BIOLOGIE VEGETALE Bilan et perspectives du programme CARTISOL : construction d’une carte génétique du Tournesol et recherche marqueurs moléculaires de résistances aux maladies

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1997 marque la fin du programme Cartisol qui a associé depuis 1990 partenaires de la recherche publique et privée pour, dans une première phase (1990-1994), construire une carte génétique du tournesol¹, et dans une seconde étape (1994-1997), compléter cette carte et l'utiliser pour identifier des marqueurs moléculaires de résistance aux maladies.

Quel bilan peut-on dresser de ce travail collectif ?

Au départ, des acquis importants

L'une des motivations principales de ce programme de recherche visait à améliorer l'efficacité de la recherche d'hybrides plus résistants aux maladies du tournesol, et en particulier à Sclerotinia sclerotiorum.

Le contexte de réforme de la politique agricole commune et les nécessaires réductions d'intrants, ainsi que les préoccupations liées à la protection de l'environnement, constituent un cadre favorable à la promotion d'un travail de sélection sur la résistance aux maladies qui contribuerait à régulariser les rendements.

Les travaux de recherche sur Sclerotinia chez le tournesol sont en France l'objet d'un développement important depuis une vingtaine d'années, en particulier à l'INRA. Ils ont permis de cerner les difficultés et de souligner le déterminisme complexe et polygénique des résistances [1]. Pour une même plante, il n'y a pas de relation entre les résistances exprimées au niveau des différents organes [2, 3]. Il faut donc traiter chaque forme d'attaque comme une maladie particulière. Ces travaux ont également permis de caractériser les populations du champignon et leur agressivité. Des tests d'évaluation des différentes formes de résistance ont été mis au point [2, 4]. L'ensemble de ces travaux ont également permis de distinguer deux phases différentes dans le développement de l'attaque : pénétration d'abord, puis extension du champignon dans les tissus de la plante dans un deuxième temps [5].

Malgré ces acquis importants, les travaux de génétique et d'amélioration du tournesol se heurtent à un certain nombre de difficultés : complexité du déterminisme génétique, difficultés de gestion des ressources génétiques, réduisant l'efficacité des méthodes traditionnelles d'amélioration des plantes, lourdeurs des tests devant être réalisés le plus souvent au champ, sur plantes adultes, avec contaminations artificielles. L'expression de la maladie est de plus très sensible aux conditions de milieu. L'ensemble de ces facteurs incite à développer des outils permettant de suivre l'introgression de certains caractères dans le matériel végétal utilisé. Des marqueurs susceptibles de permettre de s'affranchir d'un certain nombre de ces contraintes ont donc été développés. Dans un premier temps, des marqueurs morphologiques ou biochimiques (phénoliques, isoenzymes) ont été recherchés avec des résultats variables [6-9].

Partenariat et création de nouveaux outils moléculaires

La puissance des outils moléculaires et la simplification de leurs conditions d'emploi ont encouragé leur développement. Néanmoins, l'objectif de caractérisation de caractères quantitatifs à déterminisme génétique complexe nécessitait la construction d'une carte génétique. La possibilité de fédérer autour d'un même projet des partenaires issus des établissements publics de recherche, de sociétés semencières privées, et d'organismes de l'interprofession oléagineuse, ont permis de lancer un tel programme. Il avait pour objectif d'établir une carte génétique du tournesol, puis de l'utiliser pour mieux comprendre la génétique des résistances et mettre en évidence des marqueurs permettant une sélection assistée.

La première phase du programme (Cartisol I, 1990-1994) a regroupé l'Université de Clermont-Ferrand, l'INRA, le GEVES et seize sociétés semencières regroupées dans le cadre d'un GIE. Cette première phase, qui a donné lieu à une publication en 1995 [10], a été consacrée à la construction d'une carte RFLP (restriction fragment length polymorphism) du tournesol, comportant 237 locus répartis en 23 groupes de liaison dont 16 de plus de 20 cM (cM = centi Morgan = unité de distance des cartes génétiques) et qui couvre 1150 cM (le tournesol a 17 paires de chromosomes).

