Développements analytiques pour l’évaluation de la teneur en phytostérols des aliments : approche inter-laboratoires

ARTICLE

Auteur(s) : Max Feinberg

Institut National de la Recherche Agronomique. Met@risk, 16 rue Claude Bernard. 75231 Paris cedex 05

Introduction

Les analyses circulaires ou inter-laboratoires ont pour objectif de caractériser plusieurs critères de validation des méthodes d’analyse, comme la répétabilité et la reproductibilité qui sont des critères de fidélité, mais aussi d’une certaine façon la justesse en permettant de définir une valeur commune de référence pour l’échantillon analysé. Par extension, on parle parfois de « validation » inter-laboratoires mais il s’agit plutôt d’une caractérisation des performances qui se révèle utile pour une validation véritable. Une série de normes internationales identifiées sous le numéro ISO 5725 ont été développées afin de conduire de façon harmonisée les analyses inter-laboratoires [6]. Un point important est le nombre de laboratoires qui participent à l’étude ; il doit être au moins de 8 afin que les résultats trouvés aient un poids normatif. Dans le contexte des travaux présentés ici, le nombre de laboratoires est de 4. Il faut donc considérer ces résultats comme indicatifs et ne pas les prendre au pied de la lettre. Il est ainsi évident que les valeurs de répétabilité et de reproductibilité auront tendance à être surestimées lorsque le nombre de laboratoires est trop faible, comme c’est le cas ici. Cependant, étant donné la rareté des données disponibles sur la fidélité et la justesse des méthodes d’analyse des phytostérols, cette étude est une contribution intéressante.

C’est aussi pour cette raison que nous avons essayé de modéliser les variations de la fidélité des méthodes étudiées en fonction de la concentration. Cette modélisation a été faite en s’appuyant sur les travaux bien connus de Horwitz [7, 8]. On peut ainsi proposer une fonction d’incertitude qui indique assez clairement le niveau de confiance qu’on peut attribuer aux mesures de phytostérols et qui peut être utilisée pour estimer l’incertitude des apports nutritionnels.

Matériels et méthodes

Échantillons et matériels

Grâce à une étape de concertation préalable, les 4 laboratoires qui ont participé à l’étude ont pu s’entraîner à appliquer les méthodes sélectionnées de la façon la plus similaire possible. Les caractéristiques techniques des équipements analytiques employés sont résumées au tableau 2.

Tableau 1 Liste des échantillons utilisés pour l’analyse circulaire.

Méthodes

La fraction correspondant aux phytostérols est silylée puis analysée par chromatographie en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme (CPG-FID). Les détails de ce mode opératoire sont les suivants.

Étape 1. Extraction de la matière grasse (sauf pour les huiles). La prise d’essai d’environ 2,5 g, pesée exactement, subit une hydrolyse acide en étant placée dans un ballon de 250 mL avec 100 mL d’acide chlorhydrique 3M puis chauffée au reflux pendant 1 h. Au mélange refroidi, on ajoute 2,5 g de silice. La suspension est filtrée sur papier et le résidu solide est lavé à l’eau distillée jusqu’à neutralité des eaux de lavage, égoutté environ 2 h puis desséché à 105 °C pendant 90 minutes. L’extraction proprement dite se fait en mettant le résidu et le papier filtre dans une cartouche de Soxhlet obturée par de la laine de verre. Le Soxhlet est mis sur un ballon taré contenant 200 mL d’éther de pétrole et chauffé 6 h au reflux. L’extrait est évaporé sous vide et déposé dans un dessiccateur pendant 2 h avant d’être pesé. La quantité de matière grasse extraite est déterminée par la différence des pesées.

Étape 2. Extraction et purification des stérols. La matière grasse extraite subit une saponification par ajout de 5 mL de potasse alcoolique 0,5 M en présence de 500 μg de bétuline ou épicoprostanol (étalon interne). Cette solution est maintenue au reflux pendant 15 minutes par un chauffage modéré. En fin de saponification, 5 mL d’éthanol sont ajoutés. Pour les huiles, la saponification est réalisée directement sur une prise d’essai de 0,25 g en présence de 1 mg de bétuline.

Une prise d’essai de 5 mL d’insaponifiable est purifiée par passage sur une colonne remplie de 10 g d’alumine (granulométrie 63-200 μm) activée par 20 mL d’éthanol à 95 %. Le rinçage est effectué par 5 mL d’éthanol puis 30 mL d’éther éthylique. La prise d’essai et les solvants de rinçage sont récupérés puis évaporés dans un évaporateur rotatif. Le résidu sec est rincé 4 à 5 fois par 0,2 mL d’éther éthylique puis transféré dans un flacon à vis.

