Effets des chlorophylles, du bêtacarotène, de l’alphatocophérol, du tyrosol et de leurs interactions sur la stabilité oxydative de l’huile d’olive tunisienne

ARTICLE

Auteur(s) : Imène Ben Tekaya¹, Mnasser Hassouna²

¹Institut National Agronomique de Tunisie (INAT), 43, Avenue Charles Nicolle 1082 Tunis Mahrajène – Tunisie
²École Supérieure des Industries Alimentaires de Tunis (ESIAT), 58, Avenue Alain Savary 1003 El Khadra Tunis, Tunisie

Article reçu le 9 Decembre 2005, accepté le 6 Decembre 2006

Introduction

Les chlorophylles a et b et leurs produits immédiats de dégradation, phéophytines a et b, sont des photosensibilisateurs. En présence de lumière, ces pigments passent de leur état singulet fondamental à un état singulet excité puis à un état triplet excité métastable. Les pigments ont alors tendance à revenir à l’état singulet fondamental en transformant l’oxygène atmosphérique (³O₂) en oxygène singulet très réactif (¹O₂). Ce dernier réagit directement sur les acides gras insaturés de l’huile en donnant des hydroperoxydes très instables qui peuvent se décomposer pour donner des composés volatils à faible poids moléculaire qui sont à l’origine du rancissement de l’huile d’olive vierge. En revanche, le bêtacarotène agit comme protecteur en désactivant l’oxygène singulet produit par les chlorophylles [18]. Il est suggéré, en outre, que le bêtacarotène aurait pour rôle de filtrer les longueurs d’onde actives des radiations lumineuses en protégeant ainsi l’huile contre l’activation de l’oxygène par la lumière [19]. Kiritsakis et Osman [10] ont montré que l’effet du bêtacarotène diminue progressivement au cours de l’exposition de l’huile à la lumière. Les pigments caroténoïdes sont facilement dégradés en présence de la lumière et de températures élevées [20, 21]. Les travaux de Steenson et Min [22] effectués sur l’huile de soja ont montré que les produits de dégradation thermique du bêtacarotène agissent comme prooxydants à l’obscurité alors qu’ils n’ont pas d’effet significatif à la lumière. Peu d’études, à notre connaissance, ont été effectuées sur le rôle joué par le bêtacarotène sur la stabilité oxydative de l’huile d’olive conservée à l’obscurité.

Outre le bêtacarotène, l’alphatocophérol, qui est le tocophérol prédominant dans l’huile d’olive (90-100 %), montre un effet inhibiteur de l’auto- et la photo-oxydation, aussi bien des systèmes modèles que de l’huile d’olive. À l’obscurité, l’alphatocophérol interrompt la réaction en chaîne du processus radicalaire en agissant avec les radicaux hydroperoxyles par transfert d’hydrogène avec formation d’hydroperoxydes et de radicaux aryloxyles qui se couplent avec d’autres radicaux hydroperoxyles, dans une réaction de terminaison, pour former des produits non radicalaires [23]. L’association alphatocophérol/bêtacarotène semble être moins efficace que l’alphatocophérol seul pour inhiber ces réactions [24]. En outre, l’action de l’alphatocophérol ne devient effective dans l’huile d’olive que lorsque la fraction phénolique polaire est réduite et que les produits primaires d’oxydation ont atteint un certain seuil. Une activité légèrement prooxydante de ce composé a également été enregistrée dans les premiers stades de l’auto-oxydation de l’huile d’olive, dépendant de sa concentration [5, 7, 24, 25]. À la lumière, l’alphatocophérol agit par une désactivation de l’oxygène singulet à l’oxygène atmosphérique mais aussi par une réaction chimique avec lui pour former des produits de dégradation tels que les quinones tocophéroliques et les époxydes de quinones. Par ailleurs, à la lumière, l’α-tocophérol montre un effet synergiste avec le bêtacarotène. [18, 19, 24]. L’huile d’olive est, par ailleurs, pourvue de certains composés phénoliques (hydroxytyrosol, tyrosol…) qui lui confèrent son goût particulier et contribuent à sa stabilité. Plusieurs études ont été conduites sur la stabilité oxydative des huiles d’olive additionnées d’antioxydants phénoliques entreposées à des températures élevées (50-80 °C) et à l’obscurité [14, 26-29]. Chimi et al. [6, 29] ont montré que l’hydroxytyrosol se comporte comme le meilleur antioxydant comparé à l’acide caféique, l’oleuropéine et le tyrosol. Le BHT, qui est un antioxygène synthétique, s’avère être plus efficace que l’oleuropéine et le tyrosol mais moins efficace que l’acide caféique et l’hydroxytyrosol. D’une manière générale, les orthodiphénols (hydroxytyrosol, acide caféique et oleuropéine) sont plus efficaces que les monophénols (tyrosol). En outre, Hartzallah et Kiritsakis [26] ont comparé l’activité antioxydante des extraits phénoliques des feuilles et des fruits de l’olivier à celle d’antioxydants synthétiques. L’ordre établi est le suivant : extrait phénolique du fruit de l’olivier > extrait phénolique de la feuille de l’olivier > BHT > BHA.

