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Ces lignes directrices doivent permettre d'évaluer la sécurité
d'emploi en alimentation humaine d'OGM et de produits qui en sont issus
en application du Règlement européen 258/97 sur les nouveaux
aliments et nouveaux ingrédients alimentaires, dans le cas de la
procédure d'autorisation. Ces lignes directrices ne concernent
donc pas le champ couvert par la Directive 90/220 sur la dissémination
des OGM et les risques de l'environnement et l'écosystème.
Les lignes directrices concernent les plantes transgéniques et
plus particulièrement les produits alimentaires qui en sont issus.
Le principe retenu est celui d'une évaluation au cas par cas.
Outre les informations requises sur la nature du nouvel aliment, les
usages qui en sont prévus, l'objet de la modification génétique,
les transformations technologiques conduisant au nouveau produit alimentaire
et tout élément d'information prévu par le Règlement
258-97, il est convenu que l'évaluation de la sécurité
en alimentation humaine des OGM et de leurs produits se fasse en quatre
étapes principales :
1. Analyse de la construction génétique
2. Analyse et caractérisation physicochimique, fonctionnelle
et toxicologique des produits d'expression des transgènes.
3. Valeur nutritionnelle et équivalence en substance.
4. Identification et évaluation des effets éventuels non
intentionnels et inattendus de la construction génétique.
À chaque étape, les résultats fournis (analyses,
tests de toxicité ou de tolérance) devront avoir été
obtenus par des laboratoires respectant, dans le cadre d'un plan assurance
qualité, les bonnes pratiques de laboratoire et par des méthodes
reconnues et validées (par exemple selon les protocoles standardisés
de l'OCDE).
1. Analyse de la construction génétique
1.1. But et objectifs recherchés par la nouvelle construction,
techniques de transfert utilisées.
1.2. Séquences nucléotidiques transférées
:
Origine, nature, fonctions et caractérisation des séquences.
Mécanisme prévu, séquences de régulation,
d'adressage.
Utilisation de gènes marqueurs.
1.3. Insertion des transgènes :
Nombre d'insertions, stabilité sur plusieurs générations.
Spécificité de l'expression des gènes introduits
dans certains tissus ou organes.
Identité des séquences nucléotidiques par rapport
aux séquences d'origine.
1.4. Possibilité de transfert de gènes à la microflore
digestive de l'homme.
1.5. Évaluation des gènes marqueurs :
Origine, promoteurs, produits pour lesquels ils codent.
Méthodes d'analyse et quantification.
Effets toxiques potentiels.
Potentiel de transfert aux microorganismes du tractus digestif.
1.6. Méthodes d'analyse et d'identification en vue d'assurer
la traçabilité de l'ensemble des séquences d'ADN
transférées : connaissance des amorces pour la mise en œuvre
des techniques de PCR.
2. Analyse et caractérisation des produits
d'expression
Deux cas sont à distinguer :
A. Il n'y a pas de produit d'expression nouveau : en faire la preuve
et passer aux étapes III et IV.
B. De nouvelles protéines sont exprimées dans l'OGM.
2.1. Fonction et historique de la protéine :
Origine, caractéristiques, variabilité (isoformes).
Activité enzymatique, spécificité, substrats.
2.2. Méthodes de dosage :
Immunochimie (préciser la nature des anticorps utilisés).
Utilisation éventuelle d'isotopes stables.
Activité et définition des unités utilisées.
2.3. Caractérisation de la protéine exprimée par
rapport à la protéine d'origine :
Soit par séquençage (comparaison à la séquence
attendue à partir de la séquence nucléotidique),
Soit par spectrométrie de masse.
2.4. Expression de la nouvelle protéine dans la plante :
Niveaux quantitatifs et lieux d'expression.
Aspects cinétiques : expression au cours du cycle de la plante,
mouvements et métabolisation dans la plante.
Identification des produits de catabolisme.
2.5. Production de protéine recombinante en vue des essais toxicologiques.
On préfèrera la production de la protéine recombinante
à partir d'un microorganisme recombiné plutôt que
de chercher à extraire et à purifier la protéine
à partir de la plante. Toutefois il y a lieu, dans ce cas, de vérifier
l'identité de la protéine recombinante produite par voie
microbiologique (problèmes de régulation post-traductionnelle
: glycosylation...).