Étape 3. Isolement stérols. Il peut se faire par chromatographie sur couche mince (CCM) selon la norme ISO 12228. La solution de stérols extraits est déposée sur une plaque CCM recouverte de silice. L’élution est réalisée dans une cuve contenant 100 mL d’un mélange hexane/éther éthylique (1:1 v/v) jusqu’à ce que le solvant atteigne le bord supérieur de la plaque. Après évaporation du solvant, du méthanol a été pulvérisé sur la plaque. La zone correspondant aux phytostérols, de couleur blanche et nettement visible est récupérée et transférée dans un tube à essai. L’extraction des phytostérols est obtenue avec 0,5 mL d’éthanol puis 3 fois 5 mL d’éther éthylique. Le solvant et la silice sont à chaque fois séparés par centrifugation. L’extrait est évaporé puis repris dans de l’éther.

Mais on peut aussi utiliser une extraction sur phase solide (SPE). La quantité maximale de stérols qui peut être déposée sur la colonne SPE (Chromabond SiOH 3 mL 500 mg- Macherey-Nagel) et le volume d’éluant à utiliser ont été optimisés par un plan expérimental et fixés respectivement à 1 mg et 8 mL. La colonne d’extraction est préalablement conditionnée par 5 mL de cyclohexane. L’élution est réalisée par un mélange cyclohexane/éther éthylique (9:1, v/v) sous vide. La fraction récupérée est évaporée sous azote.

Étape 4. Quelle que soit la méthode d’extraction, 100 μL ou 200 μL d’un mélange de n-méthyl-N(triméthylsilyl)-heptafluorobutyramide et de 1-méthyl imidazole (20 :1 v/v) sont été ajoutés à l’extrait sec pour sylilation dans un flacon bouché, chauffé à 105 °C pendant 15 minutes. Le mélange refroidi est dissous dans 1 mL d’hexane avant. Les chromatographes utilisés par les participants sont tous équipés d’un détecteur FID et d’une colonne capillaire peu polaire (biphényl 5 %-diméthyl 95 % polysiloxane). Le volume d’injection est de 1 μL. Les conditions chromatographiques optimisées sont une température de l’injecteur de 250 °C, et du détecteur de 320 °C. Le programme de température de la colonne est de 80 °C, 10 °C/minute jusqu’à 280 °C, de 280 °C à 308 °C à 0,5 °C/minute, puis de 308 °C à 320 °C à 2 °C/minute. Enfin la colonne était maintenue à 320 °C pendant 3 minutes. Le gaz vecteur varie selon les indications du tableau 2.

Quantification

Une méthode d’étalonnage interne a été utilisée pour déterminer la teneur en stérol individuel (T_si) et en stérols totaux (T_st). Ces teneurs, exprimées en mg/100 g, sont calculées comme suit :

Où les notations représentent :

En fonction des matrices et des laboratoires, jusqu’à 15 phytostérols différents ont pu être quantifiés. La somme des stérols totaux a été ajoutée à la liste. Le tableau 3 présente ces divers analytes et les abréviations utilisées dans le reste du texte.

Tableau 3 Liste des analytes et de leurs abréviations.

Résultats

Estimation de la fidélité (reproductibilité)

Les écarts-types de répétabilité et reproductibilité ont été calculés selon la norme ISO 5725 [6]. Dans le tableau 5, la colonne « Nombre » représente le nombre de répétitions ayant servi aux calculs. La colonne « R de Horwitz » contient ce qu’on peut appeler la valeur théorique de l’écart-type de reproductibilité, tel que défini par l’équation de Horwitz, où M représente la teneur de l’échantillon et qui vaut :

Ce critère est largement accepté pour juger de la qualité d’une reproductibilité. Le rapport de Horwitz est obtenu en divisant la valeur observée de la reproductibilité par la valeur théorique R Horwitz. On estime que ce rapport doit être inférieur à 2,0, ce qui n’est pas souvent le cas pour cette étude. Mais le nombre de laboratoires étant faible (normalement il faut 8 laboratoires au moins), cette appréciation défavorable doit être relativisée. Plutôt que de porter un jugement de valeur, il vaut mieux prendre ces valeurs pour ce qu’elles sont et comme des indications de l’état de l’art dans le domaine de l’analyse des phytostérols.

Un mode classique de représentation d’une analyse inter-laboratoires consiste à porter sur un diagramme l’écart-type de reproductibilité s_R et la concentration moyenne M. La figure 1 illustre comment ces deux statistiques sont liées.