Les marqueurs moléculaires utilisés pour cette carte se sont aussi révélés utiles pour distinguer des lignées ou des hybrides [11-13]. Ils ont également permis de cartographier trois gènes de résistance au mildiou [14, 15] . Pour la deuxième phase de Cartisol (Cartisol II, 1994-1997), le partenariat s'est légèrement modifié, avec les retraits du GEVES et de quelques sociétés de semences, et l'arrivée du CETIOM. Cette deuxième phase a été orientée vers le marquage de locus de caractères quantitatifs (QTL : quantitative trait loci) de résistance à deux maladies importantes : le phomopsis et surtout Sclerotinia, tout en assurant la consolidation de la carte. Le programme a été conduit par un comité scientifique, qui rassemblait des représentants du GIE constitué par les semenciers, des deux laboratoires INRA impliqués, de l'Unité associée à l'INRA «Organisation et variabilité des génomes végétaux» de l'Université de Clermont-Ferrand, et du CETIOM. Chaque participant a contribué à la fois par un soutien financier et par la prise en charge d'expérimentations en laboratoire ou au champ selon les possibilités de chacun. L'INRA et le CETIOM ont cofinancé la thèse d'E. Bret-Mestries qui s'intègre également dans le programme. De plus, le ministère de l'Agriculture s'est joint au projet en participant au financement. Le coût total de cette deuxième phase s'élève à 5,8 millions de francs hors salaires publics.

Phomopsis

Un volet du programme, comparativement moins important que celui consacré à Sclerotinia, a été orienté vers la recherche de marqueurs de résistance au phomopsis (Diaporthe helianthi).

La stratégie de départ était basée sur l'hypothèse de déterminismes simples de chacune des deux sources de résistance travaillées, autorisant la recherche de marqueurs par comparaison de bulks (ensembles) sensibles et résistants pour chacun des deux croisements (LR2 résistante x HA89 sensible ; LR4 résistante x HA89 sensible). Les lignées résistantes utilisées dans les croisements étaient issues de croisements entre une lignée d'Helianthus annuus sensible au phomopsis et, soit une lignée d'Helianthus argophyllus, soit une lignée d'Helianthus tuberosus, sensées introduire la résistance. Les expérimentations au champ multilocales ont mis en évidence des phénomènes de transgression ne permettant pas de choisir les familles devant composer les bulks. La nouvelle stratégie développée a donc consisté à rechercher des marqueurs d'introgression de l'espèce sauvage ayant de bonnes chances de se révéler également des marqueurs de résistance [16]. Sept marqueurs d'introgression de Helianthus argophyllus semblent liés au phomopsis ; cependant ils ne rendent compte que d'un pourcentage faible de la variance génétique observée. D'autres lignées devront être utilisées pour valider ces premiers marqueurs. Par ailleurs, ce travail a permis de montrer que la résistance au phomopsis présente chez les espèces sauvages d'Helianthus n'est pas une fonction simple, contrairement à l'hypothèse de départ, et qu'elle s'apparente davantage à des caractères quantitatifs. Enfin la résistance prêtée à l'une des lignées étudiées ne provient pas d'Helianthus tuberosus mais bien également d'une introgression Helianthus argophyllus.

Sclerotinia

Les travaux sur Sclerotinia ont porté sur quatre croisements impliquant deux lignées sensibles et trois lignées résistantes soit à la pénétration, soit à l'extension du champignon dans les tissus de la plante, soit aux deux. Les extractions de l'ADN ont été réalisées sur les F2 et les tests pathologiques sur les familles F3 et F4.

Pour chacun des croisements, une carte génétique a été établie permettant de marquer 100 à 120 locus par croisement. Des cartes consensus ont ensuite été construites : une première sur les bases des croisements propres à Cartisol II, puis une seconde dite superconsensus, faisant la synthèse des travaux de cartographie réalisés dans les cadres de Cartisol I et Cartisol II. Cette carte super-consensus apparaît beaucoup plus complète que celle publiée précédemment [10]. Le nombre de groupes de liaison est réduit à 21 au lieu de 23, avec 17 groupes principaux qui correspondraient aux 17 paires de chromosomes. Les groupes 18 à 21 sont plus petits et n'ont pu être reliés à l'un des autres. La taille de cette nouvelle carte est en augmentation, de 1078 cM on passe à 1607 cM. Une quarantaine de nouveaux locus ont été identifiés, soit 279 au total pour la nouvelle carte. La carte est de qualité satisfaisante, les marqueurs couvrent de façon homogène le génome et la distance moyenne entre un gène et le marqueur le plus proche est estimée à 12 cM.

