbert
Benzonana (Promotion 1960), Suzanne Maroux (Promotion 1960), Jean
Graille (Promotion 1965), Jacques Baratti (Promotion 1966), Gérard
Piéroni (Promotion 1966), Robert Verger (Promotion 1966), Gérard
Buono (Promotion 1968), Christian Triantaphylidès (Promotion 1969),
Georges Langrand (Promotion 1981), Frédéric Carrière (Promotion
1986), Frédéric Fotiadu (Promotion 1987), Franck Marguet (Promotion
1988), Jean-François Cavalier (Promotion 1993), Sylvie Fernandez
(Promotion 2005). Cette histoire commune est jalonnée d’étapes
importantes dans la description du mode d’action des lipases,
depuis leurs aspects moléculaires jusqu’à leur rôle physiologique
et à leurs nombreuses applications médicales et industrielles.
Les travaux de pionnier de Pierre Desnuelle sur la lipase
pancréatique
Pierre Desnuelle s’intéresse aux aspects moléculaires de la
digestion, poursuivant ainsi le travail de Claude Bernard sur
l’action des sucs digestifs, notamment l’action du suc pancréatique
sur les matières grasses et les protéines. Le pancréas est alors la
principale source d’enzymes et l’étude des enzymes pancréatiques
sera au centre de ses projets de recherche pendant 40 ans.
Contrairement à Jacques Monod, il ne considère pas les enzymes de
la digestion comme plus « naïfs » que ceux impliqués dans
les réactions intracellulaires mais comme des modèles permettant de
comprendre les processus enzymatiques dans leur ensemble. Il est
contemporain de grands noms de la biochimie comme Hans Neurath, qui
s’intéresse également aux protéases pancréatiques, et Christian
Anfinsen, William H. Stein et Standford Moore qui obtiendront tous
trois le prix Nobel de Chimie en 1972 pour leurs travaux sur la
ribonucléase pancréatique. Pierre Desnuelle sera plus
particulièrement reconnu pour ses travaux sur la lipase
pancréatique et l’adaptation de la sécrétion des enzymes
pancréatiques en fonction du régime alimentaire.
Les lipases utilisées comme outils pour étudier la structure
des corps gras
La première période d’étude des lipases à Marseille sera consacrée
à leur utilisation pour élucider, et par la suite modifier, la
structure des principaux constituants des corps gras, les
triglycérides. Maurice Naudet fut le premier élève de Pierre
Desnuelle à passer une thèse de doctorat ès-Sciences physiques en
1947 sur la migration des chaînes acyles entre triglycérides. À
cette époque, on savait que les triglycérides étaient des triesters
du glycérol et d’acides gras mais on ne savait pas encore s’il
existait une distribution particulière des acides gras sur le
glycérol. Desnuelle et Naudet pensaient que les acides gras
composants les triglycérides n’étaient pas distribués de façon
aléatoire sur le squelette à trois carbones du glycérol. Si cela
était le cas, on pouvait espérer modifier la distribution de ces
acides gras et les propriétés physico-chimiques des triglycérides
par interestérification chimique ou enzymatique [1-3]. Suite à la
découverte par Bengt Borgström (Lund, Suède) et F.H. Mattson (USA)
de la spécificité de position de la lipase pancréatique pour les
fonctions ester externes du glycérol, Pierre Desnuelle et ses
collaborateurs, Pierre Savary et Bernard Entressangles, seront les
premiers avec F.H. Mattson [4] à utiliser cette spécificité de la
lipase pancréatique pour étudier la structure des triglycérides
naturels [5-8]. Ils montreront notamment que, dans les corps gras
d’origine végétale, les acides gras insaturés sont majoritaires en
position interne sn-2 alors que les acides gras saturés sont
majoritairement retrouvés sur les positions externes sn-1 et sn-3.
Dès cette époque, Pierre Desnuelle et ses collaborateurs
s’intéresseront à d’autres sources de lipases possédant diverses
spécificités [9-13]. Ils jetteront ainsi les bases des très
nombreux travaux réalisés à ce jour sur la spécificité de substrat
des lipases et leurs diverses applications dans le domaine de la
biotransformation des huiles et corps gras par transestérification
enzymatique.
Naissance de l’enzymologie en milieu hétérogène
L’enzymologie dite « interfaciale » est aujourd’hui un
champ de recherche en plein essor car de nombreux enzymes sont
impliqués dans des réactions se déroulant aux interfaces, que ce
soit dans le monde vivant (membranes cellulaires, métabolisme des
lipoprotéines) ou dans des applications industrielles (lessives et
lipolyse des taches de graisses sur les tissus, dégradation de la
cellulose). Cette enzymologie particulière est cependant largement
absente des traités d’enzymologie générale alors que le modèle
classique de Michaelis-Menten-Henri n’est plus applicable en milieu
hétérogène. Lorsqu’on étudie des enzymes, qui comme les lipases
sont parfaitement solubles dans l’eau mais agissent à l’interface
huile-eau, il faut tenir compte du partage de l’enzyme entre la
phase aqueuse et la surface des gouttelettes lipidiques. Il faut
également tenir compte de tous les phénomènes pouvant être liées à
cette transition et à la physico-chimie de l’interface :
changements conformationnels pouvant aller jusqu’à la dénaturation
des protéines lors de leur adsorption, effet de la tension
superficielle et organisation des lipides à l’interface,
accumulation à l’interface des produits de la réaction ou d’autres
molécules amphiphiles pouvant agir comme inhibiteurs ou
accélérateurs des réactions enzymatiques, etc. Sous l’impulsion de
Pierre Desnuelle, les biochimistes marseillais ont très tôt
considéré ces paramètres et jeté les bases de l’enzymologie en
milieu hétérogène.
