ARTICLE
Auteur(s) : Laurence ROSSATO1, Philippe
LAINE1, A. OURRY1
1 UMR INRA/UCBN 950, Physiologie et Biochimie
végétales, Institut de Recherche en Biologie Appliquée, Esplanade
de la Paix, Université de Caen, 14032 Caen Cedex, France
Reçu le 17/12/02
Accepté le 25/02/03
Le colza (Brassica napus L.) est une culture connue pour
absorber à l'automne des quantités d'azote largement supérieures à
d'autres cultures, quand celui-ci est disponible. Cette
caractéristique en fait une culture potentiellement épuratrice de
l'excédent nitrique du sol. Cependant, l'azote absorbé (et stocké)
n'est pas forcément valorisé par la culture en terme de rendement
ni de quantité protéique des graines. Cette dernière reste faible
compte tenu de ce qui pourrait potentiellement être transféré dans
les graines. Ainsi, une part importante de l'azote précédemment
absorbé et assimilé n'est pas valorisée pour le remplissage des
tissus reproducteurs en raison de l'abscission précoce des feuilles
sénescentes dont la teneur en N peut rester élevée [1]. Cette perte
d'azote via la chute des feuilles mortes (encore très riches
en azote) n'est pas sans conséquence sur le bilan environnemental
d'une culture de colza. Si la plante pouvait réaliser une mise en
réserve transitoire de cet azote au lieu de le perdre par la chute
des feuilles, cela pourrait contribuer à réduire les risques de
retour vers l'environnement de cet élément tout en étant valorisée
postérieurement en terme d'augmentation de la quantité d'azote dans
les tissus récoltés. La compréhension des mécanismes qui empêchent
cette mise en réserve d'azote pourrait constituer une piste
acceptable pour augmenter l'efficience d'utilisation de l'azote
absorbé. L'objectif général de ce travail vise donc à obtenir une
meilleure connaissance de la physiologie du colza d'hiver, en
particulier en ce qui concerne la dynamique d'accumulation et de
mobilisation des réserves azotées et leur implication dans le
remplissage des siliques et des graines. Deux aspects ont été pris
en compte : i) qualitatif, par la détermination de la nature
des réserves et des organes de stockage, ainsi que la détermination
des stades phénologiques importants dans la gestion des réserves
azotées, ii) quantitatif, par l'estimation de la contribution de
ces réserves au remplissage des siliques et des graines.
Résultats expérimentaux
Contribution de l'azote absorbé et remobilisé à la
croissance et au développement du colza d'hiver (Brassica napus L.
var Capitol)
L'utilisation d'un marquage continu à l'azote 15 a permis de
quantifier la contribution de l'azote absorbé et remobilisé à la
croissance et au développement du colza, du stade C1 (montaison) au
stade G5 (graines colorées). Nos résultats ont révélé l'existence
de deux phases distinctes : i) une phase d'absorption
importante de l'azote minéral qui se poursuit jusqu'au stade G1
(début de la formation des siliques). Cette phase se caractérise
par une forte absorption d'azote (figure 1) et par une
remobilisation de l'azote des feuilles sénescentes principalement
au profit de la hampe (comprenant la tige principale et celle des
ramifications), des inflorescences et du pivot, qui constituent par
ordre décroissant les organes puits les plus importants pour
l'azote mobilisé (figure
2A). ii) une phase de mobilisation de l'azote accumulé dans
les tissus végétatifs de la plante, à l'exception des racines
secondaires, pour permettre à partir du stade G1 (début de la
formation des siliques) le remplissage des siliques et des graines
(figure 2B), à
une période où la plante a cessé toute absorption d'azote exogène
(figure 1).