Compte tenu de ce qui précède, l’objectif de la présente étude, s’inscrivant dans le cadre d’investigations antérieures effectuées sur la stabilité oxydative des huiles d’olive vierges extra tunisiennes [3], a été d’étudier les effets de l’addition de certains composés mineurs (chlorophylles a et b, bêtacarotène, alphatocophérol et tyrosol) et de leurs interactions sur la stabilité oxydative des huiles d’olive tunisiennes vierges extra et purifiées, au cours de leur stockage dans différentes conditions (lumière, obscurité, étuvage). Cette étude, a été réalisée afin de comprendre l’activité antioxydante de certains composés natifs (bêtacarotène, chlorophylles a et b, alphatocophérol, tyrosol) de l’huile d’olive vierge.

Matériel et méthodes

Purification de l’huile d’olive vierge

Traitement des échantillons

Afin d’étudier les effets des chlorophylles a et b (Fluka), du bêtacarotène, de l’alphatocophérol, du tyrosol et de leurs interactions sur la stabilité de l’huile d’olive et de les comparer à ceux de certains antioxydants synthétiques, nous avons réalisé trois plans factoriels (3 facteurs) complets à deux niveaux suivant l’ordre classique [30] (tableau 1). Le choix des niveaux hauts a été fixé en se basant, d’une part, sur les résultats des essais préliminaires réalisés, en tenant compte des teneurs moyennes trouvées dans les HOVE tunisiennes [3] et, d’autre part, sur les doses maximales des additifs (alphatocophérol) autorisées pour les huiles raffinées [31, 32].

Les effets calculés suite aux réponses trouvées pour les différents plans d’expériences sont considérés significatifs, à p < 0,05, lorsque leur valeur absolue est supérieure à deux fois l’erreur-type (e). La représentation graphique de l’effet (qui est calculé sur la moyenne de deux mesures) divisé par deux fois l’erreur-type « effet/(2e) » a alors été effectuée pour chaque facteur afin de faciliter la lecture des résultats. Ainsi, lorsque (effet/(2e)) > 1, l’effet est considéré comme significatif.

L’erreur-type est déterminée comme décrit par Goupy [30]. Après calcul de la variance à chaque essai du plan, nous déterminons la variance moyenne des réponses, l’erreur-type sur un effet est alors calculée grâce à la relation suivante :

Où e représente l’erreur-type sur l’effet ;

s_y² représente la variance moyenne des réponses ;

n est le nombre total d’essais du plan (en tenant compte de la duplication du plan), soit 16 dans notre cas.

Les échantillons du plan 1 ont été placés sous la source lumineuse, enveloppés ou non de papier aluminium. Les prélèvements ont été effectués toutes les 4 h pendant 16 h, et après 32 h. La détermination de l’indice de peroxyde (IP) a été effectuée pour tous les prélèvements. Les échantillons du plan 2 ont été soumis directement au test Rancimat à 90 °C.