Dans la lignée des travaux d’Holwerda et al. [14] et de
Schonheyder et Volqvartz [15-17], Sarda (figure 3) et Desnuelle ont
tout d’abord montré en 1958 que la lipase pancréatique de porc
possédait la particularité de « s’activer à l’interface »
huile-eau [18]. Alors que l’enzyme est faiblement active sur un
substrat soluble (triglycérides à courtes chaînes à faible
concentration), elle multiplie son activité de 2 à 3 ordres de
grandeur lorsque le substrat s’agrège et forme une émulsion au-delà
de sa limite de solubilité. Les lipases (triacylglycerol
hydrolases, EC 3.1.1.3) ont alors été définies comme une famille
particulière d’estérases, actives sur un substrat insoluble, les
triglycérides, et possédant la propriété cinétique d’activation
interfaciale [18]. Cette définition a depuis été revisitée, toutes
les lipases ne possédant pas forcément cette propriété [19]. Parmi
les diverses hypothèses formulées pour tenter d’expliquer
l’activation interfaciale, Desnuelle et al. ont proposé qu’un
changement conformationnel de l’enzyme se produise au contact de
l’interface huile-eau [20]. Nous verrons par la suite que les
travaux ultérieurs des cristallographes ont soutenus cette
hypothèse sans qu’aucun lien formel entre cette propriété cinétique
et des changements conformationnels observés dans le cristal ne
soit établi à ce jour. Quoi qu’il en soit le phénomène d’activation
interfaciale des lipases a été un élément extrêmement stimulant
pour la recherche et les travaux sur les lipases qui ont
suivis.
En étudiant la lipolyse d’émulsions de triglycérides de tailles
variables, Benzonana et Desnuelle montreront en 1965 que la vitesse
de la réaction d’hydrolyse des triglycérides par la lipase
pancréatique dépend, non pas de la quantité (masse) de substrat,
mais de la surface de l’émulsion disponible, et donc du degré
d’émulsification du substrat [21]. Ce fut une observation
essentielle pour la définition des paramètres importants en
enzymologie interfaciale, tels que la concentration superficielle
en substrat et la quantité de surface disponible par unité de
volume, alors que la concentration volumique en substrat et les
paramètres cinétiques de même grandeur comme la constante de
Michaelis (Km) n’ont plus de sens lorsque le substrat
est insoluble. Cette observation révéla également toute la
difficulté à étudier de tels systèmes, une concentration
superficielle étant beaucoup plus difficile à mesurer et à
contrôler que la concentration volumique d’un substrat soluble.
C’est en cherchant à maîtriser ce paramètre que Robert Verger et
Gérard De Haas (figure
3) développeront l’utilisation des films monomoléculaires
pour étudier les enzymes lipolytiques [22, 23] et élaboreront un
premier modèle cinétique dans les années 1970 [24]. L’étalement à
l’interface eau-air de films lipidiques permit d’étudier la
pénétration dans le film de lipases et de phospholipases injectées
dans la sous-phase aqueuse en mesurant l’augmentation de la
pression de surface, mais également la lipolyse intervenant à
l’interface eau-air. Pour cela, ils inventèrent en particulier la
cuve « d’ordre zéro » et le « barostat »
permettant de réaliser des expériences de lipolyse à pression de
surface et à concentration superficielle en substrat constantes
(figure 4), la
pression de surface étant utilisée comme paramètre « a
minima » pour contrôler la « qualité » de
l’interface. Le modèle cinétique Verger-De Haas est la plus simple
adaptation du modèle de Michaelis-Menten-Henri à l’hydrolyse
interfaciale de lipides à chaînes acyles moyennes, insolubles dans
l’eau mais dont les produits sont solubles. La première étape
décrit la fixation à l’interface lipide-eau d’une enzyme (E)
soluble dans l’eau, via un mécanisme d’adsorption-désorption
réversible (figure
5). Cette étape conduit l’enzyme à un état énergétique plus
favorable (E*) et elle est suivie par une réaction de
Michaelis-Menten dans un espace à deux dimensions. L’enzyme présent
à l’interface interagit avec une molécule de substrat (S) pour
former un complexe enzyme-substrat interfacial (E.S*), lequel se
décompose ensuite pour libérer des produits (P*) qui vont se
solubiliser dans la phase aqueuse. L’utilisation de glycérides à
chaînes moyennes comme substrats (trioctanoïne, dicaprine,
dilauroyl phosphatidylcholine) a permis d’associer la technique des
films monomoléculaires et ce modèle cinétique dans des conditions
aussi simples que possibles, alors que l’utilisation de lipides
naturels aux chaînes acyles longues aurait conduit à une
accumulation de produits à l’interface et à l’absence de contrôle
de cette interface. En utilisant cette approche expérimentale
simple, de nombreuses études cinétiques des phospholipases A2 et
des lipases de diverses origines ont été réalisées. Ces expériences
ont notamment montré que les enzymes lipolytiques pouvaient être
utilisés comme « sondes » pour étudier la structure des
membranes et déterminer quels paramètres physico-chimiques
pouvaient les rendre susceptibles à l’action de ces enzymes [25].
