ARTICLE
Auteur(s) : Marie-Paule HERRY
Laboratoire DGCCRF de Rennes, 26, rue Antoine Joly,
35000 Rennes, France
Tél. : 02-99-14-37-14
Télécopie : 02-99-54-92-07
<marie-paule.herry@dgccrf.finances.gouv.fr>
Introduction
Les crises alimentaires qui se sont succédées récemment (vache
folle, dioxine…) ont conduit la Commission européenne à compléter
la réglementation des contaminants des denrées alimentaires. Ainsi
depuis 1998, les mycotoxines font l'objet de travaux
communautaires.
Les mycotoxines sont des substances toxiques élaborées par des
champignons microscopiques dans les produits végétaux.
Parmi les 200 000 espèces de moisissures recensées dans
le monde, plus de 200 sont capables de produire des mycotoxines.
Les Aspergillus, les Penicillium, les Fusarium
sont bien représentés parmi les genres susceptibles d'héberger des
espèces toxinogènes.
Les conditions de production des mycotoxines sont dépendantes des
souches de moisissures, du substrat sur lequel elles se
développent, des conditions climatiques de production, et de
récolte ainsi que des conditions de stockage des denrées
alimentaires.
Parmi les 300 mycotoxines identifiées, une vingtaine a été
isolée de produits végétaux naturellement contaminés à des teneurs
et des fréquences significatives. Les plus étudiées sont les
aflatoxines, l'ochratoxine A, la zéaralénone, la patuline, les
fumonisines, les trichothécènes.
De nombreuses denrées dont les céréales, les fruits séchés, les
fruits oléagineux, les épices, le cacao, le café, le jus de pomme
et les vins… ont été trouvés contaminées.
Deux caractéristiques liées aux conditions d'élaboration des
mycotoxines ont orienté les travaux de la Commission et ont dicté
la rédaction des étapes à suivre pour le traitement de
l'échantillon de laboratoire :
– Leur répartition dans les graines ou les fruits peut être
très hétérogène. Une faible quantité de graines peut être
contaminée mais ces graines contaminées peuvent contenir de très
fortes concentrations en mycotoxines : l'échantillonnage et la
préparation de l'échantillon sont deux points particulièrement
importants pour l'estimation de la teneur en mycotoxines.
– La détection de ces traces de mycotoxines dans une matrice
souvent complexe (matières grasses, pigments…) nécessite des
techniques analytiques suffisamment sensibles. En effet, la
réglementation fixe des teneurs maximales admissibles de
2 µg/kg en aflatoxine B1 et 4 µg/kg pour la somme des
aflatoxines dans les produits destinés à la consommation humaine
directe.
Préparation d'un échantillon prélevé selon la directive
98/53/CE de la Commission du 16 juillet 1998
Les nouvelles directives communautaires [1-3] traitant du
contrôle des mycotoxines précisent :
– En annexe I, les modalités d'échantillonnage : les
quantités à prélever en fonction de la taille des lots et par type
de produit, les dispositions spécifiques à certains produits, les
critères d'acceptation des lots.
– En annexe II, la préparation des échantillons de laboratoire et
les critères généraux auxquels doivent satisfaire les méthodes
d'analyse pour le contrôle officiel des teneurs en aflatoxines de
certaines denrées alimentaires.
Dans le cas du dosage des aflatoxines dans les produits
oléagineux, la directive 98/53/CE de la Commission précise la
taille de l'échantillon qui varie de 3 à 30 kilogrammes en
fonction de l'importance du lot à contrôler. Chaque échantillon
dont le poids est supérieur à 10 kilogrammes doit être divisé
en 3 sous-échantillons. Chacun des sous-échantillons sera
préparé et analysé et les trois résultats d'analyse seront pris en
compte pour accepter ou non la conformité d'un lot. Les limites
maximales fixées par le règlement (CE) no
466/2001 s'appliquent à la partie comestible et par conséquent
il faut estimer le poids des amandes dans l'échantillon global en
décortiquant une centaine de graines et en mesurant le rapport
poids des fruits entiers sur poids des amandes.
La totalité de l'échantillon reçu au laboratoire doit être
utilisée. “Chaque échantillon de laboratoire prélevé est broyé
finement et soigneusement mélangé selon une méthode garantissant
une homogénéisation complète” précise la directive.
Le but est donc de réduire chacun des sous-échantillons en fines
particules puis de disperser de façon homogène les particules
contaminées dans l'ensemble de la masse du sous-échantillon. Cette
étape est cruciale pour l'établissement de la teneur représentative
en mycotoxines de l'échantillon.
Pour atteindre ce but chacun des sous-échantillons est mixé en
présence d'eau à l'aide d'un broyeur-homogénéiseur industriel
(exemple : broyeur-homogénéiseur Silverson modèle DX)
afin d'obtenir une pâte. Dans le cas des fruits oléagineux le
broyage pendant 30 minutes après ajout de 15 kilogrammes
d'eau pour 10 kilogrammes d'échantillon donne de bons
résultats. Dans le cas des arachides en coque, il est conseillé de
doubler la quantité d'eau ajoutée et d'assurer manuellement le
brassage de la pâte de manière à garantir l'homogénéité de la
dispersion des aflatoxines dans la masse. A partir de cette pâte on
procède à la prise des échantillons pour essais sur lesquels vont
être effectuées les analyses.