Afin de récapituler et synthétiser les résultats du plan 1, ceux-ci ont été traités par un plan complet 2⁵ puis modélisés. En supposant que les k facteurs de l’étude sont quantitatifs continus et que la réponse est elle-même continue, le modèle mathématique réel associé est continu et peut être rapproché par un polynôme du type suivant [33] :

Où y est la réponse en unités usuelles ;

I est la moyenne des réponses en unités usuelles ;

E_i est l’effet du facteur i en unités usuelles ;

x_i est le niveau du facteur i en valeurs centrées réduites.

Pour l’interprétation, nous avons aussi appliqué la formule de changement de variables suivante :

Où x est le niveau du facteur en valeurs centrées réduites ;

X est le niveau du facteur en valeurs usuelles ;

est le niveau du point central, soit la moyenne, en valeurs usuelles ;

est le pas de variation, X ₊ étant le niveau haut du facteur et X _– le niveau bas du facteur en valeurs usuelles.
Tableau 1 Niveaux hauts et bas des différents facteurs (ppm) des plans d’expériences étudiés.

Analyses physico-chimiques

Résultats et discussion

Caractéristiques des huiles d’olive étudiées

Les HOVE tunisiennes, utilisées dans cette étude, ont, toutes deux, leur acidité libre, leur indice de peroxyde (surtout l’huile T) et leur K₂₇₀ de départ relativement faibles. D’ailleurs, les valeurs de ces paramètres de qualité sont assez proches de celles trouvées pour des HOVE espagnoles extraites par un système de centrifugation à trois phases [42]. En revanche, la teneur en tocophérols de l’HOVE T est plus élevée que celle de ces huiles espagnoles qui ont présenté des teneurs comprises entre 158 et 176 ppm. De même, ce taux est supérieur à ceux des huiles d’olive algériennes, également extraites par centrifugation, qui ont des teneurs allant de 176 à 291 ppm [43]. Par ailleurs, les taux en pigments de nos échantillons se situent dans l’intervalle des variétés algériennes trouvées par Douzane et Bellal [43]. Cependant, nous pouvons constater que les HOVE P et T ont des concentrations très différentes en chlorophylles, l’huile T contenant trois fois plus de chlorophylles que l’huile P, alors qu’elles ont des concentrations semblables en bêtacarotène.
Tableau 2 Caractéristiques des huiles d’olive étudiées.

^bHuile T : huile utilisée pour l’étude de l’alphatocophérol et du tyrosol.

Effets de la teneur en bêtacarotène et en chlorophylle a sur la stabilité oxydative de l’huile d’olive

La chlorophylle a ne présente pas d’effet à l’obscurité, la phase d’induction étant d’environ 24 h pour toutes les huiles (figure 2A). En revanche, elle présente un effet prooxydant à la lumière d’autant plus significatif que sa teneur augmente. Ceci est vérifié par les valeurs de l’IP lors des premières heures d’illumination des huiles (figure 2A) bien que la phase d’induction est éliminée par la lumière. De plus, les produits secondaires d’oxydation à 270 nm augmentent plus rapidement pour les huiles aux teneurs les plus élevées en chlorophylle a pendant toute la durée d’illumination étudiée (figure 2B).

Effets de la teneur en alphatocophérol et en tyrosol sur la stabilité de l’huile d’olive

L’IP des échantillons d’huile purifiée additionnés de tyrosol (figure 5) commence à augmenter à partir du 19^e jour d’étuvage à 40 °C ce qui révèle un effet antioxydant net par rapport à l’huile témoin. Sur l’huile vierge, le tyrosol agit aussi nettement sur la phase d’induction et montre un effet-dose un peu plus marqué que sur l’huile purifiée (figures 5 et 6). L’IP de l’huile purifiée témoin a dépassé, au bout de 16 jours la valeur de 5 méq O₂/kg par rapport aux durées de 22 et 25 jours obtenues pour les échantillons ayant reçu respectivement 5 à 20 ppm et 40 ppm de tyrosol. Nous constatons ainsi que ces durées sont relativement plus importantes que celles notées après les ajouts d’alphatocophérol.