Une application fut par exemple la mise évidence d’une corrélation
entre le pouvoir hémolytique de certaines phospholipases A2 et leur
capacité à pénétrer dans un film de phospholipide à de hautes
pressions de surface mimant celles des membranes biologiques. Cette
technique permit également de démontrer sans ambiguïté le rôle de
la colipase dans l’ancrage de la lipase pancréatique aux interfaces
lorsque la pression de surface augmente et que la pénétration de
l’enzyme seul devient difficile [26]. La technique des films
monomoléculaires et le modèle cinétique de base ont été par la
suite régulièrement adaptés pour pouvoir étudier l’inhibition des
enzymes lipolytiques [27] ou utiliser des lipides à longues chaînes
grâce à des accepteurs de produits de lipolyse comme la
β-cyclodextrine [28].
Purification de la lipase pancréatique de porc et de la
colipase
Bien que diverse préparations de lipase pancréatique de porc aient
été disponibles depuis longtemps, il fallut attendre les travaux de
thèse de Robert Verger vers la fin des années 1960 pour obtenir une
préparation de lipase hautement purifiée. La principale difficulté
était alors de séparer la lipase des lipides présents dans les
extraits pancréatiques, le pancréas étant un organe naturellement
très gras. Pendant plusieurs années fut obtenue une lipase dite
« rapide », nommée ainsi car elle était éluée très
rapidement des colonnes de filtration sur gel avec une masse
moléculaire estimée très largement supérieure à sa masse réelle
(50 kDa). Il s’agissait en fait d’agrégats lipidiques formés
de façon artefactuelle lors du broyage du tissu pancréatique et
contenant la lipase pancréatique, son cofacteur la colipase, la
phospholipase A2 pancréatique et la cholestérol estérase, toutes
ces protéines ayant une affinité pour les lipides [29]. Robert
Verger introduisit une étape de délipidation précoce du tissu
pancréatique utilisant des solvants organiques. La poudre délipidée
ainsi obtenue fut ensuite utilisée pour purifier la lipase par
chromatographie [30]. Un procédé analogue de délipidation est
utilisé aujourd’hui pour produire les extraits pancréatiques de
porc destinés au traitement de l’insuffisance pancréatique.
L’interaction lipase-lipides endogènes lors de la production et de
la purification des enzymes lipolytiques est en fait un problème
d’ordre général que l’on retrouve par exemple aujourd’hui lors de
la production de lipases microbiennes [31, 32]. Ces interactions
peuvent modifier de façon non négligeable le comportement cinétique
des enzymes étudiés et conduire à des artefacts. On peut cependant
les utiliser volontairement (Molecular Bio-Imprinting) pour induire
des changements conformationnels et moduler l’activité enzymatique
des lipases [33, 34].
L’obtention d’une lipase pancréatique de plus grande pureté eut
pour conséquence indirecte l’identification de son cofacteur
spécifique, la colipase, une petite proteine de 10 kDa ne possédant
pas d’activité enzymatique intrinsèque et sécrétée par le pancréas
exocrine comme la lipase. Même si l’existence d’une colipase fut
proposée dès 1910 [35], c’est en 1971 que cette protéine sera
purifiée simultanément à Marseille dans le laboratoire de Pierre
Desnuelle [36] et à Lund dans celui du Professeur Bengt Borgström
[37]. En présence de sels biliaires, l’activité catalytique de la
lipase pancréatique est très fortement réduite car elle ne peut
plus s’adsorber à l’interface huile-eau [38]. La colipase est alors
requise pour « ancrer » le complexe lipase-colipase à
l’interface huile-eau et restaurer son activité. C’est ainsi que
fonctionne la lipase pancréatique in vivo. Ce système très
spécifique est pourtant passé inaperçu pendant plusieurs années car
la lipase pancréatique obtenue sous forme de lipase
« rapide » était soit contaminée par de la colipase, soit
étudiée dans des conditions ne nécessitant pas ce cofacteur.
Première séquence en acides aminés d’une lipase
Après l’obtention des premières séquences en acides aminés de la
phospholipase A2 pancréatique [39] et de la colipase de porc [40],
l’école marseillaise s’illustrera en 1981 par l’obtention de la
première structure primaire d’une lipase, celle de la lipase
pancréatique de porc [41]. Cette séquence en acides aminés sera
obtenue par l’équipe de Mireille Rovery (figure 3) après plusieurs
années d’un travail de bénédictin pour produire par protéolyse
limitée et séquencer des peptides issus de la lipase pancréatique.