2.6. Évaluation toxicologique des nouvelles protéines
2.6.1. Toxicité in vivo : essais de toxicité sur
90 jours sur jeunes rats en croissance avec incorporation de la protéine
à 3 doses dont la plus forte visera à couvrir une part la
plus élevée possible de l'apport protéique normal
du régime dont le taux protéique ne dépassera pas
15 %. Les régimes devront être correctement équilibrés
nutritionnellement. Un rééquilibrage en acides aminés
essentiels pourra s'avérer indispensable.
On exclura les tests de toxicité aiguë et les tests de longue
durée (2 ans).
2.6.2. Potentiel génotoxique : cette approche toxicologique n'a
réellement de sens que si l'on suspecte la présence d'impuretés
associées ; on pourra procéder à deux tests de génotoxicité
dont un de clastogénicité.
2.7. Essais de dégradabilité et de toxicocinétique
2.7.1. Tests de dégradabilité en présence de protéases
gastro-intestinales : utilisation du modèle pepsine à pH
2, puis enzymes pancréatiques (typsine) à pH 7.
2.7.2. Tests de toxicocinétique : suivi, par des anticorps polyclonaux
de la protéine ou de des produits d'hydrolyse, au cours de la digestion,
de l'absorption, dans le sang ; fournir la méthode d'analyse, préciser
la nature des anticorps : on préfèrera des anticorps polyclonaux
à des monoclonaux trop spécifiques.
L'ensemble de ces données (2.7.1 et 2.7.2) servira à documenter
et argumenter les dossiers, mais faute de méthodes réellement
validées, ces résultats ne peuvent donner lieu à
des arguments sécuritaires définitifs.
2.8. Allergénicité
2.8.1. Informations sur les facteurs indicateurs du potentiel allergène
:
- poids moléculaire, glycosylation ;
- recherche d'homologies ou de similitudes de séquences (8 acides
aminés consécutifs identiques) ou de structures (si elles
sont connues) ;
- stabilité à la chaleur, sensibilité au pH ;
- dégradabilité par les protéases gastro-intestinales
ou apparition de peptides allergènes ;
- concentrations plasmatiques détectables.
2.8.2. Nature allergique des organismes donneurs ou receveurs.
2.8.3. Allergovigilance (sur les sites de production et de transformation).
En l'absence de méthodes validées et standardisées,
toute approche méthodologique nouvelle peut contribuer à
documenter le risque allergique du nouveau produit.
2.9. Devenir des nouvelles protéines au cours des traitements
technologiques de transformation de ces nouveaux aliments.
3. Valeur nutritionnelle et équivalence
en substance
3.1. Composition de la plante génétiquement modifiée
et des produits alimentaires qui en sont issus en macro et micronutriments.
Cette composition devra être établie selon des méthodes
d'analyse validées et standardisées, garantissant la reproductibilité
des résultats ; argumenter le nombre d'essais et de répétitions
des essais et le mode d'échantillonnage pour obtenir des résultats
significatifs et produire une analyse statistique approfondie.
Les analyses porteront non sur la plante entière mais plutôt
sur les différentes parties qui sont susceptibles d'être
consommées et les produits qui en sont issus après transformation.
Le recours à des méthodes globales (spectrométrie
de masse, pyrolyse couplée à la spectrométrie IR)
peut être intéressant pour argumenter de l'équivalence
en substance.
3.2. Composition en facteurs antinutritionnels et toxiques intrinsèques,
caractéristiques de la famille des plantes considérées
et en métabolites secondaires. Préciser les méthodes
d'extraction et d'analyse.
NB pour 3.1 et 3.2 : Fournir des résultats obtenus sur
des plantes traitées ou non (cas de résistance à
des produits phytosanitaires de type herbicides ou insecticides).
3.3. Disponibilité des nutriments (informations souhaitables
mais non obligatoires) ; effets de la conservation (stockage) et de la
cuisson.
3.4. Effets de traitements technologiques de transformation (informations
souhaitables mais non obligatoires) : recherche et analyse de composés
néoformés à potentiel toxique.