Ainsi, nos résultats ont montré que le remplissage en azote des
siliques et des graines, alors que l'absorption de
NO3– a cessé, fait
intervenir d'une part les feuilles comme réservoir essentiel, mais
que le rôle « tampon » joué par la hampe florale et le
pivot est essentiel face à l'asynchronie existant entre la
mobilisation de l'azote foliaire et son transfert indirect vers les
tissus reproducteurs. Il faut noter que d'autres auteurs [2] ont
également décrit un arrêt de l'absorption d'azote durant la phase
de remplissage des siliques et montré l'importance de la
contribution des feuilles, des tiges et des parties souterraines au
remplissage des siliques et des graines. Ces auteurs expliquaient
l'arrêt de l'absorption au moment du remplissage des siliques
uniquement par les conditions particulièrement sèches à cette
période. Toutefois, nos résultats obtenus à partir de plantes
cultivées en conditions d'azote non limitant et en l'absence de
stress hydrique suggèrent que l'arrêt de l'absorption observé au
stade G1 (début de la formation des siliques) ne serait pas lié à
l'absence d'azote dans le milieu ou encore à un autre effet
indirect d'un facteur de l'environnement (sécheresse par exemple).
Il serait probablement une résultante du programme ontogénétique.
Ainsi, des résultats obtenus au laboratoire semblent indiquer que
l'activité des systèmes de transport du nitrate (HATS et LATS) est
inhibée par le méthyl-jasmonate, hormone probablement synthétisée
au moment de la floraison par les inflorescences [3].
Nous avons pu par ailleurs identifier les principales transitions
entre le comportement puits et source que peuvent avoir certains
tissus au cours du cycle de culture (figure 3). Ceci nous a
permis en particulier d'illustrer l'effet « tampon » joué
par le pivot et la hampe florale. Avant l'apparition des
inflorescences, alors que l'absorption de
NO3 – reste importante, les
pivots, les racines secondaires et les feuilles constituent des
puits importants pour l'azote minéral nouvellement absorbé.
Toutefois, la population de feuilles étant hétérogène, les plus
âgées peuvent présenter un comportement d'organe source. Celles-ci
contribueront d'ailleurs largement à fournir de l'azote au pivot et
à la hampe lors de son développement progressif. La floraison
marque l'arrêt de l'absorption et en conséquence, les feuilles
entrant en sénescence fournissent une source importante
d'assimilats azotés. Selon l'importance du développement des tissus
reproducteurs, l'azote des feuilles sera plus ou moins largement
affecté vers la hampe et le pivot pour une mise en réserve
transitoire. Ces réserves seront alors massivement utilisées pour
le remplissage des siliques alors que l'excision des feuilles
intervient bien avant le stade G5 (graines colorées). L'estimation
de la force puits ou source qui peut caractériser transitoirement
chaque organe au cours du cycle (figure 3) a par ailleurs
permis de classer ces organes selon leur capacité respective à
importer ou exporter de l'azote. Ainsi, les résultats obtenus
révèlent qu'avant l'apparition des inflorescences, les feuilles et
le pivot constituent par ordre décroissant les organes puits les
plus importants pour l'azote minéral absorbé. En effet, la force
puits des feuilles
(+ 0,62 mgN·g – 1MS·j – 1)
est alors 1,5 fois plus élevée que celle du pivot
(+ 0,41 mgN·g –
1MS·j – 1). Toutefois, au cours du
développement de l'appareil reproducteur, la force source des
feuilles les plus âgées
(– 0,83 mgN·g – 1MS·j
– 1) est plus importante que la force puits des
feuilles les plus jeunes
(+ 0,62 mgN·g – 1MS·j
– 1) ce qui permet d'attribuer à l'ensemble de la
population de feuilles un comportement net de source. Ainsi,
l'azote absorbé ou provenant des feuilles sénescentes est
progressivement détourné au profit des inflorescences, de la hampe
florale, et du pivot qui constituent par ordre de priorité les
organes puits les plus puissants vis-à-vis de l'azote, si l'on en
juge par la comparaison de leur force puits respective
(+ 1,85, + 0,64
et + 0,41 mgN·g – 1MS·j – 1,
figure 3). A la
fin de la floraison, la force puits des siliques est élevée
(+ 1,32 mgN·g – 1MS·j
– 1) et les feuilles constituent l'organe source le
plus puissant pour ce remplissage
(– 0,89 mgN·g – 1MS·j –
1). Toutefois, la contribution du pivot et de la hampe est
également essentielle, la force source de ces organes étant
équivalente et de l'ordre de – 0,35 mgN·g
– 1MS·j – 1.