L’obtention d’une séquence de 449 acides aminés constituait un
exploit avant que les outils de la biologie moléculaire permettant
d’obtenir la séquence d’une protéine à partir de celle de son gène
soient disponibles puis largement répandus à partir des années
1980.
Le projet européen BRIDGE-T lipase et les premières structures
3D du complexe lipase pancréatique-colipase
L’année 1990 fut un tournant dans la recherche sur les lipases avec
l’obtention des deux premières structures cristallographiques,
celles de la lipase pancréatique humaine [42] et de la lipase
fongique de Rhizomucor miehei [43]. Ces résultats furent publiés
simultanément dans la revue Nature par deux laboratoires
industriels. Chez Hoffmann-La Roche à Bâle, Fritz Winkler
s’intéressait à la structure de la lipase pancréatique en relation
avec le développement de l’inhibiteur de lipase
Orlistat® pour le traitement de l’obésité. Chez Novo
Nordisk au Danemark, l’équipe de Lars Thim s’intéressait à la
lipase de Rhizomucor miehei (Lipozyme™) pour diverses applications
industrielles et sa structure fut obtenue en collaboration avec le
laboratoire de cristallographie de Guy Dodson à l’université de
York. Ces résultats illustrèrent l’intérêt croissant de l’industrie
pour les lipases et leurs applications à partir de la fin des
années 1980. Le premier producteur mondial d’enzymes industrielles,
Novo Nordisk, introduisit en particulier la première lipase
recombinante (Lipolase®) sur le marché des détergents en
1988. Au même moment fut lancé le projet européen BRIDGE-T lipase
(1990-1994) dont le but était l’obtention d’une quinzaine de
structures de lipases d’intérêt industriel pour mieux comprendre le
mode d’action de ces enzymes. Ce projet réunissant 25 laboratoires
académiques et industriels (Novo Nordisk, Gist-Brocades, Unilever
et Plant Genetic System) visait également à stimuler un domaine
d’activité dans lequel l’Europe était leader avec environ 80 %
de la production mondiale d’enzymes industriels. La coordination du
projet BRIDGE-T Lipase fut confiée à Robert Verger qui joua un rôle
essentiel dans sa préparation grâce aux collaborations qu’il avait
nouées avec plusieurs laboratoires européens, en particulier celui
du Professeur Gérard De Haas à Utrecht. Grâce à lui, notre
laboratoire marseillais joua un rôle important dans le projet
BRIDGE-T Lipase avec la caractérisation cinétique des lipases
produites dans les différents laboratoires partenaires. Il stimula
également le développement de la cristallographie à Marseille en
apportant au jeune laboratoire de Christian Cambillau (figure 6) ses premiers
projets couronnés de succès : la structure de la cutinase de
Fusarium solani pisi obtenue par Chrislaine Martinez [44], une
première structure du complexe lipase pancréatique humaine-colipase
obtenue par Herman van Tilbeurgh [45], puis une seconde structure
du même complexe obtenue en présence de phospholipides et de sels
biliaires, dans laquelle la lipase pancréatique fut observée pour
la première fois dans sa conformation « ouverte » et
fonctionnelle [46]. Ces trois résultats importants furent publiés
dans la revue Nature et ils marquèrent le début d’une production
scientifique remarquable dans le domaine de la cristallographie. Le
laboratoire marseillais Architecture et fonction des macromolécules
biologiques est aujourd’hui l’un des meilleurs laboratoires de
cristallographie au niveau mondial.
Cette association locale avec des cristallographes permit aux
biochimistes marseillais de rester à la pointe de la recherche sur
les lipases alors que la première structure de la lipase
pancréatique, obtenue par les chercheurs d’Hoffmann-La Roche, leur
avait échappé. Les structures obtenues par Herman van Tilbeurgh
(figure 3)
apportèrent des informations essentielles sur les relations
structure-fonction du complexe lipase-colipase (figure 7).
La lipase gastrique
Dans les années 1980, l’équipe de Robert Verger s’intéressa
également à une autre lipase importante pour la digestion des
lipides alimentaires, la lipase préduodénale. L’origine linguale de
cette lipase chez l’homme a été postulée pendant de nombreuses
années, principalement par le groupe de Margit Hamosh (Georgetown
University, USA). L’existence de cette lipase linguale ne reposait
en fait que sur de faibles arguments expérimentaux [47] et sur
l’extrapolation de résultats obtenus chez le rat, où la lipase
préduodénale, la première à avoir été purifiée et caractérisée, est
exclusivement linguale [48-50]. Dans notre laboratoire, nous
n’avons jamais pu mettre en évidence, chez l’homme, une activité
lipolytique significative dans la salive ou à partir de biopsies
prélevées dans la partie postérieure de la langue, au niveau des
glandes de von Ebner où la lipase aurait dû être localisée. Lors du
clonage de la lipase préduodénale humaine en collaboration avec la
société CellTech (UK) [51], les essais pour détecter l’ARN messager
codant pour cette lipase au niveau lingual se sont avérés
infructueux. Cet ARN messager n’a pu être trouvé qu’au niveau de
l’estomac. C’est Hervé Moreau qui réalisa un prélèvement
systématique de biopsies tout au long du tractus digestif humain à
partir de dons d’organes et démontra que l’activité lipolytique
correspondant à la lipase préduodénale était localisée
exclusivement au niveau de la muqueuse fundique de l’estomac [52].