Il paraît très important de souligner à la fois l'ampleur des tests pathologiques qui ont été réalisés, mais également le fait que la portée des résultats et la réussite de l'ensemble dépendent de la qualité et de la précision de chacune de ces expérimentations et de leur caractère multilocal. Cela détermine la précision des QTL et donc la qualité de leur marquage, et évite également d'avoir des QTL peu fiables ou trop spécifiques d'un lieu. Les tests pathologiques au champ ont été réalisés sur 5 lieux par an pendant trois ans. Ont été mesurés systématiquement les caractères suivants : teneur en huile, poids de semences par capitule, date de floraison, pourcentage d'attaque et indice de latence à partir d'un test ascospore. Pour l'une des populations, la taille de la plante adulte a été mesurée. Enfin sur les deux sites clermontois ont également été réalisés un test de longueur de nécrose sur feuille et un test mycélium sur capitule. Au total, ce sont près de 110 000 tests pathologiques qui ont été réalisés sur les trois années d'expérimentation. Dans certaines situations, des notations complémentaires de sensibilité au Sclerotinia du collet et à Alternaria ont également été effectuées. L'analyse descriptive des données reccueillies est satisfaisante et montre des effets génotypiques nets pour l'ensemble des expérimentations. Les héritabilités des caractères sont importantes, y compris pour les caractères pour lesquels cela semblait peu probable a priori. Les interactions avec le milieu existent mais sont maîtrisées par les témoins. Il y a également une homogénéité de la qualité des données reccueillies entre années et entre sites qui facilite l'utilisation de ces résultats. La détection des QTL a pu être effectuée par trois méthodes différentes (ANOVA, interval mapping et régression de Kearsey), ce qui permet de mieux identifier les QTL les plus importants.

Bilan des résultats

Pour les caractères agronomiques généraux pris en compte, un groupe de liaison semble particulièrement important car porteur de QTL pour les quatre caractères (production de semence, teneur en huile, date de floraison et hauteur). Un groupe ne semble important que pour la teneur en huile et un autre que pour la précocité. Des marqueurs ont pu être associés à chacun de ces caractères. Des gènes de stérilité mâle et de ramification ont également été localisés.

En ce qui concerne les caractères de résistance à Sclerotinia, quatre groupes principaux de liaison sont impliqués pour tous les croisements étudiés et comportent des QTL associés à des marqueurs.

Il n'a pas été montré d'organisation par type d'organes (feuille ou capitule) ou par type de résistance (résistance à la pénétration / résistance à l'extension). Une zone qui se révèle comme QTL pour l'un des tests ou l'une des variables l'est également pour un autre test correspondant à une autre variable. Ce résultat est extrêmement important pour la connaissance générale que nous avons de la maladie. Il met en évidence la grande parenté des mécanismes qui conduisent à l'expression d'une résistance sur l'un ou l'autre des organes (feuille, bouton, capitule). De plus, il nuance l'hypothèse selon laquelle il convenait de distinguer les deux mécanismes de résistance (pénétration et extension dans les tissus). L'objectif des études à engager doit donc se tourner vers l'analyse des raisons pour lesquelles, malgré l'unité sous-jacente, on arrive à des résistances qui ne s'expriment pas toutes simultanément, ou à des expressions différentes selon les parties de la plante en cause.

En parallèle à l'identification des QTL, l'Unité associée à l'INRA «Organisation et variabilité des génomes végétaux» de l'Université de Clermont-Ferrand a développé une approche gènes candidats pour la résistance aux maladies. Cette approche repose sur l'hypothèse que des QTL pourraient correspondre à des allèles de gènes majeurs, et qu'il faut donc rechercher des colocalisations de QTL et de gènes susceptibles d'intervenir dans le contrôle du caractère quantitatif étudié. Par exemple, sur maïs il a pu être mis en évidence une colocalisation d'un QTL de taille et d'un gène de nanisme. Des séquences homologues à des gènes connus ont été clonées et localisées sur la carte. Il s'agit, pour la plupart, de gènes codant pour des protéines voisines ou similaires à celles qui sont connues comme intervenant soit dans les réactions de défense des végétaux vis-à-vis de pathogènes, soit dans des résistances à contrôle monogénique étudiées chez d'autres espèces. Sur l'un des groupes de liaison, on a pu mettre en évidence des colocalisations entre certaines des séquences homologues et soit des QTL de résistance à Sclerotinia, soit des locus de résistance au mildiou. Les résultats de cette partie du travail ont d'abord fait l'objet d'un dépôt de brevet au début de l'année 1997, pour permettre une publication rapide, tout en préservant les intérêts des différents participants au programme. Ils constituent l'un des points les plus positifs du programme et encourage l'équipe scientifique concernée à poursuivre cette approche.