L'ensemble de ces résultats permet de dresser une proposition de
modèle conceptuel concernant la répartition des flux d'azote au
sein du colza au cours de son développement, ce qui permet
d'identifier les phases critiques, les paramètres et de proposer
quelques boucles de régulation. A partir de la montaison (stade
C1), la répartition des quantités d'azote absorbé au sein des
différents organes sera donnée par le modèle d'absorption existant
au laboratoire (Malagoli et al., 2002 ; en cours de
rédaction). La quantité d'azote foliaire non remobilisable restitué
à l'environnement est définie par la teneur en azote et la biomasse
sèche des feuilles mortes au stade G1 (fin de la floraison). La
quantité d'azote foliaire remobilisable correspond à la différence
entre la quantité d'azote foliaire au stade C1 et la quantité
d'azote non remobilisable. En fin de floraison, l'azote
remobilisable pour le remplissage des siliques est stocké dans les
organes sources (feuilles, hampe et pivot). La quantité d'azote
total est définie par la teneur en azote et la biomasse sèche des
organes sources au stade G1 (fin de la floraison). La quantité
d'azote non remobilisable sera déterminée pour la hampe, le pivot
et les feuilles respectivement à partir de la teneur en azote et la
biomasse sèche de la hampe, du pivot et des feuilles mortes au
stade G5 (graines colorées). La quantité d'azote remobilisable pour
le remplissage correspond à la différence entre la quantité d'azote
total en fin de floraison et la quantité d'azote non remobilisable.
Ainsi, ce modèle est basé sur différentes hypothèses. La
remobilisation de l'azote des feuilles serait contrôlée par le
rythme de développement de la hampe florale et du pivot jusqu'au
stade G1 (fin de la floraison) (contrôle par la force des puits).
Toutefois, on pourrait émettre l'hypothèse que la vitesse de
remplissage des compartiments « tampon » (hampe et pivot)
pourrait être limitée par la quantité d'azote foliaire
remobilisable (limitation par la source). De la même façon, la
remobilisation de l'azote des feuilles, de la hampe florale et du
pivot à partir du stade G1 serait sous le contrôle du rythme de
développement des siliques (contrôle par la force des puits). Si
l'on se base sur les travaux réalisés chez le pois [4], la vitesse
de remplissage des siliques serait quant à elle limitée par la
quantité d'azote disponible (limitation par les sources).
Identification et caractérisation d'une protéine de réserve
(VSP) chez le colza d'hiver (Brassica napus L. var
Capitol)
La combinaison de techniques isotopiques (marquage
15N) et électrophorétiques a permis de montrer qu'une
mise en réserve transitoire d'azote sous forme protéique intervient
chez le colza d'hiver, du stade C1 (montaison) au stade G1 (début
de la formation des siliques). Une protéine de 23 kDa semble
impliquée dans ce stockage transitoire d'azote. Elle s'accumule
principalement au sein du pivot jusqu'à la fin de la floraison
(stade G1) (figure
4) et sa synthèse semble en partie favorisée par un
recyclage interne d'azote résultant d'un processus de sénescence
foliaire (figure
2A). Cette protéine est glycosylée et présente deux
isoformes de pi = 5,4 et 5,5 ayant une séquence
N-terminale identique. Ce séquençage partiel a permis d'obtenir des
anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine de 23 kDa à
partir d'un peptide de synthèse de même séquence.