Par une étude d’immunocytolocalisation, il montra ensuite que la
lipase gastrique était présente dans les cellules principales des
glandes fundiques, colocalisée avec le pepsinogène [53].
Au-delà des difficultés à reconnaître l’origine de la lipase
préduodénale, il était aussi considéré que celle-ci était
spécifique des acides gras à chaînes courtes et moyennes [54] et
que, par conséquent, son rôle physiologique ne devait être
important que chez le nouveau-né pour la digestion des
triglycérides du lait [47]. Youssef Gargouri et Robert Verger
montrèrent définitivement en 1986 que la lipase gastrique humaine
pouvait hydrolyser de façon comparable les triglycérides à chaînes
courtes et ceux à chaînes longues [55]. Ewa Rogalska montra par la
suite que la spécificité apparente de la lipase gastrique pour les
acides gras à chaînes courtes résulte en fait de la
stéréosélectivité de cette enzyme pour la position sn-3 des
triglycérides où les acides gras à chaînes courtes et moyennes du
lait sont localisés préférentiellement [56].
Il restait à déterminer la contribution de la lipase gastrique à
la lipolyse des triglycérides alimentaires chez l’homme. J’ai
obtenu en 1988 un contrat CIFRE avec les Laboratoires Jouveinal
pour préparer ma thèse sur ce sujet dans le laboratoire de Robert
Verger. On souhaitait déjà à cette époque utiliser la lipase
gastrique, stable et active en milieu acide, pour améliorer la
digestion des graisses chez les insuffisants pancréatiques. Le rôle
physiologique exact de la lipase gastrique chez le sujet sain était
cependant inconnu et l’on ne disposait pas de données quantitatives
sur les sécrétions des lipases digestives en général et sur les
niveaux de lipolyse respectifs dans l’estomac et l’intestin grêle.
Seuls des débits ou concentrations estimés en unités enzymatiques
étaient disponibles dans la littérature pour la lipase pancréatique
mais la disparité des résultats obtenus dans divers laboratoires
était très grande. Nous nous sommes alors associés à d’autres
spécialistes marseillais, ceux du pancréas issus de l’école du
Professeur Henri Sarles, pour réaliser des études in vivo, tout
d’abord chez le chien [57, 58], puis chez l’homme [59]. Grâce au
Professeur René Laugier à l’Hôpital St Marguerite à Marseille, nous
avons pu associer les techniques d’investigation des fonctions
digestives in vivo (figure 8) aux tests
enzymatiques spécifiques permettant de discriminer les activités
des lipases gastrique et pancréatique et à l’analyse quantitative
des produits de lipolyse présents dans les échantillons recueillis
dans l’estomac et l’intestin grêle. Nous avons pu ainsi établir les
contributions respectives des lipases gastrique et pancréatique à
la lipolyse gastro-intestinale d’un repas test. La lipase gastrique
permet la libération d’une chaîne acyle sur les quatre qui sont
libérées lors de la conversion de 2 molécules de triglycérides en
acides gras et 2 molécules de monoglycérides, les produits de
lipolyse absorbés au niveau intestinal [59]. Grâce à ces travaux et
aux nombreuses études cliniques qui ont suivies, nous savons que la
sécrétion de la lipase pancréatique humaine (80 à 400 mg par
repas) est pondéralement bien plus importante que celle de la
lipase gastrique (10 à 25 mg par repas) chez le sujet sain. La
lipolyse dans l’estomac due à la seule lipase gastrique est
cependant significative : de 10 % avec un repas mixte
solide-liquide jusqu’à 25 % avec un repas test liquide
contenant des triglycérides finement émulsifiés [60, 61].
Plus récemment, nous avons montré que la sécrétion de la lipase
gastrique est augmentée de 3-4 fois chez l’insuffisant pancréatique
sévère ne sécrétant pratiquement plus de lipase pancréatique. Cette
compensation n’est que partielle mais elle permet la digestion
d’environ 30 % des triglycérides ingérés, ce qui démontre une
fois de plus que la contribution de la lipase gastrique n’est pas
négligeable [62].
Parallèlement à ces études physiologiques, la caractérisation
structurale de la lipase gastrique s’est poursuivie avec
l’obtention des structures 3D des lipases gastriques humaine et
canine [63, 64]. Ces structures ont montré l’existence d’un volet
contrôlant l’accès au site actif comme dans la lipase pancréatique
(figure 9).
Applications médicales des lipases et de leurs inhibiteurs
Cette association unique entre des biochimistes et des médecins
gastroentérologues a été très rapidement reconnue par l’industrie
pharmaceutique (contrats avec les sociétés Roche, Solvay
Pharmaceuticals, Sanofi-Aventis, Novo Nordisk, Meristem
Therapeutics, Laboratoires Jouveinal, Takeda, Mayoly Spindler).