Perspectives

Outre des résultats scientifiques importants qui ont fait ou feront l'objet de publications et d'un brevet, ce programme a permis de développer des outils importants pour les organismes publics comme pour les sociétés de semences qu'aucun d'entre eux n'aurait eu les moyens de développer seul. Ces outils sont constitués à la fois par des sondes RFLP marqueurs d'un certain nombre de caractères, et par une carte génétique qui peut être complétée ou utilisée pour marquer d'autres caractères. Ils permettent ensuite à chacun de développer, seul ou en association, des méthodes, des utilisations ou des recherches différentes. Les sociétés de semences regroupées au sein du GIE ont estimé qu'elles étaient très satisfaites des résultats obtenus et que, de ce fait, la phase pré-compétitive de la recherche était terminée. Elles souhaitent donc maintenant développer une valorisation privée de ces acquis. Il s'agit ici d'un bon indicateur du succès général du programme Cartisol. Elles vont développer des marqueurs de caractères agronomiques et de résistance aux maladies leur permettant de faire de la sélection ou de la gestion de ressources génétiques assistées par marqueurs. Par ailleurs, ces mêmes sociétés de semences ont décidé de maintenir la structure du GIE pour préparer de nouveaux marqueurs de type microsatellites susceptibles de venir compléter la carte RFLP, et de développer de nouveaux débouchés. Parmi les applications possibles figure la possibilité de caractériser finement des matériels végétaux et de répondre aux contraintes juridiques et de droits de propriété, liées au développement des variétés essentiellement dérivées. Certaines sociétés ont également développé, sur la base de l'une des cartes Cartisol I ou consensus Cartisol I et II, des marqueurs complémentaires propres [17]. Cela leur a parfois permis de faire le lien avec d'autres cartes génétiques publiées [18,19]. Enfin, il faut mentionner que la plupart des sociétés privées cherchent des marqueurs capables de se substituer aux sondes RFLP, de façon à s'affranchir des contraintes liées à l'emploi de sondes chaudes pour des utilisations de routine (contrôles d'introgression d'un caractère d'intérêt par exemple).

De leur côté, les équipes de la recherche publique optent pour la poursuite de la compréhension des mécanismes génétiques de résistance aux maladies. Cela passe, selon les sujets, par des densifications de la carte par marqueurs AFLP (amplified fragment length polymorphism) ou des constructions de cartes complémentaires, en particulier sur les espèces sauvages. Ces nouveaux marqueurs AFLP sont très puissants, bien adaptés aux densifications de carte. Pour Sclerotinia, de nouveaux croisements vont être travaillés pour consolider et préciser les QTL identifiés, en trouver d'autres. Le choix des parents sera en particulier orienté de façon à être capable d'identifier des QTL de résistance au phomopsis. La démarche complémentaire par gènes candidats sera également poursuivie.

La construction de cartes génétiques et la recherche de marqueurs moléculaires de caractères quantitatifs sont des approches nouvelles en amélioration des plantes depuis le début des années 90, qui offrent d'importantes possibilités aussi bien aux niveaux de la recherche que des applications. Le travail réalisé dans le cadre du programme Cartisol a été le premier de ce type sur tournesol. Il permet à la fois d'enrichir notre connaissance fondamentale sur la génétique de la résistance à différentes maladies, et met aussi à disposition des sélectionneurs des outils puissants d'aides à la sélection dont il conviendra de poursuivre l'amélioration et le développement.

Infection d'un tournesol par une suspension d'ascospores de Sclerotinia sclerotiorum (photo INRA, Clermont-Ferrand).

Note

1. Voir Nicolas P, Gintzbittell L, Vear F, Bervillé A, Pinochet X. La carte génétique du tournesol : le programme Cartisol. OCL 1,2 : 89-91.

REFERENCES

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