L'homogénéité de la dispersion est vérifiée en analysant plusieurs
prises d'essai issues de la masse de pâte. La validation du procédé
de broyage et d'homogénéisation doit être effectuée dès lors qu'un
nouveau produit est à contrôler.
On peut également préparer l'échantillon, sans ajout d'eau, à
l'aide d'un broyeur à mâchoire de grande capacité (exemple :
broyeur Ras Mill Romer) mais dans ce cas l'homogénéité de la
dispersion des mycotoxines dans l'échantillon est plus difficile à
obtenir.
Pour les noix à coque très dures le concassage à l'aide de ce
broyeur est nécessaire avant la transformation en pâte.
Dosage des mycotoxines
Les méthodes de référence pour l'analyse des mycotoxines suivent
toutes le même schéma analytique : extraction de la mycotoxine
de l'échantillon préparé, purification de l'extrait obtenu et
détection et dosage de cette mycotoxine.
Extraction
Pour permettre de détecter des teneurs en mycotoxines très
basses, les prises d'essai d'échantillons sont importantes, de
l'ordre de 25 à 50 grammes.
Les solvants d'extraction sont des solvants organiques permettant
d'extraire les mycotoxines de la matrice dans lesquelles elles ont
été synthétisées. Le chloroforme, l'acétate d'éthyle, des solutions
aqueuses de méthanol ou d'acétonitrile… font partie des solvants
employés.
Les extractions se font pendant des temps très courts (à l'aide
d'Ultra Turrax ou de Waring Blendor) ou pendant des temps de
l'ordre de 30 minutes par agitation magnétique.
Purification
Cette étape est nécessaire pour permettre la concentration de
l'extrait purifié et augmenter ainsi la sensibilité de la
méthode.
On utilise des colonnes SPE (Solid Phase Extraction)
remplies de silice, de Florisil, de silice greffée comme pour le
dosage de l'aflatoxine B1 dans les matières premières et aliments
des animaux [4], de silice échangeuse d'anions pour le dosage des
fumonisines [5] ou encore des colonnes de charbon actif-alumine
pour le dosage des trichothécènes.
La production d'anticorps dirigés contre les mycotoxines a fait
évoluer les techniques analytiques de façon considérable. Leur
utilisation est apparue il y a une dizaine d'années, permettant
l'avènement de méthodes rapides sous forme de kits ELISA ou de
techniques utilisables sur le terrain. (Voir chapitre développé par
Monsieur Sarrazin.)
Ces anticorps sont également greffés sur un gel contenu dans des
colonnes. Ces colonnes d'immuno-affinité sont donc spécifiques
d'une mycotoxine. Il en existe pour la plupart des mycotoxines
comme les aflatoxines B&G, l'aflatoxine M1, l'ochratoxine, la
zéaralénone, les fumonisines, le déoxynivalénol. A ce jour il
n'existe pas de colonnes d'immuno-affinité destinées au dosage de
la patuline, celle-ci étant une molécule trop petite pour initier
des anticorps.
Les protocoles analytiques des méthodes de référence qui les
utilisent précisent leur mode d'emploi.
Dans une colonne, les anticorps sont présents en quantité limitée
et ne peuvent donc fixer qu'une quantité limitée de molécules de
mycotoxines. Concrètement, dans le cas d'un échantillon très
contaminé, il faut rester vigilant à ne pas dépasser la capacité
maximale de fixation de la colonne au risque de sous-doser la
concentration en mycotoxines. Dans ce cas, il est nécessaire de
diluer l'extrait d'échantillon avant l'étape de purification.
Ces colonnes ont permis l'utilisation de mélanges aqueux pour les
étapes d'extraction et purification au lieu des solvants organiques
utilisés souvent en grande quantité dans les méthodes de référence
de la génération précédente.
Ces colonnes sont faciles d'utilisation, elles permettent une
excellente purification et donnent de bons résultats
quantitatifs.
Les nouvelles méthodes à l'étude ou en cours de normalisation font
appel aux colonnes d'immuno-affinité quand elles existent.
Détection et dosage
Depuis une vingtaine d'années, les techniques de détection et de
dosage nécessaires pour répondre au besoin de contrôle ou
d'autocontrôle n'ont cessé d'évoluer.
La chromatographie sur couche mince a été utilisée pendant
longtemps mais, par cette technique, il est devenu difficile de
mesurer les teneurs maximales autorisées par les règlements
européens, trop basses pour cette technique.
Elle a donc été remplacée avantageusement par la chromatographie
liquide haute performance (CLHP) qui est particulièrement
intéressante pour la détermination des très basses concentrations,
pour la spécificité de ses modes de détection et pour ses
possibilités d'automatisation. De nombreux protocoles analytiques
existent.