Elle a permis de développer des outils d’investigation de la
lipolyse in vivo et d’appliquer ces outils à l’étude d’inhibiteurs
de lipases pour le traitement de l’obésité et à l’enzymothérapie de
substitution pour le traitement de l’insuffisance pancréatique.
Nous avons contribué en particulier à l’étude de la
tétrahydrolipstatine (THL ou Orlistat®), le seul
inhibiteur de lipase aujourd’hui disponible sur le marché
(Xenical®). En inhibant les lipases digestives humaines
(HGL et HPL), on peut diminuer l’absorption intestinale des
produits de lipolyse des graisses alimentaires, et donc l’apport
calorique. Les propriétés physico-chimiques et inhibitrices de
l’Orlistat® (figure 10) ont été
largement étudiées à Marseille [65-72]. Nous avons également
réalisé la première étude clinique permettant de décrire
quantitativement l’inhibition in vivo des lipases gastrique et
pancréatique par l’Orlistat® au cours de repas tests
chez des volontaires sains [73]. L’Orlistat® est
aujourd’hui le premier médicament anti-obésité avec un marché
annuel de 350 millions de dollars US.
L’inhibition de la lipase hormono-sensible (HSL), qui est
également une nouvelle approche thérapeutique potentielle, mais
cette fois dans le domaine du diabète de type II non
insulino-dépendant. En diminuant l’activité de la HSL par des
inhibiteurs spécifiques, il est possible de réduire le taux
d’acides gras libres circulant et agir alors indirectement sur le
métabolisme du glucose. Des inhibiteurs spécifiques de la famille
de la HSL ont été synthétisés par Aventis et étudiées dans notre
laboratoire [74, 75].
Le domaine de l’enzymothérapie de substitution vise au contraire
à restaurer une activité lipolytique dans le tractus digestif pour
le traitement de l’insuffisance pancréatique, particulièrement
sévère chez des patients atteints de pancréatite chronique et de
mucoviscidose. Les premières études réalisées chez le chien pour
déterminer la contribution de la lipase gastrique [57, 58] nous
avaient permis de purifier et de caractériser la DGL native. Il
s’est avéré que cette enzyme était, de toutes les lipases connues,
la plus active à pH acide sur les triglycérides naturels [76] et
elle semblait donc bien adaptée à une action dans les conditions
acides du tractus digestif des insuffisants pancréatiques [77]. Le
projet de produire une lipase gastrique de chien recombinante
(rDGL) est né de ces études et la société Meristem Therapeutics a
utilisé son savoir-faire dans le domaine des plantes transgénique
pour introduire son gène dans le maïs [78]. En 2003, la rDGL
produite dans le maïs transgénique a obtenu le statut de médicament
orphelin de l’Agence européenne du médicament (EMEA) pour le
traitement de la mucoviscidose.
La recherche actuelle sur les lipases à Marseille
L’étude des enzymes lipolytiques a permis le développement d’une
enzymologie « interfaciale » qui, loin d’être une
curiosité, concerne de très nombreux enzymes à l’intérieur comme à
l’extérieur de la cellule vivante. À Marseille, nous poursuivons le
développement de techniques expérimentales et de modèles cinétiques
pour étudier l’adsorption de ces enzymes sur leur substrat
insoluble, les changements conformationnels associés à cette
adsorption ou la précédant, et les facteurs influençant la
stabilité et l’activité des enzymes aux interfaces. L’utilisation
de la technique des films monomoléculaires reste d’actualité mais
nous utilisons également diverses techniques spectroscopiques qui
viennent compléter les données structurales obtenues par
diffraction des rayons X. Parmi les résultats marquants obtenus ces
dernières années, il y a la compréhension de l’activité catalytique
optimale de la lipase gastrique à pH acide [79], et l’utilisation
du marquage de spin dirigé, couplé à la spectroscopie de résonance
paramagnétique électronique (RPE) pour étudier les changements
conformationnels de la lipase pancréatique [80].
La lipase gastrique est stable à pH acide et la rDGL possède une
activité optimale à pH 4 sur les triglycérides à chaînes longues
[76]. Pendant plusieurs années, nous avons essayé de comprendre
cette activité au niveau moléculaire, notamment par l’obtention des
structures 3D des lipases gastriques humaine et canine,
respectivement dans leurs conformations ouverte et fermée [63, 64].
Ces structures ont montré la présence d’une triade catalytique
Ser-His-Asp comparable à celle observée dans d’autres lipases
agissant de façon optimale à pH neutre ou plus alcalin, et aucun
élément structural n’a permis d’expliquer un éventuel déplacement
du pKa apparent de l’histidine vers des valeurs inférieures à 6.
