ARTICLE
Impact du mildiou du tournesol en France
Depuis le début des années 50, la culture du tournesol
en France a connu une progression constante. Cependant, son essor s'est
vu menacé par l'apparition du mildiou en 1966 puis de ses nouvelles
races à partir de 1988 [1]. Le traitement des semences d'hybrides
de tournesol a alors été rendu obligatoire. Des variétés
résistantes aux nouvelles races de mildiou ont par la suite été
créées, ce qui a permis de réserver le traitement
des semences aux variétés sensibles et ainsi de limiter
la pression de sélection sur le parasite. Cependant, le traitement
effectué de façon quasi exclusive avec du métalaxyl
sur ces variétés a provoqué l'apparition de souches
de mildiou résistantes à ce produit en proportions alarmantes
: jusqu'à 80 % des isolats analysés en 1999 (source : SRPV
Midi-Pyrénées). Un fongicide de contact a donc été
autorisé en association avec le métalaxyl.
La présence diffuse de la maladie provoque des pertes souvent
discrètes au niveau des cultures, mais a un impact économique
non négligeable du fait des coûts dus aux traitements, à
l'amélioration variétale et à la surveillance des
cultures [2]. Ceci pourrait remettre en cause l'intérêt de
la production de tournesol. Face aux nouvelles races, à d'autres
pathotypes existant dans les pays tiers (Europe, Amérique, Afrique
du Nord) et à un risque de voir s'étendre le phénomène
de résistance aux anti-mildious, il est indispensable de disposer
d'une méthode rapide permettant de diagnostiquer la présence
de mildiou dans les lots de semences, et ainsi de limiter l'introduction
de nouveaux pathotypes et la circulation des semences contaminées.
Cette technique pourra également servir de méthodologie
pour des certificats sanitaires à l'exportation.
Mise au point du diagnostic moléculaire
Pour répondre à ce besoin, au sein de l'UMR (Unité
mixte de recherche) « Amélioration et Santé des plantes
» de Clermont-Ferrand, nous avons élaboré un test de
diagnostic moléculaire de la présence de mildiou dans les
semences de tournesol.
Plusieurs méthodes d'extraction de l'ADN (contenu dans 300 à
500 mg de graines broyées finement) ont été comparées
afin de déterminer celle qui permet d'obtenir le meilleur compromis
entre rendement et qualité de l'ADN. Il faut, en effet, se mettre
dans les meilleures conditions pour mettre en évidence l'ADN du
parasite, présent en faible quantité par rapport à
celui de la semence.
Après extraction de l'ADN avec un protocole dérivé
de celui décrit par Dellaporta et al. [3] et faisant intervenir
une résine de purification (Amersham RPN 8511), une amplification
par PCR est réalisée avec des amorces spécifiques
du mildiou du tournesol (Plasmopara halstedii) [4]. Après
30 cycles, le produit d'amplification est déposé sur un
gel d'agarose et soumis à une électrophorèse qui
sépare les fragments présents dans l'amplifiat. Le gel est
ensuite observé sous UV, après coloration au bromure d'éthidium.
Graines entières
Le protocole décrit précédemment a été
appliqué sur des lots de graines contaminées.
La contamination de ces graines a été avérée
au préalable par observation en microscopie optique selon le protocole
indiqué dans l'encadré.
La photo 1 montre que la bande spécifique du mildiou (taille
de l'ordre de 1kb) est présente dans tous les lots de graines contaminées,
notés GM. Elle est absente, en revanche, de l'extrait de feuilles
saines de tournesol (TF) ainsi que du lot de graines saines (GT).
Le deuxième fragment de l'ordre de 400 pb, visible sur la photo,
est spécifique de tournesol : en effet, afin d'avoir un témoin
interne d'amplification pouvant révéler une éventuelle
inhibition de la réaction, nous avons ajouté un couple d'amorces
spécifiques de la plante dans chaque réaction.
Sur ces lots, la contamination variait de 70 à 100 %. D'autres
travaux réalisés sur 23 lots, contenant 0, 1, 10, 50 et
100 % de graines issues de plantes présentant des symptômes
de mildiou, nous ont permis de montrer que le seuil de détection
est de 10 % de graines dites contaminées. Mais il faut noter que
toutes les graines provenant d'une plante avec symptômes ne contiennent
pas nécessairement le parasite.
Graines décortiquées
Pour vérifier l'efficacité de ce protocole, nous avons
également testé cette méthode sur des lots de graines
contaminées décortiquées. Le décortiquage
a été réalisé mécaniquement dans un
appareil Techmachine. Le choc subi par la graine entraîne la cassure
du péricarpe mais aussi une fragmentation de l'amande. Deux fractions
ont donc été récupérées, d'une part,
les coques libres (C) et, d'autre part, le mélange fines + amandes
(F) constitué d'amandes brisées ou non et de fragments du
tégument interne du péricarpe. L'ADN a été
extrait de ces deux types de fractions, puis amplifié et soumis
à électrophorèse, de la même manière
que précédemment.
Comme le montre la photo 2, le fragment spécifique du
mildiou apparaît avec une intensité variable selon les échantillons,
mais il est présent dans tous et notamment toujours dans les coques
(C). Le fait que nous mettions en évidence la présence de
mildiou dans la fraction fines + amandes ne remet pas en cause les résultats
publiés précédemment [5] selon lesquels le mycélium
n'est pas présent dans l'amande. L'ADN de mildiou amplifié
dans cette fraction provient probablement du tégument interne obtenu
en mélange avec les amandes.
Perspectives
La détection constante du mildiou dans les coques est une donnée
qui sera utile pour la mise au point de l'échantillonnage, nécessaire
à la détection dans des lots de semences de grand volume.
L'extraction d'ADN pourra, en effet, être conduite uniquement sur
les coques, ce qui permettra, à poids d'échantillon constant,
d'analyser un plus grand nombre de graines.
CONCLUSION
Remerciements
Nous remercions le GNIS (Groupement national interprofessionnel des
semences et plants) pour son soutien financier.
REFERENCES
1. PENAUD A, LAFON S, TOURVIEILLE J (2000). Les enjeux, Plus de
trente ans de mildiou en France. In : TOURVIEILLE DE LABROUHE D, PILORGÉ
E, NICOLAS P, VEAR F, eds. Le mildiou du tournesol. Cetiom et Inra
éditions : 23-9.
2. JOUFFRET P, PILORGÉ E, PINOCHET X (2000). Les enjeux,
nuisibilité et enjeux économiques du mildiou du tournesol
en France. In : TOURVIEILLE DE LABROUHE D, PILORGÉ E, NICOLAS P,
VEAR F, eds. Le mildiou du tournesol. Cetiom et Inra éditions
: 31-5.
3. DELLAPORTA SL, WOOD J, HICKS JB (1983). A plant DNA minipreparation
: version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1: 19-21.
4. ROECKEL-DREVET P, TOURVIEILLE J, DREVET JR, SAYS-LESAGE V, NICOLAS
P, TOURVIEILLE DE LABROUHE D (1999). Development of a polymerase chain
reaction test for the detection of the pathogen Plasmopara halstedii
in sunflower. Can J Microbiol, 45 : 797-803.
5. MELIALA C, VEAR F, TOURVIEILLE DE LABROUHE D (1999). Relation
between date of infection of sunflower downy mildew (Plasmopara halstedii)
and symptoms development. Helia, 23 : 35-44.
|
Version imprimable