La technique la plus couramment utilisée est la CLHP avec
détecteur spectrofluorimétrique. Les propriétés naturelles de
certaines mycotoxines à fluorescer sont exploitées (zéaralénone,
ochratoxine A) ; pour d'autres on exalte leur fluorescence,
par exemple par dérivation post-colonne à l'iode ou au brome dans
le cas des aflatoxines. Certaines molécules comme les fumonisines
sont rendues fluorescentes par dérivation pré-colonne avec
l'ortho-phthaldialdéhyde. La CLHP avec détecteur
spectrophotométrique est utilisée pour les analyses de patuline, de
nivalénol et déoxynivalénol.
On voit actuellement se développer une technique de détection plus
coûteuse : la chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse.
La chromatographie en phase gazeuse est surtout utilisée pour la
détection de molécules du groupe des trichothécènes dans les
céréales, avec détection par capture d'électron ou spectrométrie de
masse.
Les tests immuno-enzymatiques (ELISA) sont souvent considérés comme
une méthode de tri. Cette technique est rarement retenue dans les
méthodes normalisées et doit toujours être associée à une étape de
confirmation par méthode classique.
Préparation des solutions étalon
Dans le cas où le laboratoire fait le choix d'acheter des
poudres de mycotoxines, il est nécessaire de prendre toutes les
précautions pour leur manipulation [6].
L'élaboration de solutions standard à partir de poudre demande
rigueur et précaution, leur coût est abordable.
Cependant, les fournisseurs ne garantissent pas la quantité
conditionnée ; il est donc indispensable, dans le cas où les
mycotoxines absorbent dans l'ultraviolet, de déterminer la
concentration massique de la solution préparée par tracé du spectre
UV selon le protocole décrit dans les méthodes de référence en
tenant compte du coefficient d'absorption molaire associé au
solvant de dilution.
L'approvisionnement est parfois long car la signature de documents
administratifs est souvent nécessaire afin d'attester que la
mycotoxine convoitée sera utilisée à des fins analytiques.
Des solutions certifiées sont également commercialisées. Elles
offrent l'avantage d'éviter les manipulations délicates de poudre
de mycotoxines ou de solutions concentrées. La concentration de ces
solutions étant garantie, il n'y a pas de contrôle au
spectrophotomètre UV à effectuer. Des mélanges de mycotoxines sont
commercialisés, par exemple le mélange des quatre aflatoxines B1,
B2, G1 et G2. Ces solutions prêtes à l'emploi sont pratiques
d'utilisation mais sont coûteuses à l'achat.
Quel que soit le choix du laboratoire, il est nécessaire, pour
avoir de bons résultats, de respecter les phases de contrôle
préconisées.
Conclusion
Depuis une dizaine d'années, les moyens analytiques mis en œuvre
ont évolué vers des limites de détection plus basses ce qui permet
de répondre au besoin de contrôle analytique nécessaire à
l'application de la réglementation actuelle.
Mais les travaux concernant le contrôle des mycotoxines ne sont
pas terminés. D'autres méthodes avec des seuils de détection plus
bas encore, avec un champ d'application plus large, concernant
d'autres mycotoxines seront nécessaires pour assurer la sécurité
alimentaire du consommateur.
RÉFÉRENCES
1. Directive 98/53/CE de la Commission du
16 juillet 1998 portant fixation de modes de prélèvement
d'échantillons et de méthodes d'analyse pour le contrôle officiel
des teneurs maximales pour certains contaminants dans les denrées
alimentaires. Journal Officiel des Communautés européennes L
201.
2. Directive 2002/26/CE de la Commission du
13 mars 2002 portant fixation de modes de prélèvement
d'échantillons et de méthodes d'analyse pour le contrôle officiel
des teneurs en ochratoxine A dans les denrées alimentaires. Journal
Officiel des Communautés européennes L 75.
3. Directive 2002/27/CE de la Commission du
13 mars 2002 modifiant la directive 98/53/CE portant
fixation de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes
d'analyse pour le contrôle officiel des teneurs maximales pour
certains contaminants dans les denrées alimentaires. Journal
Officiel des Communautés européennes L 75.
4. Aliments des animaux — Détermination de la teneur
en aflatoxine B1 dans les aliments composés — Méthode par
chromatographie liquide à haute performance. Norme Internationale
ISO 14718 (Numéro de référence ISO 14718 : 1998).
5. Dosage des fumonisines B1 et B2 dans le maïs
– Méthode CLHP avec purification par extraction en phase
solide. Norme européenne NF EN 13585 Février 2002.
6. ROUSSELIN X, DAYAN-KENIGSBERG J, PLEVEN C,
CASTEGNARO M, PICOT A, ZAJDELA F (1994). Manipulation des
substances génotoxiques utilisées au laboratoire. Edition INRS
Paris cedex 14 ED 769. n
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