3.5. Prévision des niveaux de consommation et des modifications
éventuelles des habitudes alimentaires.
3.6. Conclusion sur l'équivalence en substance.
4. Recherche d'effets non intentionnels et inattendus
4.1. Plusieurs approches analytiques sont possibles
mais aucune n'est validée :
- empreinte génétique (ADN ou ARNm) ;
- empreinte métabolique (protéines, métabolites
circulants, acides aminés libres...) ;
- composés antinutritionnels ou toxiques ;
- métabolites secondaires ;
- tests de toxicité in vitro en culture de cellules.
4.2. Tests de tolérance sur les produits alimentaires
issus d'OGM.
Ces tests diffèrent d'une étude toxicologique classique
puisqu'ils sont réalisés sur des aliments (OGM ou produits
issus d'OGM éventuellement après transformation technologique).
- Espèce : rat en croissance sauf si le rat s'avère intolérant
au produit testé ; dans ce cas, valider sur une autre espèce
après un pré-essai.
- Dose testée : la plus élevée possible compatible
avec le respect de l'équilibre nutritionnel du régime.
- Étude de la biotransformation du produit : digestion, absorption.
- Recherche de signes de toxicité, de modifications de comportement,
anatomopathologie,
- Durée : 90 jours.
4.3. Essais zootechniques réalisés sur monogastriques
ou ruminants et évaluation de paramètres de performances
zootechniques. Les informations sont utiles mais non obligatoires ; elles
peuvent être disponibles dans le cas de produits et co-produits
qui trouvent également une application en alimentation animale.
Remarques générales
Les lignes directrices, révisables, constituent, en l'état
actuel des connaissances scientifiques, un ensemble de recommandations
qui permettent de hiérarchiser les informations nécessaires
à l'évaluation de la sécurité des OGM ou des
produits qui en sont issus en alimentation humaine.
Certaines de ces recommandations revêtent un caractère
obligatoire :
- l'analyse de la construction génétique (étape
1) ;
- la caractérisation des produits d'expression (étapes
2-1 à 2-4) et l'évaluation de leur innocuité (étapes
2-5 à 2-6) ;
- l'analyse de la composition en nutriments, en métabolites,
en facteurs toxiques et antinutritionnels dans le nouvel aliment (OGM
ou produit issu d'OGM) (étapes 3-1, 3-2) ;
- l'évaluation de la sécurité par un test de tolérance
à 90 jours sur les produits finis destinés à la consommation,
test éventuellement remplacé par des essais zootechniques,
si les résultats sont disponibles (étapes 4-2 ou 4-3).
D'autres informations se révèlent utiles et souhaitables
mais non obligatoires dans la mesure où les méthodes ne
sont pas validées : elles ne peuvent donc conduire à des
arguments sécuritaires définitifs. Cependant, toute approche
méthodologique peut être retenue dans la mesure où
elle permet de documenter et d'argumenter un dossier sur un nouveau produit.
Enfin, on retient le principe d'une évaluation au cas par cas.
Néanmoins, certaines étapes de l'évaluation peuvent
être communes à plusieurs produits. Ainsi, l'analyse de la
construction génétique (étape 1) et la caractérisation
des produits d'expression (étape 2) peuvent faire l'objet d'une
évaluation commune à plusieurs produits qui sont issus de
la même plante génétiquement modifiée. Dans
ce cas, l'évaluation au cas par cas portera plus spécifiquement
sur les niveaux résiduels des produits d'expression (étape
2-4) et sur les étapes 3 et 4 (composition, équivalence
en substance, test de tolérance) pour chacun des groupes génériques
des produits transformés. *
Remerciements
Ce protocole d'évaluation a été élaboré
par un groupe de travail présidé par P. Besançon
et comprenant Mmes C. Gloaguen, D. Parent - MM. J. Guillemain, Guillot,
F. Hervieu, P. Joudrier, G. Pascal et J.-M. Wal.
Il a été approuvé par la Section de l'Alimentation
et de la Nutrition du Conseil supérieur d'Hygiène publique
de France, le 12 janvier 1999.
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