Si on prend soin de représenter les 2 axes en échelle logarithmique, il apparaît clairement que s_R et M sont liés par une fonction puissance du type :

Bien qu’elle indique que les performances de la méthode pourraient être améliorées, cette équation est malgré tout assez proche de celle de Horwitz. Surtout, elle indique que l’analyse s’est effectuée dans de bonnes conditions et elle fournit une base pour calculer la reproductibilité quelle que soit la concentration. On verra comment s’en servir pour calculer l’incertitude des mesures.

Tableau 4 Teneurs moyennes en fonction de la matrice et de la méthode.

Comparaison CCM-SPE

La figure 2 illustre graphiquement ces résultats. Pour tenir compte du fait que les deux méthodes sont entachées d’une erreur aléatoire, on a reporté sur le graphique l’erreur-type calculée pour chaque méthode. Cette statistique intègre le nombre de mesures pour chaque moyenne. On observe un assez bon alignement des points avec quelques données qui s’éloignent.

Dans ce cas, on ne peut pas utiliser la méthode des moindres carrés pour calculer la relation fonctionnelle entre les 2 méthodes car il n’y a pas de variable explicative. Si on applique une méthode de régression orthogonale en tenant compte du rapport des variances des 2 méthodes, on obtient une pente qui varie entre 1,09 et 1,14 selon le rapport de variances choisi (r = 0,954). Le calcul des intervalles de confiance de ces pentes montre que la valeur 1,0 est toujours comprise. On peut alors conclure à l’équivalence des 2 méthodes de purification même si ces résultats font penser que la SPE donne des valeurs 10 % plus élevées.

Cette équivalence est aussi confirmée si on calcule l’écart-type de reproductibilité des résultats CCM seuls et si on le représente comme précédemment en fonction de la moyenne (figure 3).

La nouvelle équation obtenue est :

Elle est très proche de l’équation (4) qui représente tous les méthodes confondues. Du fait du déséquilibre de certains plans d’essai, il n’était pas possible de calculer la même équation pour les résultats SPE seuls.

Estimation de l’incertitude élargie

On peut ainsi retenir un certain nombre de valeurs arrondies pour des teneurs exprimées en mg/100 g qui se situent :

Conclusion

Les enquêtes effectuées sur des aliments consommés et les tables de composition qui ont été publiées [10] indiquent que les teneurs rencontrées se situent dans le domaine où cette étude a été réalisée. Par conséquent, les valeurs d’incertitude calculées au moyen des données collectées dans cette étude sont tout à fait applicables. Il serait donc valable d’en tenir compte lors des évaluations d’apport qui peuvent être calculées à l’aide des enquêtes de consommation. Une évaluation réaliste du statut nutritionnel des phytostérols, par exemple de la population française, nécessite donc encore un effort sur le plan analytique et une certaine prudence doit être de mise dans les recommandations ou allégations nutritionnelles. Quand on parle d’effort analytique, il s’agit toujours d’un coût et il n’est pas toujours facile de mobiliser les moyens nécessaires. Cette étude financée par une subvention du ministère de l’Agriculture, malgré ses limites, doit être soulignée comme une contribution fructueuse pour la connaissance du statut nutritionnel des phytostérols.

Remerciements

Références

2 International Union of Pure Applied Chemistry. Method 2.403. In : Paquot C, Hautfenne A, eds. Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives, 7th ed. Oxford, UK : Blackwell Scientific Publication, 1987.

3 ISO 12228. Determination of individual and total sterols. Geneva, Switzerland : International Organisation for Standardization, 1999.

4 AOCS. Official Method Ch 6-91. Olive Oil, Sterol Fraction by TLC and Capillary GLC. USA : American Oil Chemists’ Society, 1997.

5 Lagarda MJ, Garcia-Llatas G, Farré R. Analysis of phytosterols in foods : Review. J Pharm Biomed Anal 2006 ; 41 : 1486-96.

6 Iso 5725. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2 : Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. Geneva, Switzerland : International Organisation for Standardization, 1994.

7 Horwitz W. Harmonized protocol for the design and interpretation of collaborative studies. TrAC Trends Anal Chem 1988 ; 7(4) : 118-20.

8 Boyer KW, Horwitz W, Albert R. Interlaboratory Variability in Trace Element. Analysis Anal Chem 1985 ; 57(2) : 454-9.

9 ISO/TS 21748. Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation. Geneva, Switzerland : International Organisation for Standardization, 2004.

10 Normén L, Bryngelsson S, Johnsson M, et al. The phytosterol content of some cereal foods commonly consumed in Sweden and in the Netherlands. J Food Comp Anal 2002 ; 15 : 693-704.