Effets du bêtacarotène, des chlorophylles a et b et de leurs interactions sur la stabilité oxydative de l’huile d’olive purifiée

• – En accord avec les résultats précédents, les chlorophylles a et b, seules et ensemble, sont prooxydantes à la lumière, l’effet étant de plus en plus net au fur et à mesure du temps d’exposition jusqu’à 16 heures d’illumination puis diminue après 32 heures d’exposition à la lumière, que ce soit sur l’IP ou le K₂₇₀. L’effet photosensibilisateur de la chlorophylle b est régulièrement plus important (p < 0,05) que celui de la chlorophylle a pendant toute la durée de l’expérience, ce qui est en accord avec les résultats obtenus par Rahmani sur l’huile d’olive marocaine [18].
• – Le bêtacarotène (7 ppm) seul apparaît antioxydant, sur l’IP et plus nettement sur le K₂₇₀ bien qu’il ait présenté un effet légèrement prooxydant à une teneur de 8 ppm.
• – Quand l’une ou l’autre des chlorophylles est en mélange avec le bêtacarotène, l’effet global sur l’IP reste prooxydant mais atténué, l’effet sur le K₂₇₀ est encore plus atténué, il va jusqu’à s’annuler, voire s’inverser en raison de l’effet antioxydant du bêtacarotène de plus en plus marqué.
• – Quand le bêtacarotène est en mélange avec les deux chlorophylles ensemble, l’effet global reste totalement prooxydant.

Ceci semble indiquer un effet additif du mélange. Kiritsakis et Dugan [46] ont également trouvé que l’ajout de 4 ppm de bêtacarotène à l’huile d’olive décolorée réduit de façon significative la photo-oxydation induite par les chlorophylles.

• – À l’obscurité, nous notons que le bêtacarotène seul ou en présence de chlorophylle b est antioxydant mais nous pouvons remarquer, que de manière générale les effets sont nettement moins significatifs qu’à la lumière.

Par ailleurs, afin de mieux exploiter les résultats obtenus, la lumière et la durée sont considérées parmi les facteurs étudiés. Ainsi, les niveaux hauts et bas de ce plan 2⁵ sont représentés dans le tableau 3. Les effets calculés sont également représentés dans le tableau 3.

Il ressort que tous les facteurs sont significatifs (p < 0,05) (2 fois l’erreur = 0,25), avec des effets de la lumière et de la durée bien plus importants que ceux des pigments. Le bêtacarotène (7 ppm) présente un effet antioxydant tandis que la chlorophylle b agit plus significativement comme prooxydant que la chlorophylle a.

Afin de pouvoir établir le modèle mathématique, nous avons considéré que le facteur lumière est quantitatif et continu. En ne tenant compte que des facteurs (influents) et des interactions significatives d’ordre 2, le modèle s’écrit donc, en variables centrées réduites :

Où IP est l’indice de peroxyde en méq O₂/kg ;

x₁, x₂, x_3, x₄ et x₅ sont les niveaux des facteurs 1, 2, 3, 4 et 5 (bêtacarotène, chlorophylle a, chlorophylle b, lumière et durée) en valeurs centrées réduites.

Toutefois afin d’alléger le modèle puisque les 5 facteurs sont influents nous avons négligé les interactions. Le modèle mathématique devient donc le suivant :

En appliquant le changement de variables des valeurs centrées réduites en valeurs vraies ou usuelles, et en supposant que l’obscurité correspond à 0 % de lumière et la présence de lumière correspond à 100 %, le modèle mathématique a été établi au niveau haut de la durée (32 heures), d’une part, dans le cas où les échantillons sont conservés à l’obscurité, et d’autre part, dans le cas où ils sont conservés à la lumière. Les deux modèles s’écrivent donc : à l’obscurité ;

à la lumière.