L'immunolocalisation tissulaire a révélé que la protéine est
accumulée uniquement au niveau des cellules du parenchyme cortical
périphérique du pivot. Elle est localisée dans les vacuoles des
cellules situées à proximité des vaisseaux conducteurs du phloème
(figure 5). En
outre, une protéine homologue à la 23 kDa a pu être détectée
dans les feuilles et les inflorescences, mais le potentiel
d'expression de cette protéine existe aussi dans la hampe
florale.
La protéine de 23 kDa est remobilisée lors du développement
et du remplissage des siliques, ce qui correspond au stade où le
pivot passe de l'état de puits à l'état de source, si l'on en juge
par l'évolution de son contenu en azote. Ainsi, les produits
d'hydrolyse de cette protéine pourraient donc contribuer au
remplissage en azote des graines à une période où l'absorption
d'azote est réduite (figure 1).
L'application de méthyl-jasmonate ou d'acide abscissique stimule
la synthèse de la protéine de 23 kDa dans le pivot de colza.
Nous avons donc choisi d'approfondir le rôle de signal joué par le
méthyl-jasmonate (constituant odoriférant et volatil des fleurs)
sur l'absorption, les processus de sénescence (transpiration,
photosynthèse, teneur en chlorophylles) et sur l'induction de la
synthèse de la protéine de 23 kDa. Les résultats de ce travail
complémentaire confirment de façon surprenante que l'accumulation
de cette protéine de réserve n'est pas liée à l'absorption, mais au
recyclage préférentiel de l'azote endogène des feuilles
sénescentes. L'absorption d'azote est en effet très rapidement (en
moins de 6 heures) inhibée par le méthyl-jasmonate (figure 6). Ainsi,
comme l'atteste déjà la littérature [5, 6], le méthyl-jasmonate
déclencherait la sénescence des feuilles et la remobilisation des
deux sous-unités de la RubisCO. L'azote remobilisé à partir des
feuilles sénescentes favoriserait alors la synthèse de la protéine
de 23 kDa dans le pivot, et celle d'une protéine homologue
dans la hampe, les inflorescences et les feuilles. Le poids
moléculaire de cette protéine est de 23 kDa dans la hampe et
de 24 kDa dans les inflorescences et les feuilles. Des
résultats similaires ont été obtenus chez d'autres plantes
annuelles. Ainsi, chez le soja, le méthyl-jasmonate, composé
associé à la sénescence des feuilles, est capable d'induire la
synthèse des VSP (Vegetative Storage Protein) lorsqu'il est libéré
dans l'atmosphère [7].
Chez le colza, la protéine de 23 kDa est totalement
remobilisée lors du développement de l'appareil reproducteur. Cette
protéine pourrait donc jouer le rôle de molécule azotée
« tampon » entre l'hydrolyse de la RubisCO et la
libération des acides aminés pour le remplissage des siliques. Sa
remobilisation permettrait le remplissage en azote des graines, à
une période où l'absorption est réduite via le
méthyl-jasmonate produit par les inflorescences. Toutefois, le rôle
de signal naturel capable d'induire la sénescence foliaire et la
synthèse de la protéine de 23 kDa, proposé pour le
méthyl-jasmonate est sujet à réflexion. Cette hypothèse pourrait
être fondée si l'on considère que le méthyl-jasmonate est un
constituant odoriférant et volatil des fleurs. Ainsi, lors de la
floraison du colza en conditions de plein champ, la concentration
de méthyl-jasmonate produit par les inflorescences d'un peuplement
dense de colza pourrait être suffisante pour augmenter et accélérer
la sénescence foliaire et la synthèse de la protéine de
23 kDa. Il pourrait s'agir d'un véritable signal permettant
aux plantes les plus retardées dans leur développement d'achever
leur cycle de reproduction. Ceci pourrait expliquer par exemple
pourquoi l'accumulation de la protéine de 23 kDa est toujours
plus importante en conditions de plein champ. Cependant, certains
auteurs restent sceptiques quant au rôle éventuel de signal naturel
joué par le méthyl-jasmonate libéré dans l'atmosphère lors de la
floraison. Ainsi, selon Staswick [7], si le méthyl-jasmonate est
capable d'induire la synthèse des VSP chez le soja à des
concentrations atmosphériques atteignant 40 à 80 µM et parfois
moins [8], il ne pourrait pas, en conditions de plein champ,
s'accumuler en concentration suffisante pour provoquer une réponse
au sein des plantes. La mise en mouvement des masses d'air
préviendrait en effet une telle accumulation [7]. Afin de vérifier
cette hypothèse, une collaboration avec le Dr. I. Baldwin du Max
Planck Institute for Chemical Ecology (Allemagne) est en cours pour
quantifier la volatilisation de cette hormone au champ au sein du
couvert végétal et également sur organe isolé au laboratoire.