Ces observations structurales ont été confirmées par le fait que la
rDGL pouvait agir sur une solution de butyrate de vinyle avec une
activité optimale à pH 7. Dans certaines conditions (substrat et
enzyme soluble), la lipase gastrique peut donc hydrolyser les
liaisons esters comme d’autres hydrolases à serine classiques. Le
butyrate de vinyle étant partiellement soluble dans l’eau, nous
avons également réalisé des expériences d’hydrolyse par la rDGL
au-delà de sa limite de solubilité. Un déplacement de l’activité
optimale vers les pH acides a alors été observé, suggérant que
l’interaction de la lipase avec un substrat insoluble était elle
aussi dépendante du pH. Des expériences réalisées avec une émulsion
de triglycérides à longues chaînes ont alors montré que la rDGL se
fixe préférentiellement à l’interface huile-eau à pH acide. Pour
étudier l’effet du pH sur l’étape d’adsorption de la rDGL à
l’interface indépendamment de l’hydrolyse du substrat, nous avons
utilisé des surfaces solides hydrophobes comme interfaces modèles
et nous avons mesuré l’adsorption de la rDGL par spectroscopie de
fluorescence de surface (total internal reflection fluorescence ;
TIRF) ou à l’aide d’une microbalance à quartz (QCM). Les deux
approches ont montré une adsorption réversible et pH-dépendante de
la rDGL en présence de sels biliaires, avec un optimum à pH 5
(Kd = 6,5 nM). Ces résultats ont suggéré que l’activité
optimale de la lipase gastrique à pH acide était seulement
« apparente » et résultait du fait que l’étape
d’adsorption pH-dépendante de la lipase à l’interface huile-eau est
l’étape limitante dans le processus global d’hydrolyse d’un
substrat insoluble [79]. Cette particularité cinétique associée à
l’action d’un enzyme soluble sur un substrat insoluble devra
désormais être prise en considération lorsqu’il s’agira d’étudier
l’effet du pH sur d’autres enzymes agissant aux interfaces.
La spectroscopie RPE a été utilisée pour étudier les changements
conformationnels de la lipase pancréatique humaine (HPL) [80]. Les
conformations fermées (site actif inaccessible) et ouverte (site
actif accessible) du volet de la HPL ont été associées à l’état
initial et à l’état final du processus d’activation de la lipase
(supposé se produire à l’interface), mais aucune relation directe
entre ces observations structurales et le comportement cinétique de
la HPL n’a pu être établie jusqu’à présent. De plus, plusieurs
études ont suggéré que la lipase pouvait être déjà
« activée » (ouverture du volet) en solution en présence
de détergents et de colipase [81, 82]. Les données structurales sur
les différentes conformations du volet ayant été obtenues avec des
lipases cristallisées, il n’était en fait pas évident d’associer
ces données structurales avec des données cinétiques obtenues en
phase liquide. La spectroscopie RPE nous a permis d’étudier le
changement conformationnel du volet de la HPL en solution et les
contributions respectives des partenaires physiologiques de la
lipase que sont la colipase et les sels biliaires. Une sonde
paramagnétique (MTSL) a été introduite au niveau du volet grâce à
la mutation D249C permettant le greffage covalent de la sonde et de
la cystéine libre. Deux composants distincts du spectre RPE de la
sonde ont pu être identifiés et attribués sans ambiguïté aux
conformations fermée (mouvement rapide du radical) et ouverte
(mouvement lent du radical) du volet de la HPL, notamment grâce à
des expériences réalisées avec l’inhibiteur E600. Nous avons montré
que la conformation ouverte du volet peut être induite en solution
en présence d’une concentration supramicellaire en sels biliaires,
et que ce phénomène est réversible. La colipase seule n’induit pas
l’ouverture du volet, mais en présence de sels biliaires, elle
permet d’obtenir une proportion de forme ouverte plus importante
qu’en présence des sels biliaires seulement. Nous poursuivons
actuellement ces études en introduisant d’autres facteurs dans le
système expérimental : présence de lipides, variation du pH…
Grâce à cette technique, nous avons aujourd’hui des informations
structurales sur l’activation de la lipase obtenues dans des
conditions proches de celles mises en œuvre lors des études
cinétiques de cet enzyme. Nous espérons établir des relations
structure-fonction plus précises de la lipase pancréatique et des
lipases en général.
Parallèlement à ces travaux sur la lipase pancréatique dite
« classique », nous nous intéressons depuis plusieurs
années à de nouvelles protéines apparentées à la lipase
pancréatique, les PLRP (pancreatic lipase-related proteins). Trois
gènes distincts codant pour des lipases pancréatiques ou protéines
apparentées sont en fait exprimés dans le pancréas exocrine humain.
L’un de ces gènes code pour la lipase pancréatique classique (HPL),
qui possède une activité très sélective vis-à-vis des triglycérides
et joue un rôle prépondérant dans la digestion des lipides
alimentaires. Nous avons montré la présence des deux autres
protéines (HPLRP1 et HPLRP2) dans la sécrétion pancréatique
exocrine [83, 84]. Jusqu’à présent, aucune activité enzymatique n’a
pu être décelée chez la HPLRP1 ainsi que chez les PLRP1 de diverses
espèces et leur rôle physiologique est encore inconnu. Nous avons
obtenu la structure 3D de la PLRP1 du chien et montré que son
absence d’activité était due à un encombrement stérique au niveau
du site actif [85].