Où IP est l’indice de peroxyde en méq O₂/kg ;

X₁, X₂ et X₃ sont les niveaux des facteurs 1, 2 et 3 (bêtacarotène (ppm), chlorophylle a (ppm) et chlorophylle b (ppm)).
Tableau 3 Niveaux et effets des différents facteurs étudiés par un plan 2⁵.

Effets du bêtacarotène, de l’alphatocophérol, du tyrosol et de leurs interactions sur la stabilité oxydative de l’huile d’olive

Ainsi, l’ajout de 200 ppm d’alphatocophérol à l’huile d’olive purifiée (figure 9A) a eu un effet significatif sur l’augmentation du temps d’induction de l’oxydation (test Rancimat) de cette huile par rapport à l’HOVE contenant initialement 364 ppm d’alphatocophérol (figure 9B), résultat en accord avec les données obtenues lors du suivi de l’IP de ces huiles en fonction des ajouts en alphatocophérol (figures 3) et 4). L’ajout de 4 ppm de bêtacarotène n’a aucun effet sur l’huile d’olive purifiée alors qu’il montre un effet antioxydant dans l’HOVE. Ceci s’expliquerait probablement par la teneur totale en bêtacarotène dans l’huile. En effet, l’HOVE contient initialement 3 ppm de bêtacarotène, soit une teneur globale de 7 ppm. Cet effet antioxydant confirme celui observé lors de l’étude précédente (figures 7) et 8). L’ajout de 50 ppm de tyrosol n’a aucun effet sur le temps d’induction de l’oxydation par Rancimat, aussi bien de l’huile purifiée que de l’HOVE, alors qu’il était paru efficace lors de l’étuvage de ces huiles à 40 °C (figures 5) et 6). Les différentes associations du bêtacarotène, de l’alphatocophérol et du tyrosol dans l’huile d’olive purifiée, ont permis de dégager les constatations suivantes :

• – L’ajout de 4 ppm de bêtacarotène (qui est sans effet seul) à 200 ppm d’alpha-totophérol, avec ou sans ajout de 50 ppm de tyrosol, réduit complètement l’effet anti-oxydant des tocophérols ;
• – L’ajout de 50 ppm de tyrosol (qui est sans effet) à 200 ppm d’alphatocophérol réduit légèrement l’efficacité de ce dernier.

Ces effets antagonistes sur l’huile purifiée ne sont pas vérifiés avec l’HOVE, en raison de la présence de ces trois composés et de multiples autres composés mineurs dans l’HOVE pouvant masquer l’influence des substances que nous étudions tant les interactions entre composés sont nombreuses [23]. Ainsi, dans l’HOVE, nous avons observé que :

• – L’ajout de 4 ppm de bêtacarotène aux 364 ppm d’alphatocophérol, 3 ppm de bêtacarotène et 25 ppm de tyrosol initiaux de l’HOVE, avec ou sans ajout de 50 ppm de tyrosol supplémentaires, augmente la stabilité de l’HOVE ;
• – L’ajout de 200 ppm d’alphatocophérol, soit 564 ppm en tout, n’a pas d’effet seul, mais avec 4 ppm de bêtacarotène et en présence ou non de 50 ppm de tyrosol supplémentaires, l’effet devient prooxydant.

Il est ainsi vraisemblable que les effets de synergie ou d’antagonisme varient en fonction des rapports molaires entre les différents composés.

Conclusion

Par ailleurs, l’alphatocophérol, à 200 ppm, agit comme antioxydant dans l’huile d’olive purifiée, alors qu’il est sans effet dans une HOVE contenant initialement 364 ppm de ce composé. En revanche, le bêtacarotène, à une teneur de 4 ppm, utilisé seul ou en association avec 50 ppm de tyrosol, n’a pas d’effet sur l’huile d’olive purifiée, alors qu’il agit comme antioxydant de l’HOVE contenant initialement 3 ppm de ce composé.

Ainsi, l’action des antioxydants natifs de l’huile d’olive est assez complexe puisqu’elle ne dépend pas uniquement de leur teneur, mais également des synergies et des antagonismes qui peuvent se produire entre eux.

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