Quels arguments nos résultats fournissent-ils pour attribuer
à la protéine de 23 kDa un rôle de VSP
?
Si l'on se réfère aux critères que Wittenbach [9] et Staswick
[10] ont proposé, un certain nombre d'éléments vont dans ce
sens : i) Le niveau d'accumulation de la protéine de
23 kDa est potentiellement élevé puisqu'elle constitue la
protéine majeure du pivot à la fin de la floraison (stade G1)
(figure 4).
Cette protéine est également détectée dans la hampe, les feuilles
et les inflorescences. ii) Le cycle accumulation/mobilisation de
cette protéine coïncide avec les flux d'azote tels que nous les
avons évalués par marquage isotopique. iii) Enfin, la protéine de
23 kDa est localisée à proximité du phloème. Cette
localisation à proximité des vaisseaux conducteurs pourrait, comme
chez le soja [10], faciliter par la suite sa remobilisation. Toutes
ces caractéristiques vont dans le sens d'une fonctionnalité en tant
que VSP. Par ailleurs, il existe de nombreuses analogies avec les
caractéristiques des VSP du soja ou d'autres espèces : i)
Comme les VSP identifiées chez le soja [11, 12, 13] ou chez
l'arabette des dames [14], la synthèse de la protéine de
23 kDa est induite par un apport externe de méthyl-jasmonate.
ii) Comme la plupart des VSP étudiées notamment chez les ligneux
[15] et chez la luzerne [16], les isoformes de cette protéine sont
glycosylées. Le rôle de cette glycosylation serait de favoriser
l'adressage de ces protéines vers des compartiments cellulaires de
stockage comme la vacuole [17]. iii) L'accumulation de la protéine
de 23 kDa est, comme chez le soja, maximale au moment de la
floraison. Cette protéine étant également remobilisée lors du
développement des siliques, elle pourrait potentiellement jouer un
même rôle fonctionnel dans le remplissage en azote des graines.
Conclusion
L'analyse des flux d'azote au sein de la plante a montré que
bien que significative, la contribution du pivot à la fourniture
d'azote pour le remplissage des siliques, n'était pas de même
ampleur que celle assurée par les feuilles. On pourrait donc
estimer, un peu rapidement, que la VSP putative de 23 kDa du
pivot ne présente agronomiquement qu'un intérêt restreint.
Cependant, il est admis que le colza présente une forte capacité
d'absorption racinaire du nitrate, et paradoxalement une efficience
relativement faible pour assurer le transfert de cet élément vers
les tissus récoltés. On pourrait penser que la sénescence foliaire
intervient trop précocement par rapport aux besoins en azote des
tissus reproducteurs. La hampe et le pivot pourraient alors jouer
une fonction de stockage transitoire d'azote entre cette sénescence
foliaire précoce et le remplissage des graines. Les mécanismes
impliqués, et leur éventuelle manipulation (visant à améliorer la
remobilisation de l'azote des feuilles avant leur chute et donc
favoriser le remplissage des graines) pourrait constituer une piste
agronomiquement acceptable pour augmenter la quantité d'azote dans
les tissus récoltés (Nitrogen Harvest Index pour les
anglo-saxons).
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