Les lipases pancréatiques apparentées de type 2 peuvent
hydrolyser in vitro les triglycérides, les phospholipides avec une
activité phospholipase A1 et les galactolipides [86, 87]. Nous
avons d’abord caractérisé les PLRP2 du cobaye et du ragondin, deux
espèces chez qui il n’existe pas de phospholipase A2 pancréatique
mais où le pancréas produit la PLRP2 en grande quantité et à des
niveaux équivalents à ceux de la lipase pancréatique classique.
Chez ces deux espèces, et chez les herbivores en général [88], il
semble que les phospholipides et les galactolipides alimentaires
soient les substrats physiologiques de la PLRP2. Chez d’autres
espèces, la situation est beaucoup plus confuse et il est difficile
de proposer un rôle physiologique unique pour les PLRP2.
Contrairement à la lipase pancréatique classique, les PLRP2 peuvent
être exprimées dans divers tissus ou types cellulaires :
entérocytes et cellules acineuses du pancréas chez le rat,
lymphocytes T chez la souris, production par la glande
bulbo-urétrale et sécrétion dans le plasma séminal chez le bouc.
Chez la souris en particulier, la PLRP2 contribue à la cytotoxicité
des lymphocytes T et semble donc impliquée dans la réponse
immunitaire [89]. La PLRP2 humaine est présente dans la sécrétion
du pancréas exocrine où elle est majoritairement responsable de
l’activité galactolipase [84]. Son activité lipasique étant inhibée
par les sels biliaires et faiblement restaurée par la colipase, et
son activité phospholipase A1 étant faible, la PLRP2 humaine ne
joue probablement pas un rôle crucial dans la digestion des
triglycérides et des phospholipides alimentaires. Son principal
rôle physiologique semble donc être l’hydrolyse des galactolipides,
les principaux lipides présents dans les légumes et les fruits que
nous consommons chaque jour [90]. La découverte chez l’homme d’un
enzyme permettant la digestion des galactolipides a remis en cause
certaines idées reçues sur la digestion. Les galactolipides étant
les principaux lipides membranaires chez les plantes, ce sont aussi
les lipides les plus abondants sur la terre. Les galactolipases
pourraient se révéler intéressantes pour transformer et valoriser
ces lipides.
Un nouvel axe de recherche concerne les lipases microbiennes et
l’association de ces enzymes avec des micro-organismes pathogènes.
La jeune équipe Lipolyse et pathogénie bactérienne dirigée par
Stéphane Canaan étudie les lipases de Mycobacterium tuberculosis
par une approche de génomique structurale et fonctionnelle [91,
92]. Les enzymes lipolytiques chez les mycobactéries ont été peu
étudiés bien que les lipides représentent 30 à 40 % du poids
sec des mycobactéries et que 6 % de leur génome code pour des
protéines impliquées dans le métabolisme des lipides. Les enzymes
lipolytiques jouent probablement un rôle dans la mobilisation
énergétique en permettant l’utilisation des acides gras comme
source de carbone, mais également dans la virulence (hydrolyse des
phospholipides des cellules hôtes). Ces enzymes sont donc
potentiellement des cibles thérapeutiques pour le développement de
nouveaux agents anti-tuberculeux. L’expérience acquise à Marseille
dans le domaine des inhibiteurs de lipase sera certainement un
atout pour relever ce défi, le traitement de la tuberculose étant
toujours une priorité internationale avec la recrudescence de la
maladie associée à l’épidémie de sida dans le monde.
Enfin, un dernier axe de recherche concerne l’action des enzymes
lipolytiques du tractus digestif humain sur les « véhicules
lipidiques » (excipients) utilisés dans les formes galéniques
permettant l’administration par voie orale de certains médicaments
hydrophobes (cyclosporine, inhibiteur DMP 323 de la protéase du
HIV, α-tocophérol, nifédipine, 17-β estradiol, ontazolast,
propranolol, piroxicam, fénofibrate, ibuprofène). Ces véhicules
lipidiques se présentent sous diverses formes (micro-émulsions,
micelles, particules solides) et contiennent divers composés
amphiphiles (acylglycérols, esters de PEG) pouvant être des
substrats pour les lipases [93]. Cette lipolyse a été peu étudiée
jusqu’à présent mais elle intéresse de plus en plus l’industrie
pharmaceutique car la lipolyse gastro-intestinale et la digestion
des lipides alimentaires influencent certainement la
biodisponibilité des molécules hydrophobes administrées par voie
orale à l’aide d’excipients lipidiques. Jusqu’à présent, seule une
approche empirique était utilisée pour concevoir ces formes
galéniques. Aujourd’hui, l’industrie pharmaceutique recherche une
approche plus rationnelle basée sur des tests préliminaires in
vitro et une bonne corrélation in vitro-in vivo. Il faut savoir
qu’une grande majorité (environ 70 %) des nouvelles molécules
issues de la recherche pharmaceutique sont hydrophobes et
nécessitent l’emploi de tels « véhicules » pour être
solubilisées ou dispersées. L’administration par voie orale étant
une cible prioritaire pour l’industrie pharmaceutique, la galénique
des molécules hydrophobes revêt une importance stratégique et
conduira certainement à de nombreuses recherches fondamentales dans
les années à venir. Les lipases ont encore une place ce choix dans
cette recherche future.
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